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Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 803 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Erwartungen an die Transplantation neuronaler Stamm-/Vorläuferzellen (NS/PC) zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen (SCI) steigen. Ob und wie transplantierte Zellen jedoch in den neuronalen Schaltkreis des Wirts eingebaut werden und zur Wiederherstellung der motorischen Funktion beitragen, bleibt jedoch unbekannt. Das Ziel dieses Projekts bestand darin, ein neuartiges nicht-invasives In-vivo-Bildgebungssystem zur Visualisierung der Aktivität neuronaler Transplantate zu etablieren, mit dem wir gleichzeitig die Integration zwischen Transplantat und Wirt auf Schaltkreisebene und den Beitrag der neuronalen Aktivität des Transplantats zum Wirtsverhalten demonstrieren können . Wir haben Akaluc, eine neu entwickelte Luciferase, unter der Kontrolle des Enhanced Synaptic Activity-Responsive Element (E-SARE), einem starken neuronalen aktivitätsabhängigen synthetischen Promotor, in NS/PCs eingeführt und die Zellen in SCI-Modellmäuse transplantiert. Mithilfe dieses Systems haben wir herausgefunden, dass die Aktivität transplantierter Zellen in das Verhalten des Wirts integriert und durch Eingaben in die neuronalen Schaltkreise des Wirts gesteuert wird. Dieses nicht-invasive System soll dazu beitragen, den therapeutischen Mechanismus der Zelltransplantationsbehandlung bei Rückenmarksverletzungen aufzuklären.

Eine Rückenmarksverletzung (SCI) führt zu schweren neurologischen Funktionsstörungen, einschließlich motorischer, sensorischer und autonomer Lähmungen. In den letzten Jahren wurden viele Versuche unternommen, Zelltransplantationstherapien zu entwickeln, um die Regeneration des geschädigten Rückenmarks zu fördern. Neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NS/PCs) gehören zu den vielversprechendsten Ressourcen für solche Therapien1,2,3. Mehrere mutmaßliche zugrunde liegende Mechanismen wurden vorgeschlagen, darunter der Zellersatz durch transplantierte NS/PC-abgeleitete Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten; trophische Unterstützung; und axonale Remyelinisierung4,5,6. Darüber hinaus haben mehrere Studien vorgeschlagen, dass NS/PC-Transplantate neuronale Relais über Stellen der Wirbelsäulendurchtrennung bilden können7,8,9, d. h. den Input vom rostralen Teil des Wirts zum Transplantat und den Output vom Transplantat zum kaudalen Teil kombinieren; Es wird angenommen, dass diese Prozesse eine wichtige Rolle bei der funktionellen Wiederherstellung spielen. Eine detaillierte Charakterisierung der neuronalen Weiterleitung wurde jedoch nicht durchgeführt, und es ist kaum bekannt, wie das Transplantat funktionell in den neuronalen Schaltkreis des Wirts integriert wird. Dies liegt hauptsächlich daran, dass keine aktuellen Technologien die Beziehungen zwischen der Transplantatzellaktivität und den Verhaltensweisen und Aktivitäten des Wirts auf Schaltkreisebene direkt überwachen können. Um die funktionelle Wirt-Transplantat-Koordination aufzuklären und zu bewerten, wie das Transplantat die Aktivität des neuronalen Schaltkreises und das Wirtsverhalten des Wirts beeinflusst, ist eine neuartige nicht-invasive In-vivo-Bildgebungstechnik zur Überwachung der Aktivität von Transplantatneuronen im lebenden Wirt über die Zeit erforderlich.

Um ein solches In-vivo-Überwachungssystem zu realisieren, haben wir uns auf zwei neuartige Technologien konzentriert. Das erste war das AkaBLI-System (eine Kombination aus dem AkaLuc-Enzym und AkaLumine-HCl als Substrat mit hoher Permeabilität)10,11. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ist eine nicht-invasive Methode zur Messung der Lichtabgabe von Zellen, die das Enzym Luciferase nach der Verabreichung von Luciferin (Substrat) an lebende Tiere exprimieren12. AkaBLI ist ein neu entwickeltes rotverschobenes BLI-System, das helle Emissionsspektren erzeugt und eine Tiefengewebebildgebung bei lebenden Tieren ermöglicht10, was sich am besten für die nicht-invasive Weitfeldüberwachung der Genexpression von Transplantatzellen im verletzten Rückenmark eignet. Das zweite war das Enhanced Synaptic Activity-Responsive Element (E-SARE), ein potenter neuronaler aktivitätsabhängiger synthetischer Promotor13. Wenn ein Neuron aktiv wird, schaltet es Immediate-Early-Gene (IEGs) wie Fos, Arc und Egr1 ein, sogar in Rückenmarksneuronen, und die Promotoren/Enhancer von IEGs werden als aktivitätsabhängige Reportersysteme verwendet14,15. Zu diesen Promotoren gehört der synthetische Promotor E-SARE, der auf dem SARE-Enhancer-Element des Arc-Promotors basiert und eine von der neuronalen Aktivität abhängige Genexpression antreibt, die derjenigen aller anderen existierenden IEG-Promotoren deutlich überlegen ist.

In dieser Studie haben wir die AkaBLI- und E-SARE-Technologie kombiniert und ein neuartiges nicht-invasives System zur Visualisierung der neuronalen Aktivität des Transplantats in vivo entwickelt. Es ist uns gelungen, die aktive Ensembledynamik von NS/PC-abgeleiteten Zellen abzubilden, die in verletzte Rückenmarks transplantiert wurden. Mithilfe dieses Systems haben wir bestätigt, dass die Transplantataktivität mit dem Verhalten des Wirts zusammenhängt und dass der Wirtskreislauf die Transplantataktivität reguliert.

Um ein auf Biolumineszenz basierendes System zur Visualisierung der neuronalen Aktivität zu etablieren, konstruierten wir zunächst einen lentiviralen Vektor für die Expression von AkaLuc, einer für rotverschobene Biolumineszenz optimierten Luciferase, unter der Kontrolle von E-SARE, einem starken, von der neuronalen Aktivität abhängigen Promotor, der aus Arc-Enhancer generiert wird Elemente (Abb. 1a). Wir haben dieses System ESAL (E-SARE-AkaLuc) genannt. Im ESAL-System haben wir AkaLuc außerdem mit dem Venus-Protein zur gleichzeitigen Fluoreszenzmarkierung und mit der PEST-Sequenz fusioniert, um die Halbwertszeit des Fusionsproteins zu verkürzen16. Das Venus-Protein ist eine aus Aequorea victoria stammende, gelb fluoreszierende Protein (YFP) enthaltende Mutation, die eine schnelle Reifung und eine erhöhte Umweltresistenz verursacht17. Anschließend transfizierten wir den lentiviralen ESAL-Vektor in NS/PCs, die aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stammen, identifiziert als ESAL-NS/PCs, und induzierten die Differenzierung der Zellen in Neuronen (Abb. 1b – h). Bei Stimulation durch eine depolarisierende Konzentration von Kaliumchlorid (50 mM) zeigten von ESAL-NS/PC abgeleitete Neuronen im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen einen signifikanten Anstieg der AkaLuc-Photonenzahlen (Abb. 1b, c). Wir stellten auch einen Anstieg der Venus-Fluoreszenz und der IEG-Expression bei 50 mM KCl-Stimulation fest (Abb. 1d, e). Somit haben wir bestätigt, dass das ESAL-System sehr empfindlich auf depolarisierende Stimulation in Neuronen reagiert, in nicht-neuronalen Zellen jedoch nur eine geringe Reaktion zeigt (Abb. 1f – h). Diese Daten legen nahe, dass das ESAL-System zur erfolgreichen Überwachung der neuronalen Aktivität von NS/PC-abgeleiteten Neuronen eingesetzt werden kann.

a Schematische Darstellung des E-SARE-Venus-AkaLuc (ESAL)-Konstrukts, das zur Expression des Venus-fusionierten AkaLuc-Lumineszenzenzyms unter der Kontrolle des Promotors E-SARE verwendet wurde. Wenn ein Neuron aktiviert wurde, führte der Promotor E-SARE zu einer hohen Expression des nachgeschalteten Reportergens Venus-AkaLuc. b Vergleichende Biolumineszenzbildgebung (BLI) von in vitro kultivierten Zellen, die 6 Stunden lang mit 50 mM KCl stimuliert wurden (rechts, n = 4) oder ohne Stimulation (links, n = 4), links. Wir haben n = 8 Vertiefungen aus zwei unabhängigen tertiären Neurosphären desselben Embryoidkörpers (EB) vorbereitet. Die Farbe der Balken gibt die gesamte Biolumineszenzstrahlung an (Photonen/Sek./cm2/str). Der Steradiant (str) ist die Einheit des Raumwinkels. c Quantitative Analysen der relativen BLI-Signalintensität von ESAL-NS/PC-abgeleiteten Zellen mit oder ohne Zusatz von 50 mM KCl in vitro (jeweils n = 4). Die Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM): **p < 0,01. Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test durchgeführt. T-Wert und Freiheitsgrade: t (6) = 11,59, p = 2,5 × 10−5. d Mikroskopisches Hellfeldbild und Venus-Fluoreszenzbild von ESAL-NS/PC-abgeleiteten Zellen mit oder ohne Zusatz von 50 mM KCl in vitro. Maßstabsbalken, 50 μm. e Die Ergebnisse von qPCR-Analysen der Genexpression von Venus, ARC und FOS in Zellen innerhalb derselben Vertiefung, wie oben gezeigt (jeweils n = 4). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p < 0,05, **p < 0,01. Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test durchgeführt. Einzelne t-Werte und Freiheitsgrade: Venus t(6) = 3,034, p = 0,023. Bogen t(6) = 2,705, p = 0,035. Fos t(6) = 7,057, p = 4,1 × 10−4. f, g Repräsentative Bilder von Venus-exprimierenden differenzierten Zellen aus NS/PCs, gefärbt auf panembryonale letale abnormale visionsähnliche (pan-ELAVL) (Neuronen) mit oder ohne Zusatz von 50 mM KCl (f); gefärbt auf humanes fibrilläres saures Glia-Protein (GFAP) (Astrozyten), 2′, 3′-zyklische Nukleotid-3′-Phosphodiesterase (CNPase) (Oligodendrozyten), Nestin und Ki-67 (unreife Zellen) unter Zusatz von 50 mM KCl (g). Maßstabsbalken, 20 μm. h Prozentsatz der Zellen, die unter den Venus+-Zellen nach Stimulation mit 50 mM KCl positiv für zelltypspezifische Marker sind.

Um die zeitliche Auflösung des ESAL-Systems zu profilieren, untersuchten wir den zeitlichen Verlauf der Biolumineszenz nach einer kurzen neuronalen Stimulation (4-Amynopyridin [4AP] + Bicucullin [BIC]), die das Auslösen des Aktionspotentials erleichtert und die glutamaterge Übertragung verstärkt (ergänzende Abb. 1a). Die von der neuronalen Aktivität abhängige Biolumineszenz wurde ungefähr 4 Stunden nach der Stimulation festgestellt, erreichte ihren Höhepunkt nach 6 Stunden und kehrte nach 24 Stunden auf das Grundniveau zurück (ergänzende Abbildung 1b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Anstieg der Biolumineszenz im ESAL-System die kumulative neuronale Aktivität widerspiegelt, die über einen Zeitraum von 4 bis 10 Stunden vor der gemessenen BLI-Messung anhielt.

Als nächstes wurden NOD/ShiJic-scidJcl (NOD-SCID)-Mäuse einer Durchtrennung der C5-Rückensäule auf Wirbelsäulenebene und 9 Tage nach der Verletzung einer Transplantation unterzogen. Wir hielten die Wirtsumgebung zu diesem Zeitpunkt für am besten für eine Transplantation geeignet, da die akute Entzündung nach SCI abgeklungen ist und die Glia-Narbenbildung noch nicht abgeschlossen ist18,19,20,21. ESAL-NS/PCs wurden in die Verletzungsstellen transplantiert (Abb. 2a, f). Wir fanden heraus, dass sich die durch das Körpergewicht normalisierte Griffstärke und der IBB-Score in der TP-Gruppe deutlich stärker verbessert hatten als in der PBS-Gruppe (ergänzende Abbildung 2a, b). Bei der Fehlerrate für den horizontalen Leitertest wurden jedoch keine signifikanten Änderungen im Zusammenhang mit der Wiederherstellung festgestellt (ergänzende Abbildung 2c).

a Schematische Darstellung der Positivkontrollmäuse. Die Transplantation von NS/PCs, die mit den beiden Viren doppelt infiziert waren (CAG-hM3Dq-mCherry, das ein hM3Dq- und mCherry-Fusionsprotein enthält, und ESAL wurden über Lentivirus in NS/PCs transduziert), wurde 9 Tage nach der Durchtrennung der C5-Rückensäule durchgeführt. Sechs Wochen nach der Transplantation wurden vor der Tötung Lumineszenzmessungen durchgeführt. b Vergleich der Verhältnisse der BLI-Signalintensität (7 h nach CNO/prä-CNO) zwischen ESAL-exprimierenden NS/PC-transplantierten (ESAL-NS/PC-transplantierten) Mäusen (hM3Dq [−] TP, n = 4) und doppelt infizierte NS/PC-transplantierte Mäuse (hM3Dq (+) TP, n = 3) werden gezeigt. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p < 0,05. Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test durchgeführt. T-Wert und Freiheitsgrade: t(5) = 3,977, p = 0,011. c Repräsentative IVIS-Bilder einer Positivkontrollmaus (vor und nach CNO). Der Kreis zeigt die Region of Interest (ROI) in der Halswirbelsäule. Die Farbe der Balken gibt die gesamte Biolumineszenzstrahlung an (Photonen/Sek./cm2/str). d, e Repräsentative Bilder einer Positivkontrollmaus 6 Wochen nach der Transplantation; beschriftet mit Venus (grün), mCherry (rot) und HNA (menschliche Zellen) (blau) (d) oder beschriftet mit Venus (grün), Fos (rot) und HNA (blau) (e). Maßstabsbalken, 20 μm. f Schematische Darstellung von In-vivo-Experimenten. Die Transplantation von ESAL-NS/PCs erfolgte 9 Tage nach der Durchtrennung der C5-Rückensäule. Drei, 6 und 9 Wochen nach der Transplantation wurden Lumineszenzmessungen durchgeführt. Alle Mäuse wurden 10 Wochen nach der Transplantation getötet. g Repräsentative Bilder transplantierter Zellen einer ESAL-NS/PC-transplantierten Maus, markiert mit Venus (grün), pan-ELAVL (rot; Pfeilspitzen) und HNA (blau). Maßstabsbalken, 20 μm. h Zeitabhängige Änderung der Transplantatlumineszenzintensität von ESAL-NS/PC-transplantierten Mäusen 3, 6 und 9 Wochen nach der Transplantation (n = 12 Mäuse). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p < 0,05. NS: nicht signifikant. Es wurde eine ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt. Individuelle p-Werte: Wochen 3 und 6; 0,1735, Woche 6 und 9; 0,2007, Wochen 3 und 9; 0,0035. i Repräsentative Bilder transplantierter Zellen aus ESAL-NS/PC-transplantiertem Mausgewebe, markiert mit Venus (grün), APC (Oligodendrozyten), GFAP (Astrozyten), Ki-67/Nestin (rot; Pfeilspitzen) und HNA (blau). Maßstabsbalken, 20 μm.

Um die neuronale Aktivität in den transplantierten Zellen künstlich zu manipulieren, führten wir hM3Dq ein, einen stimulierenden chemogenetischen Rezeptor und Designerrezeptor, der ausschließlich durch Designerdrogen aktiviert wird (DREADDs), der es dem Transplantat ermöglichte, bei Verabreichung seines Liganden22,23 in ESAL-NS/ aktiviert zu werden. PCs (Abb. 2a). Wenn die Transplantate durch Verabreichung des hM3Dq-Liganden Clozapin-N-oxid (CNO) aktiviert wurden, wurde die Biolumineszenz deutlich erhöht (Abb. 2b, c). Konsistent wurde in immunhistochemischen Analysen die Venus-Proteinexpression ausschließlich in hM3Dq-exprimierenden Zellen nachgewiesen, während mCherry+-Transplantatzellen bei CNO-Aktivierung hauptsächlich Venus-Protein exprimierten (Abb. 2d). Um zu bestätigen, dass dies auf eine sehr hohe lentivirale Transfektionseffizienz zurückzuführen ist, haben wir die Transfektionseffizienz von ESAL und DREADD in NS/PCs über einen lentiviralen Vektor in vivo berechnet. Erstens betrug die Transfektionseffizienz von hM3Dq unter einem allgegenwärtigen Promotor, d 3 Tiere). Zweitens wurde die Expressionseffizienz von ESAL anhand der Population von Venus+-mCherry+-doppelpositiven Zellen aus mCherry+-Zellen unter allgegenwärtiger CNO-Aktivierung angenähert. Der Venus+mCherry+/mCherry+-Prozentsatz wurde zu 83,9 ± 2,5 % bestimmt (Abb. 2d, ergänzende Abb. 2d) (aus n = 3 Tieren). Insgesamt wurden die Transfektionseffizienzen als hoch genug angesehen, um die Ergebnisse der Biolumineszenz zu interpretieren. In Übereinstimmung damit waren Venus+-Zellen häufig immunpositiv für Fos, einen Marker und ein IEG (68,9 ± 3,0 %) (Abb. 2e), obwohl das Fos-Protein durch neuronale Aktivität sofort hochreguliert wird und ein kurzlebiger Transkriptionsfaktor ist24,25 . Diese Daten legen nahe, dass das ESAL-System aktive Ensembles in Neuronen, die in die SCI-Modellmäuse eingepflanzt wurden, erfolgreich markierte.

Der Prozentsatz menschlicher ELAVL (Hu)-positiver neuronaler Zellen war unter den Venus−-positiven Zellen sehr hoch (76, 2 ± 8, 6%) (ergänzende Abbildung 2e). Auch ohne künstliche Aktivierung durch hM3Dq fanden wir eine Venus-Expression in einem Teil der neuronalen Transplantate (Abb. 2f, g). Dieser Befund legt nahe, dass das ESAL-System möglicherweise Neuronen meldet, die im Transplantat spontane Aktivität zeigen. Dies steht im Einklang mit dem zeitlichen Verlauf der ESAL-Biolumineszenzerhöhung, die chronologisch nach der ESAL-NS/PC-Transplantation gemessen wurde, was darauf hindeutet, dass ein Fortschreiten der neuronalen Differenzierung und Reifung von NS/PCs einem signifikanten Anstieg der Biolumineszenzerkennung vorausgeht (Abb. 2h). In Übereinstimmung mit dieser Idee haben wir bestätigt, dass nur wenige Gliazellen eine Venus-Expression zeigten (GFAP+/Venus+, 4,0 ± 1,5 %; APC+/Venus+, 3,3 ± 2,5 %) (Abb. 2i).

Frühere Berichte deuten darauf hin, dass sich die transplantierten Neuronen nach einer Verletzung des Nerventrakts des Wirts integrieren und Teil der Schaltkreise innerhalb des Trakts werden9,26. Mit dem ESAL-System untersuchten wir die Auswirkung der Wirtsaktivität auf die neuronale Transplantataktivität auf individueller und Schaltkreisebene. Zunächst überwachten wir die ESAL-Biolumineszenz über den Tag und stellten fest, dass die ESAL-Biolumineszenz gegen Mittag am höchsten und nachts am niedrigsten war (ergänzende Abbildung 3). Angesichts der Tatsache, dass die ESAL-Biolumineszenz die kumulative neuronale Aktivität etwa 6 Stunden vor der Beobachtung widerspiegelt (ergänzende Abbildung 1 a, b), deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die neuronale Aktivität des Transplantats tageszeitliche Schwankungen aufweist, die mit der Spitzen- und Tiefstaktivität der Wirtstiere während der Nacht- und Tagesperioden übereinstimmen , jeweils. Um weiter zu bestimmen, wie stark die Wirtsaktivität die Transplantataktivität auf individueller Ebene beeinflusst, verwendeten wir als nächstes eine Langzeitanästhesie (mit einer Kombination aus Midazolam, Medetomidinhydrochlorid und Butorphanol), um den Schlaf nachzuahmen (Abb. 3a). Die Atemfrequenz der Mäuse deutete darauf hin, dass die Anästhesie nach der Verabreichung mindestens 6 Stunden lang aktiv war. Um die Anästhesiezeit auf 9 Stunden zu verlängern, verabreichten wir für die restlichen 3 Stunden zusätzlich Isofluran. Die ESAL-Biolumineszenz sank nach Langzeitanästhesie auf fast die Hälfte des Ausgangswertes (Abb. 3b, c). Dieser Rückgang war sowohl 6 als auch 9 Wochen nach der Transplantation signifikant (Abb. 3c). Darüber hinaus wollten wir bestätigen, dass die Mischung aus drei Arten von Anästhetika die Aktivität von Transplantatneuronen mithilfe von in vitro kultivierten Neuronen nicht direkt verändern kann. Tatsächlich wurde die BLI-Signalintensität durch die Anästhetika nicht wesentlich verringert (Abb. 3d, e). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die neuronale Aktivität des Transplantats mit den täglichen Aktivitäten der Wirte auf individueller Ebene verbunden ist.

a Schematische Darstellung einer Langzeit-Daueranästhesie. Die Anästhesie wurde mit einer Mischung aus drei Arten von Anästhetika (Butorphanol, Medetomidinhydrochlorid und Midazolam) erreicht, gefolgt von einer Inhalationsanästhesie für bis zu 9 Stunden. b Repräsentative IVIS-Bilder einer ESAL-NS/PC-transplantierten Maus vor und nach einer Langzeitanästhesie 10 Wochen nach der Transplantation. Der Kreis zeigt die Region of Interest (ROI) in der Halswirbelsäule. Die Farbe der Balken gibt die gesamte Biolumineszenzstrahlung (Photonen/Sek./cm2/sr) an. c Das Verhältnis der BLI-Signalintensität (vor und 9 Stunden nach kontinuierlicher Anästhesie) 6 und 9 Wochen nach der Transplantation (n = 5 Mäuse). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p, #p < 0,05. Es wurden zweiseitige gepaarte Student-t-Tests durchgeführt. Individuelle t-Werte und Freiheitsgrade: Woche 6 und 9; t(8) = 2,754, p = 0,025, Woche 6; t(8) = 2,502, p = 0,037, Woche 9; t(8) = 4,456, p = 2,1 × 10−3. d Vergleichender BLI von in vitro kultivierten Zellen mit (n = 4) oder ohne (n = 4) Zugabe der gemischten Anästhesiemittel in zwei verschiedenen Konzentrationen, 12/3/10 μM („Niedrige Konzentration“) und 30/7,5 /25 μM („Hohe Konzentration“), für 6 h (n = 4, jeweils 4). Wir haben n = 8 Vertiefungen aus zwei unabhängigen tertiären Neurosphären desselben EB vorbereitet. Die Farbe der Balken gibt die gesamte Biolumineszenzstrahlung an (Photonen/Sek./cm2/str). e Quantitative Analysen der relativen BLI-Signalintensität von ESAL-NS/PC-abgeleiteten Zellen mit oder ohne Zusatz der gemischten Anästhetika in vitro (jeweils n = 4, 4). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: NS: nicht signifikant. Es wurden zweiseitige ungepaarte Student-t-Tests durchgeführt. Einzelne t-Werte und Freiheitsgrade: links: t(6) = 0,342, p = 0,744, rechts: t(6) = 1,821, p = 0,118.

Als nächstes untersuchten wir, ob und in welchem ​​Ausmaß die Aktivität auf Wirtsschaltkreisebene die neuronale Aktivität des Transplantats direkt reguliert. Wir konzentrierten uns auf den Kortikospinaltrakt (CST), einen der wichtigsten absteigenden Schaltkreise, der eine zentrale Rolle bei der sensomotorischen Kontrolle spielt, und auf die künstlich manipulierte CST-Aktivität durch Injektion eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das für hM3Dq-mCherry kodiert, in den motorischen Kortex Kontrolle des menschlichen Synapsin-I-Promotors (Abb. 4a). Drei bis vier Wochen nach der AAV-Injektion27 bestätigten wir, dass hM3Dq-mCherry eine effiziente anterograde Markierung der C5-Läsionsstelle durch das CST ermöglichte (Abb. 4b). Diese selektive Markierung der CST-Projektionen an der Läsionsstelle ließ darauf schließen, dass CST-Fasern das Transplantat innervierten (Abb. 4c, ergänzende Abb. 5). Tatsächlich stellten wir fest, dass sich Wirt-zu-Transplantat-Synapsen gebildet hatten (Abb. 4d – g, ergänzende Abb. 6a – c), was auf eine CST-gesteuerte Kontrolle des Transplantats hinweist. Um dies direkt zu testen, wurde das CST durch Verabreichung des hM3Dq-Liganden CNO aktiviert und wir konnten durch immunhistochemische Analysen einen aktivitätsinduzierten Anstieg der Expression von mit AkaLuc fusioniertem Venus in Transplantatzellen feststellen (Abb. 4h – j). Darüber hinaus wurde der durch künstliche CST-Stimulation nach CNO-Behandlung induzierte Anstieg der Transplantataktivität auch in vivo durch BLI-Messungen durch einen Anstieg der ESAL-Photonenzahlen des Transplantats bestätigt (Abb. 4h, k, l). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CST-Eingänge des Wirts die Transplantataktivität innervieren und regulieren.

eine schematische Darstellung, die den Zeitplan der In-vivo-Experimente darstellt. Sechs Wochen nach der Transplantation von ESAL-NS/PCs wurden Mäuse einer AAV-Injektion in den motorischen Kortex unterzogen. Zehn Wochen nach der Transplantation wurden vor der Tötung Lumineszenzmessungen durchgeführt. b Bestätigung von mCherry-markierten Zellkörpern in der Großhirnrinde (Maßstabsbalken, 250 μm) und mCherry-markierten Axonen in der Medulla (Maßstabsbalken, 500 μm) und im Halsrückenmark auf der halben Ebene (Maßstabsbalken, 100 μm). ). mCherry+ CST-Axonenden wurden in der grauen Substanz rostral des C5-Läsionsbereichs beobachtet (Maßstabsbalken, 250 μm), und einige CST-Axone wurden kaudal der Läsion beobachtet (Maßstabsbalken, 250 μm). R: rechts, L: links, D: dorsal und V: ventral. c Repräsentative sagittale Bilder 400 μm von der Mittelsagittalebene um das verletzte Rückenmark. Transplantierte Zellen wurden mit STEM121 (einem menschenspezifischen zytoplasmatischen Marker) gefärbt und das CST mit mCherry markiert. Gestrichelte Linie, rostrale Grenze des Transplantats, R: rostral, C: kaudal, D: dorsal und V: ventral. Maßstabsbalken, 5 μm. d Stark vergrößerte Ansicht der Synapsenbildung zwischen CST-Axonen und transplantierten Neuronen. Der präsynaptische Marker Synaptophysin fusionierte mit mCherry und grenzte an eine STEM121+-Zelle. Maßstabsbalken, 2 μm. e Stark vergrößerte Ansicht der Synapsenbildung zwischen CST-Axonen und transplantierten Neuronen. Der postsynaptische Marker pAMPAR fusionierte mit STEM121 und grenzte an eine mCherry+-Zelle. Maßstabsbalken, 2 μm. f Balkendiagramm, das die Quantifizierung der mit mCherry fusionierten Synaptophysin+-Synapsen zeigt, die in den STEM121+-Bereich in jeder transplantierten Gruppe integriert wurden (CST-Aktivierungsgruppe, 20 Bilder/n = 4; CST-Nichtaktivierungsgruppe, 20 Bilder/n = 4). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p < 0,05. Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test durchgeführt. T-Wert und Freiheitsgrade: t(38) = 0,128, p = 0,90. g Doppelte immunelektronenmikroskopische Aufnahme der synaptischen Verbindung zwischen einem mCherry+ CST-Neuron mit 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)-Färbung und einem Venus+-Transplantatneuron mit Immunogold-Färbung. Die Anti-mCherry-Markierung war an der Membran des CST-Neurons lokalisiert und Venus-Proteine ​​waren als schwarze Punkte, hauptsächlich in der Zytoplasmamembran, nachweisbar. Pfeilspitzen, postsynaptische Dichte. Maßstabsbalken, 500 nm. h Schematische Darstellung, die zeigt, dass das Wirts-CST an Stellen mit C5-Rückenmarksverletzungen Eingaben in neuronale Stammzelltransplantate vornimmt. Wenn CST-Neuronen über hM3Dq aktiviert werden, sind Transplantatneuronen, die mit regenerierten CST-Axonen verbunden sind, in der Lage, den Promotor E-SARE zu erhalten, was zu einer hohen Expression des Downstream-Reportergens Venus-AkaLuc führt. R: rostral, C: kaudal, D: dorsal und V: ventral. i Repräsentative axiale Bilder des Halswirbelsäulenmarks von Venus und HNA-Färbung im Gewebe von Mäusen mit oder ohne CST-Aktivierung. Die gezeigten Schnitte wurden in der gleichen Reihenfolge entlang der rostro-kaudalen Achse abgeleitet. Maßstabsbalken, 1000 μm. Venus ist ein zytoplasmatisches Protein, während HNA ein Anti-Kern-Antigen ist. j Vergleich des berechneten Venus+-Volumens/HNA+-Volumens zwischen transplantierten Gruppen (CST-Aktivierungsgruppe, n = 4; CST-Nichtaktivierungsgruppe, n = 4). Zur Markierung des Venus-Proteins wurde ein Anti-GFP-Antikörper verwendet. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: *p < 0,05. Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test durchgeführt. T-Wert und Freiheitsgrade: t(6) = 2,573, p = 0,042. k Repräsentative IVIS-Bilder einer ESAL-NS/PC-transplantierten Maus vor und nach der CST-Aktivierung (dasselbe Individuum, dargestellt in Abb. 4i [rechts]). Der Kreis zeigt die Region of Interest (ROI) in der Halswirbelsäule. Die Farbe der Balken gibt die gesamte Biolumineszenzstrahlung an (Photonen/Sek./cm2/str). l Vergleich der BLI-Signalintensität für ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse mit oder ohne CST-Aktivierung für jede Maus 10 Wochen nach der Transplantation (n = 10 Mäuse). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM: **p < 0,01. Es wurde der zweiseitige gepaarte Student-t-Test durchgeführt. T-Wert und Freiheitsgrade: t(18) = 2,963, p = 8,3 × 10−3.

Wie lange nach der Transplantation nehmen die CST-Eingänge zu, um transplantierte Neuronen zu innervieren? Um diese Frage zu beantworten, wurde die Biolumineszenz von Transplantaten, die von CST-Neuronen innerviert wurden, in Längsrichtung gemessen. Interessanterweise stieg das Signal-Rausch-Verhältnis (nach/vor der CST-Aktivierung) von Woche 3 bis 9 und von Woche 6 bis 9 signifikant an, was darauf hindeutet, dass CST-Eingänge des Wirts die Transplantataktivität innervieren und regulieren, insbesondere nach Woche 6 (ergänzende Abb . 4a).

Wie wird ein zeitlicher Verlauf der ESAL-Aktivität nach der CNO-Verabreichung durchgeführt? Eine anfängliche Wirkung der systemischen CNO-Verabreichung auf die neuronale Aktivität beginnt nach 5–10 Minuten und erreicht ihren Höhepunkt 45–50 Minuten nach der CNO-Verabreichung28,29,30. In Anbetracht der Tatsache, dass die in dieser In-vitro-Studie festgestellte Zeitverzögerung vom Antrieb des ESARE-Promotors bis zum Höhepunkt der Reporterproteinexpression von ESAL 6 Stunden betrug, wurden alle oben genannten Messungen 7 Stunden nach der CNO-Verabreichung durchgeführt (ergänzende Abbildung 4b). Zur Validierung führten wir ESAL-Photonenzählmessungen 4, 7 und 10 Stunden nach der CNO-Verabreichung durch und verfolgten dasselbe einzelne Tier an verschiedenen Tagen. Im Einklang mit den Ergebnissen der In-vitro-Studie war das Verhältnis der durchschnittlichen Photonenzahl pro Anfangszustand nach 7 Stunden unter den drei Zeitpunkten (4, 7 und 10 Stunden) am höchsten, obwohl der Unterschied zwischen den Photonenzahlverhältnissen bei 4 lag h und 7 h pro Ausgangszustand waren nicht signifikant (ergänzende Abbildung 4c).

Hier haben wir ein neuartiges Bioimaging-System, ESAL, entwickelt, indem wir eine empfindliche und genaue rotverschobene Biolumineszenz, AkaBLI, und den von der neuronalen Aktivität abhängigen Promotor E-SARE kombiniert haben. Dieses ESAL-System markiert wirksam aktive Neuronen in Nerventransplantaten im verletzten Rückenmark. Mithilfe dieses nicht-invasiven ESAL-Bildgebungssystems haben wir den direkten Zusammenhang zwischen der Transplantataktivität und der Aktivität auf Schaltkreis-/Verhaltensebene des Wirts nachgewiesen.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das ESAL-System eine nicht-invasive Methode zur In-vivo-Bildgebung der Transplantataktivität im verletzten Rückenmark ist. Das ESAL-System kann spontane neuronale Aktivität abbilden und die Interaktion zwischen dem Transplantat und den neuronalen Schaltkreisen des Wirts aufdecken. Obwohl einige Gruppen über Wirt-Transplantat-Konnektivität in SCI-Modellen unter Verwendung elektrophysiologischer31 oder Calcium-Bildgebungstechniken9 berichtet haben, wurden ihre Experimente nicht an lebenden SCI-Tieren durchgeführt. Im Gegensatz dazu kann das ESAL-System auf völlig nicht-invasive Weise eingesetzt werden, und wir haben in vivo gezeigt, dass die Aktivität des Wirts auf individueller Ebene, wie z. B. Schlaf und Langzeitanästhesie, die Transplantataktivität direkt beeinflusst.

Die neuronale Weiterleitung ist ein zentraler Mechanismus, durch den die NS/PC-Transplantation zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen eingesetzt werden kann9,31,32. Zwischen absteigenden Axonen des Wirts und neu differenzierten Neuronen aus transplantierten NS/PCs können Relaisschaltkreise eingerichtet werden. Das Fehlen nicht-invasiver In-vivo-Messmethoden hat jedoch die Aufklärung darüber verhindert, wie sich Nerventransplantate funktionell in die Schaltkreise des Wirts integrieren und wie die Transplantataktivität zur Verhaltenswiederherstellung beiträgt. Unser ESAL-System kann die Transplantataktivität im Kontext verschiedener Wirtsverhalten überwachen und so den Mechanismus der neuronalen Relaisbildung und ihren Beitrag zur funktionellen Wiederherstellung aufklären.

Die Biolumineszenzintensität von NS/PC-abgeleiteten Zellen nahm bis 9 Wochen nach der Transplantation kontinuierlich zu, was darauf hindeutet, dass gleichzeitig die spontane Transplantataktivität zunahm. Dies steht im Einklang mit einer früheren Studie unserer Gruppe, die darauf hindeutet, dass die neuronale Reifung in Transplantaten mehr als 6 Wochen dauert33. Mehrere Berichte über menschliche iPSC-abgeleitete Gehirnorganoide haben auch darauf hingewiesen, dass die Synapsenbildung und die spontane Aktivität in der 4. bis 6. Woche beginnen34. Basierend auf den Erkenntnissen anderer und unseren eigenen könnten die Ergebnisse des ESAL-Systems die neuronale Reifung und Synapsenbildung in vivo widerspiegeln.

Die Debatte bleibt bestehen, welche Subtypen von NS/PCs mit unterschiedlichen regionalen Identitäten für die Zelltherapie am besten geeignet sind31,35,36. Das ESAL-System ermöglicht die Bestimmung der Qualität und Eignung verschiedener NS/PC-Subtypen, die in den Host integriert sind. Wie Transplantate zur weiteren Geweberegeneration und Wiederherstellung der motorischen Funktion beitragen, ist bislang unklar. Frühere Berichte haben gezeigt, dass eine Vorbehandlung mit einem γ-Sekretase-Inhibitor (GSI) die Reifung von NS/PC-abgeleiteten Neuronen durch Hemmung des Notch-Signals fördert;21 darüber hinaus erleichtern Nogo-Rezeptorantagonisten die Regeneration des Raphespinaltrakts37, und es wurde vorgeschlagen, dass einige Synapsenorganisatoren die Regeneration beschleunigen Synapsenbildung38. Dieses System wird auch bei der Bewertung der Auswirkungen dieser molekularen Komponenten auf NS/PC-Transplantate und die Wirtsschaltkreise rund um das verletzte Rückenmark von Nutzen sein.

Somit hat dieses ESAL-System das Potenzial, den Beitrag des synaptischen Inputs von jedem absteigenden Weg zu transplantierten Neuronen bei der Wiederherstellung der motorischen Funktion aufzudecken. Zu den Funktionen des CST gehört die Steuerung afferenter Eingaben, Wirbelsäulenreflexe und Motoneuronenaktivität39. Darüber hinaus gilt der CST allgemein als der wichtigste motorische Weg für willkürliche Bewegungen beim Menschen40. Bei Nagetieren beherrscht das CST nur die Greiffähigkeit, die digitale Beuger einbezieht, was weitgehend vom dorsalen und dorsolateralen CST abhängt, sowie horizontale Leiter- oder geschickte Greifaufgaben41,42. Früheren Studien zufolge könnte der rubrospinale oder retikulospinale Trakt für die motorische Funktion bei Nagetieren wichtiger sein als der CST43,44. Es wäre interessant, die Transplantationsstelle mithilfe dieses Systems zu überprüfen, um die Wirkung der Zelltherapie zu verstärken.

Zusammenfassend stellt diese Studie ein neues In-vivo-System zur Überwachung transplantierter, von Zellen abgeleiteter Neuronen vor und liefert wichtige Informationen über die Bedeutung des Zusammenhangs zwischen Transplantataktivität und dem neuronalen Schaltkreis und Verhalten des Wirts. Wir haben in vivo gezeigt, dass die synaptische Konnektivität zwischen Wirt und Transplantat nach NS/PC-Transplantation für SCI funktionell hergestellt wurde. Eine Möglichkeit, die Zelltherapie zu verbessern, wäre die weitere Verbesserung dieser Konnektivität. Die Förderung der neuronalen Reifung oder Synapsenbildung könnte die Zelltherapie mit diesem System in Zukunft effektiver machen.

Sowohl die Aktivierung des CST/Transplantats als auch die Aufzeichnung der Transplantataktivität waren von der viralen Expression von hM3Dq und ESAL abhängig. Unterschiede in der Transfektions-/Expressionseffizienz könnten sich auf Analysen der Integration der Transplantatzellen innerhalb des Wirts-CST auswirken. Niedrige Transfektionseffizienzen könnten auch die Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich der ESAL-Aktivität erschweren. Obwohl das CST die Hauptkomponente ist, die zur motorischen Kontrolle beiträgt, erkennen wir, dass eine einmalige CST-Stimulation nicht ausreicht, um das Verhalten von Mäusen zu verbessern, da die neuronale Plastizität nicht verändert werden soll. Stattdessen kann eine aufeinanderfolgende hM3Dq-Stimulation des CST eine gleichzeitige Verbesserung der Schaltkreis-/Verhaltensaktivitäten und eine Steigerung der synaptischen Aktivität bewirken45,46. Darüber hinaus würde die Inaktivierung der CST-Funktion durch CST-DREADDs besser dazu beitragen, den Nachweis der Konnektivität zwischen Wirt und Transplantat zu erbringen47.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses System keine Echtzeitbewertung der laufenden neuronalen Aktivität ermöglicht, sondern vielmehr eine erhöhte Aktivität über mehrere Stunden benötigt, um eine Wirkung zu zeigen, die die kumulative neuronale Aktivität widerspiegelt. Eine Lösung zur Verbesserung der zeitlichen Auflösung besteht darin, einen Indikator für die neuronale Aktivität in Echtzeit zu verwenden, beispielsweise die intrazelluläre Kalziumkonzentration. Tatsächlich wurde über ein kalziumabhängiges Luciferasesystem, Orange CaMBI, berichtet48. Dieses System basiert jedoch auf NanoLuc-Furimazin und ist aufgrund seiner geringen Substratpermeabilität durch die Blut-Hirn-Schranke möglicherweise nicht für Nerventransplantate geeignet49,50. Eine andere mögliche Lösung ist die Verwendung eines anderen aktivitätsabhängigen Promotors, wie z. B. des Fos-Promotors51, einem häufig verwendeten aktivitätsabhängigen Promotor, der aufgrund der Autorepression der Fos-Transkription durch das Fos-Protein52,53 auf einem sehr niedrigen Niveau reguliert wird. Um die Fos-Promotor-abhängige Expression zu verstärken, wird daher aufgrund der Transkriptionsaktivierung durch Tetracyclin normalerweise ein Tet-induzierbares System hinzugefügt10. Dieses Fos-tet-Doppelreportersystem erfordert jedoch erhebliche Zeit für die Genexpression. Im Gegensatz dazu treibt das ESAL-System die Reporterexpression auf ein ausreichend hohes Niveau, um alleine für die Transplantatüberwachung verwendet zu werden, wodurch die Genexpression über einen relativ kurzen Zeitraum erreicht wird.

Obwohl wir uns hauptsächlich auf die Wirt-zu-Transplantat-Verbindung zwischen den absteigenden Neuronen des Wirts und dem Transplantat konzentriert haben, sind weitere Studien erforderlich, um die Transplantat-zu-Wirt-Interaktion zwischen dem Transplantat und den spinalen Neuronen des Wirts, wie z. B. Motoneuronen, zu untersuchen. Das ESAL-System ist durch die Verwendung von AAVs nicht nur für Transplantate, sondern auch für Wirtsneuronen verfügbar, da ESAL aufgrund seiner geringen Größe in einem einzigen AAV verpackt werden kann. Beispielsweise wäre es möglich, die Aktivität spinaler Motoneuronen durch Transfektion eines retrograden AAV-Virusvektors in die neuromuskuläre Verbindung zu erfassen54. Zukünftige Studien werden unser Verständnis der gegenseitigen Interaktion zwischen Wirt und Transplantat erweitern.

Um einen lentiviralen Vektor für ESAL zu konstruieren, werden der E-SARE-Promotor (wie in Lit. 10 beschrieben und auf Anfrage bei H. Bito in der Abteilung für Neurochemie der University of Tokyo Graduate School of Medicine erhältlich) und Venus-AkaLuc-PEST-cDNA verwendet (erhalten aus einem Plasmid, das wir mit einem MTA vom RIKEN BRC [Bioressourcenzentrum] erhalten haben) wurden in den lentiviralen Vektor CSII kloniert. Um einen lentiviralen Vektor für die allgegenwärtige DREADD-Aktivierung zu konstruieren, wurde hM3Dq-mCherry-cDNA aus pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (Addgen-Plasmid Nr. 50474) durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und mit dem CAG auf den lentiviralen Vektor CSIV übertragen Promotor, bei dem es sich um ein Hybridkonstrukt handelt, das aus dem Cytomegalievirus (CMV)-Enhancer, fusioniert mit dem Hühner-Beta-Actin-Promotor55, besteht.

Rekombinante lentivirale Vektoren wurden durch vorübergehende Transfektion von drei Plasmiden in HEK 293T-Zellen hergestellt: pCAG-HIVgp, pCMV-VSV-G-RSV-Rev und der lentivirale Vektor CSII-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST oder CSIV-CAG- hM3Dq-mCherry56,57,58.

Das Center for iPS Cell Research and Application (CiRA) stellte uns human induzierte pluripotente Zellen (iPSCs) zur Verfügung, die unter Bedingungen der guten Herstellungspraxis (GMP) erzeugt und gepflegt wurden. NS/PCs wurden aus der menschlichen iPSC-Linie 414C259 mit zuvor beschriebenen Methoden erzeugt21,33,60. Kurz gesagt, 414C2 menschliche iPSCs wurden 12 Tage lang in Adhäsionskultur mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus kultiviert. Anschließend wurden Embryoidkörper (EBs) aus iPSCs erzeugt, die 30 Tage lang in Suspension gezüchtet wurden. Die EBs wurden dann mit TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) in einzelne Zellen dissoziiert und in Suspension mit einer Dichte von 1,0 × 105 Zellen/ml in KBM-Medium für neurale Stammzellen (Kohjin Bio, Saitama, Japan), ergänzt mit, differenziert B-27 (Thermo Fisher Scientific), 20 ng/ml FGF-2 (PeproTech, NJ, USA) und 10 ng/ml humaner Leukämie-Hemmfaktor (hLIF; Merck KGaA, Hessen, Deutschland) für 12 Tage. FGF-2 wurde alle 3 Tage hinzugefügt und alle Zellkulturmedien wurden alle 6 Tage gewechselt. Diese primären Neurosphären wurden alle 10–14 Tage passagiert, indem sie auf die gleiche Weise wie oben beschrieben dissoziiert wurden. Nach der ersten Passage wurde 3 Tage lang eine lentivirale Infektion in Kultur durchgeführt und für die folgenden Experimente wurden tertiäre Neurosphären verwendet. Unter Berücksichtigung der berechneten Transfektionseffizienz haben wir die MOI-Werte (Multiplizität der Infektion) für NS/PCs auf 6,7 (ESAL) und 2,7 (hM3Dq) angepasst, basierend auf dem lentiviralen Titer durch quantitative PCR (qPCR) und der Gesamtzellzahl pro Flasche war während der gesamten Experimente konsistent. Die Titerbestimmung erfolgte durch einen qPCR-basierten lentiviralen Titertest gemäß den Anweisungen des Herstellers (Takara Bio, Shiga, Japan).

Astrozyten-Feederzellen der Maus, die aus der Großhirnrinde der E17-Maus extrahiert worden waren, wurden auf mit Poly-D-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtete Kammerglasobjektträger mit 24 Vertiefungen plattiert. Die Feederzellen wurden 3–7 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 und 95 % Luft kultiviert (5 × 104 Zellen/Well). Mit TrypLE Select dissoziierte quartäre Neurosphären wurden auf Kammerglasobjektträgern ausplattiert, die mit der Astrozyten-Feeder-Schicht vorbeschichtet waren, und zwar in einer Dichte von 1×105 Zellen/Well. Die Zellen wurden 50 Tage lang in neuronalem Reifungsmedium kultiviert, das aus Neurobasal Plus Medium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit B-27 Plus Supplement (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), Culture One Supplement (Thermo Fisher Scientific), und L-Ascorbinsäure (200 μM) (Sigma–Aldrich). Für den neuronalen Stimulationstest wurde Kaliumchlorid in einer Konzentration von 50 mM zugesetzt und blieb 6 Stunden im Kulturmedium. Für den neuronalen Stummschaltungstest wurde eine Mischung aus drei Wirkstoffen (Butorphanol [Vetorphale], Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokio, Japan; Medetomidinhydrochlorid [Domitor], Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd., Fukushima, Japan; Midazolam) verwendet , Sandoz KK, Tokio, Japan) wurde in zwei Konzentrationen zugegeben: 12/3/10 μM (niedrige Konzentration) und 30/7,5/25 μM (hohe Konzentration)61,62.

Acht Wochen alte weibliche NOD-SCID-Mäuse (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japan) wurden einer SCI oder einer Scheinoperation unterzogen (das Gewicht der SCI-Mäuse vor der SCI lag zwischen 15,92 und 20,55 g). Um den therapeutischen Effekt der Transplantation auf die motorische Funktion zu bestimmen, wurden 30 Tiere mithilfe der Zufallslotteriemethode (d. h. Einzelne Zettel mit den Nummern 1–30 wurden in eine Schachtel gelegt und für jede Gruppe wurden zufällig Zettel gezogen: TP-Gruppe, n = 14; PBS-Gruppe, n = 12; Scheingruppe, n = 4). Der TP-Gruppe wurde in Woche 1 ein AAV injiziert und es wurden longitudinale Lumineszenzmessungen durchgeführt (das Gewicht der TP- und PBS-Mäuse lag zwischen 15,07–19,69 g in Woche 0, 15,00–20,75 g in Woche 3, 16,26–22,86 g in Woche 6). und 17,14–22,43 g in Woche 9). Darüber hinaus erhielten einige TP-Mäuse (n = 12) 6 Wochen nach TP vorläufig SCI-, TP- und AAV-Injektionen. Wir haben Lumineszenzmessungen nur in Woche 10 durchgeführt. Sowohl die ESAL- als auch die hM3Dq-transduzierten NS/PC-transplantierten Mäuse (hM3Dq (+) TP, n = 5) wurden in Woche 6 Positivkontrollmessungen unterzogen (Daten waren für n = 3 verfügbar). Im Gegensatz dazu wurden andere TP-Mäuse (hM3Dq [−] TP, n = 5) in Woche 6 negativen Kontrollmessungen unterzogen (Daten waren für n = 4 verfügbar) und in den Wochen 6 und 9 einer Bewertung des Einflusses einer langen Anästhesie auf Transplantate unterzogen. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Keio-Universität genehmigt und gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institutes of Health, MD, USA) durchgeführt.

Acht Wochen alte weibliche NOD-SCID-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektionen von Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert. Es wurde keine zusätzliche Analgesie über Ketamin hinaus verabreicht. Unter Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1–2 %) und O2 wurde der Laminalbogen der Wirbel auf Höhe C4 entfernt und die dorsale Oberfläche der Dura mater freigelegt. Ein Wolframdrahtmesser (McHugh Milieux, David Kopf Instruments, CA, USA) wurde 0,6 mm von der dorsalen Oberfläche entfernt eingeführt und 0,5 mm angehoben, um die dorsale Säule zu durchtrennen31. Neun Tage nach der Verletzung wurden 5 × 105 NS/PCs pro 2 μl mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min unter Verwendung einer Metallnadel mit einer 10 μl-Hamilton-Spritze und einem stereotaktischen Mikroinjektor (KDS 310; Muromachi Kikai, Tokio, Japan) (ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse, insgesamt n = 31; ESAL- und hM3Dq-transduzierte NS/PC-transplantierte Mäuse, n = 5). Die Spritze wurde nach der Injektion zwei Minuten lang an der Injektionsstelle belassen, bevor sie entfernt wurde. Stattdessen wurde ein gleiches Volumen PBS in Kontrollmäuse injiziert (Mäuse der PBS-Gruppe, n = 12). Bei den Scheinmäusen wurde eine Laminektomie der Halswirbelsäule C4 durchgeführt (Scheingruppenmäuse, n = 4). Die Körpertemperatur wurde bei 37 °C gehalten, indem die Mäuse auf eine digitale Heizplatte gelegt wurden. Wir verabreichten den Tieren am Operationstag und am Tag nach der Rückenmarksverletzung intramuskulär 12,5 mg/kg Ampicillin. Wir haben nach SCI keine Intensivpflege durchgeführt, da die Tiere trotz des negativen Einflusses auf die Bewegung der Vorderbeine selbstständig Zugang zu Futter und Wasser hatten. Die Tiere wurden während einer Nachbeobachtungszeit von 10 Wochen gehalten und anschließend getötet; der Zeitraum betrug 6 Wochen für ESAL- und hM3Dq-transduzierte NS/PC-transplantierte Mäuse (hM3Dq (+) TP; n = 3; zwei Tiere starben vor 6 Wochen).

Für die Transplantationsexperimente wurde am Tag vor der Transplantation eine Behandlung mit Gamma-Sekretase-Inhibitor (GSI) angewendet, wie zuvor beschrieben21. Kurz gesagt, NS/PCs wurden mit einem niedermolekularen GSI, N-[N-(3,5-Difluorphenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycin-t-butylester (DAPT; Sigma-Aldrich, MO, USA) kultiviert. , gelöst in DMSO in einer Endkonzentration von 10 μM, für einen Tag vor der Transplantation in die Verletzungsstelle.

Die folgenden Analysen wurden in den Wochen 3, 6 und 9 durchgeführt. Der Experimentator war zu jedem Zeitpunkt der Verhaltensexperimente gegenüber den Behandlungsgruppen blind.

Der Griffkrafttest ist eine anerkannte Methode zur Beurteilung der Funktion der Vorderbeine. Die Wiederherstellung der motorischen Funktion nach Zelltransplantation oder PBS-Injektion wurde anhand der Fähigkeit des Tieres beurteilt, eine Zugkraft auszuüben63,64,65 (TP-Gruppe; n = 13, PBS-Injektionsgruppe; n = 10 zum letzten Zeitpunkt). Woche 9). Der Versuch bestand aus fünf einzelnen Zügen. Die höchsten und niedrigsten Kräfte wurden ausgeschlossen und die verbleibenden drei Kräfte wurden gemittelt66. Die Kraftmessungen wurden auch nach Körpergewicht geteilt67,68. Der Griffstärketest wurde mit einem digitalen Kraftmessgerät (Shimpo, Kyoto, Japan) und einem Drahtgeflecht-Befestigungsgerät (Muromachi Kikai) durchgeführt.

Zur Beurteilung der Beeinträchtigung der Vorderbeine, insbesondere der CST-Funktion, wurde der IBB-Score der Maus nach den Methoden der Lebensmittelmanipulationsaufgabe von Irvine, Beatties und Bresnahan mit geringfügigen Modifikationen verwendet69,70,71. Kurz gesagt, die Mäuse wurden nach der SCI 10 Tage lang jeden Tag an die Umgebung gewöhnt. Es wurde Donut-förmiges Müsli mit Honiggeschmack (Honey Nut Cheerios, MN, USA) verabreicht und die Bewegungen der Vorderbeine wurden mit einer Kamera (GoPro, CA, USA) bei 120 f/s im heimischen Käfig aufgezeichnet (TP-Gruppe, Nr = 13; PBS-Injektionsgruppe, n = 10; Scheingruppe, n = 4 zum letzten Zeitpunkt in Woche 9).

Bei der Gehaufgabe mit der horizontalen Leiter (Conduct Science, MA, USA) wurde die Platzierung der Pfoten auf unregelmäßig beabstandeten Sprossen gemessen72,73. Um die Gehfähigkeit zu beurteilen, wurden die Fehler bei jedem Übergang gezählt. Vor der SCI trainierten wir Mäuse fünf Tage lang 20 Minuten am Tag mit einem regelmäßigen Sprossenmuster, um sie daran zu gewöhnen. Eine Kamera (GoPro) wurde in einem leichten ventralen Winkel positioniert, um alle vier Gliedmaßen mit 60 f/s aufzunehmen. Das Muster der unregelmäßig verteilten Sprossen wurde alle drei Wochen geändert, um zu verhindern, dass die Tiere das Muster erlernen, und um Beeinträchtigungen durch Lernen auszugleichen. Der Start wurde als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Maus alle vier Gliedmaßen auf die Sprossen legte, und das Ende wurde als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Maus die letzte Sprosse der Leiter erreichte. Der erste Schritt nach der Unterbrechung wurde nicht gewertet.

Um genau zu untersuchen, ob die CST-Aktivierung die Aktivität von Nerventransplantaten in Woche 10 veränderte, wurde AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry (Addgen #50474-AAV2; 7,38 × 1012 vg/ml) an vier Stellen (500 nL) in den bilateralen sensomotorischen Kortex injiziert /Punkt; Koordinaten = 1 mm rostral und 1,4 mm lateral zum Bregma, 1 mm posterior und 1 mm lateral zum Bregma; Tiefe = 0,7 mm) mit einer Geschwindigkeit von 100 nL/Minute durch eine gezogene Glasmikropipette (kalibrierte Mikropipette, 1 –5 μL; Funakoshi, Tokio, Japan) in Woche 6 (vorläufige ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse [n = 12]). Um den Zusammenhang zwischen der Bewegung der oberen Extremitäten und der Veränderung der Transplantataktivität nach CST-Aktivierung zu untersuchen, wurde AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry an zwei Stellen in den bilateralen sensomotorischen Kortex injiziert (500 nL/Punkt; Koordinaten = 1 mm rostral und 1,4 mm lateral). zum Bregma; Tiefe = 0,7 mm) in Woche 1 (ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse für longitudinale Lumineszenzmessungen [n = 14]). CNO (Enzo Life Sciences, NY, USA) wurde in einer Konzentration von 5 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Um das CST zu manipulieren, wurden insgesamt 26 ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse einer anterograden Markierung von CST-Axonen mit hM3Dq unterzogen. Um in die Analysen zur Integration zwischen dem Wirts-CST und dem Transplantat einbezogen zu werden, mussten die CST-Axone erfolgreich durchtrennt und entsprechend der Immunhistochemie markiert werden, und das Transplantat musste durch BLI-Photonenzählung (in den Wochen 3 und 6) eindeutig an der Halswirbelsäule nachgewiesen werden , und 9). Von den vorläufigen 12 Tieren wurde ein Tier wegen Tod vor der endgültigen Messung ausgeschlossen, und ein Tier wurde wegen schlechter CST-Kennzeichnung ausgeschlossen (n = 10 verfügbar). Von den 14 Längsschnitttieren wurden zwei Tiere wegen Tod ausgeschlossen, und zwei Tiere wurden wegen schlechter CST-Kennzeichnung ausgeschlossen (n = 10 verfügbar). Die CST-Transektion wurde gemäß den immunhistochemischen Befunden für alle anderen Mäuse als erfolgreich angesehen74.

Biolumineszenzbilder wurden mit dem IVIS Spectrum-System (Perkin Elmer, MA, USA) aufgenommen. Bei in vitro kultivierten Neuronen wurde die Biolumineszenz unmittelbar nach der Behandlung mit 300 µM AkaLumine-HCl (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) gemessen. Die doppelt infizierten NS/PC-transplantierten Mäuse wurden in Woche 6 abgebildet. ESAL-NS/PC-transplantierte Mäuse wurden in Woche 6 und 9 oder in Woche 10–11 unter Inhalationsanästhesie (2 % Isofluran und Sauerstoff) oder unter a abgebildet Mischung aus drei Anästhesiearten (5 mg/kg Butorphanol, 0,75 mg/kg Medetomidinhydrochlorid und 4 mg/kg Midazolam)75 für 9 Stunden, gefolgt von Inhalation von 2 % Isofluran und Sauerstoff (die Lumineszenzmessungen wurden in Woche 3 ausgewertet). , 6 und 9 ohne 9-stündige Narkose). In jeder Versuchsreihe wurden die Messungen bei allen Mäusen zur gleichen Tageszeit durchgeführt. Zur hM3Dq-Aktivierung wurde allen Tieren 7 Stunden vor der Messung CNO-Lösung injiziert. Das Signal wurde 15 Minuten lang gemessen, nachdem 50 μl AkaLumine-HCl (60 mM) und Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert worden waren. Der interessierende Bereich (ROI) wurde unmittelbar über dem Halsmark platziert und die Spitzenintensität, die in den meisten Fällen nach etwa 10 Minuten beobachtet wurde, wurde aufgezeichnet. Die Messparameter waren wie folgt: in vitro; Belichtungszeit = 1 s, Binning = 8, Sichtfeld = 13,4 cm und Blende = 1; in vivo; Belichtungszeit = 60 s, Binning = 8, Sichtfeld = 23 cm und Blende = 1. Alle Bilder wurden mit der Living Image-Software (IVIS Imaging Systems, Version 4.5.5) verarbeitet und die Signalintensität wird ausgedrückt als Photonenzahl in der Einheit Photonen/Sekunde/cm2/Steradiant. Jedes Ergebnis wird als pseudofarbiges Photonenzählbild angezeigt, das einem anatomischen Graustufenbild überlagert ist.

Aus E17-Mausembryonen isolierte Hippocampus-Gewebe wurden in kleine Stücke zerlegt und mit 10 Einheiten/ml Papain (Nacalai Tesque, Tokio, Japan) und 0,01 % DNase I (Sigma-Aldrich) in PBS bei 37 °C 15 Minuten lang verdaut. Anschließend wurden Hippocampus-Neuronen (3 × 105 Zellen) auf Poly-L-Lysin-beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen in Neurobasal Plus-Medium, das B27 Plus und GlutaMAX enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden mit Lentivirus-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST auf DIV5 infiziert, mit TTX (1 µM, Tocris, Bristol, UK) auf DIV7 zum Schweigen gebracht und dann mit 4AP (250 µM, Tocris) und Bicucullin (50 µM) stimuliert , Sigma–Aldrich) in Abwesenheit von TTX für 10 Minuten auf DIV8 nach den Methoden früherer Studien13,76. Nach der Stimulation wurden die Neuronen erneut mit Medium, das 1 μM TTX enthielt, zum Schweigen gebracht, um eine längere Stimulation zu unterdrücken. Zu bestimmten Zeitpunkten (0, 2, 4, 6, 8, 10 und 24 Stunden nach kurzer Stimulation) wurden Biolumineszenzbilder mit dem IVIS Spectrum-System unmittelbar nach der Behandlung mit 300 µM AkaLumine-HCl aufgenommen.

Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Micro Kit (Qiagen, Inc., Hilden, Deutschland) extrahiert und die cDNA wurde durch reverse Transkription mit ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Co., Ltd., Life Science Department, Osaka, Japan) synthetisiert ). qPCR wurde mit einem Step One Plus-Gerät (Applied Biosystems, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Expressionsniveaus jedes Gens wurden unter Verwendung der vergleichenden ΔΔCT-Methode auf die von ACTB normalisiert. Wir verwendeten die folgenden hergestellten Primer (Thermo Fisher Scientific) gegen menschliche DNA-Sequenzen: FOS (Hs01119266_g1), ARC (Hs01045540_g1) und ACTB (Hs03023943_g1). Zusätzlich wurde EGFP (Mr00660654_cn) verwendet, um die Venus-Expression zu erkennen.

In vitro kultivierte Zellen wurden 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Alle Mäuse wurden 10 Wochen nach der Verletzung tief betäubt und transkardial mit 4 % PFA perfundiert. Gehirn und Rückenmark wurden präpariert und zwei Tage lang in 4 % PFA nachfixiert. Anschließend wurden die fixierten Rückenmarksstränge über Nacht bei 4 °C in 10 % Saccharose in 0,1 M PBS eingeweicht, gefolgt von 30 % Saccharose. Die präparierten Rückenmarks wurden in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura Finetek, Tokio, Japan) eingebettet und in der axialen Ebene mit einer Dicke von 12 μm auf einem Kryostaten (Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland) geschnitten. Die Proben wurden mit den folgenden Primärantikörpern gefärbt: Anti-GFP (Ziegen-IgG, 1:500, Rockland, PA, USA), Anti-mCherry (Kaninchen-IgG, 1:400, Abcam, Cambridge, UK), Anti-panembryonales Letal abnormal vision-like (ELAVL) (Maus-IgG1, 1:200, Sigma-Aldrich), Anti-GFAP (Kaninchen-IgG, 1:2000, Proteintech, IL, USA), Anti-APC (Maus-IgG2b, 1:300, Abcam ), Anti-Human-GFAP (Maus-IgG1, 1:2000, Takara Bio), Anti-CNPase (Maus-IgG1, 1:2000, Sigma–Aldrich), Anti-Ki-67 (Kaninchen-IgG, 1:2000, Leica Biosystems) , Anti-Nestin (Kaninchen-IgG, 1:200, IBL, Gunma, Japan), Anti-HNA (Maus-IgG1, 1:100, Millipore, Darmstadt, Deutschland), Anti-Fos (Kaninchen-IgG, 1:400, Abcam) , Anti-Human-Pan-ELAVL (Human-IgG, 1:1000, ein Geschenk von Dr. Robert Darnell, The Rockefeller University, NY, USA), Anti-Synaptophysin (Maus-IgM, 1:100, Millipore), Anti-Pan- AMPAR (Meerschweinchen, 1:500, Frontier Institute, Hokkaido, Japan) und Anti-STEM121 (Maus-IgG1, 1:200, Takara Bio). Die Kerne wurden mit Hoechst 33258 (10 μg/ml, Sigma-Aldrich) gefärbt. Alle Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (BZ-X710; Keyence, Osaka, Japan/THUNDER Imager Live Cell; Leica, Deutschland) oder einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 780; Carl Zeiss, Jena, Deutschland) aufgenommen.

Es wurden quantitative Analysen der Gewebeschnitte nach Rückenmarksverletzung und Transplantation durchgeführt35. Dreidimensionale Analysen des Venus+-Volumens (Transplantataktivität)/HNA+-Volumens (menschliche Zellen) wurden wie folgt durchgeführt. Von acht Tieren, die einer ESAL-transduzierten NS/PC-Transplantation und einer anterograden Markierung unterzogen wurden, wurden axiale Schnitte an vier Stellen (vier Mäuse wurden 7 Stunden nach der CNO-Verabreichung und vier Mäuse wurden ohne CNO getötet) sowie im Venus+-Bereich und im HNA+-Bereich angefertigt ermittelt mit ImageJ. Das Volumen wurde dann nach folgender Gleichung berechnet:

Dabei sind A1 und A2 die Flächen zweier aufeinanderfolgender Abschnitte und h der Abstand zwischen ihnen (480 μm).

Die Quantifizierung der Synapse zwischen CST-Axonen und transplantierten Neuronen wurde in Kombination mit einem benutzerdefinierten Makro unter Verwendung von ImageJ (Version 2.1.0/1.53.c) durchgeführt. Die Anzahl der präsynaptischen Marker (Synaptophysin), die mit mCherry-markierten CST-Axonterminals verschmolzen waren, die in den STEM121+-Bereich integriert waren, wurde gezählt.

Das detaillierte Verfahren zur Voreinbettung immunelektronenmikroskopischer Analysen wurde bereits beschrieben77. Kurz gesagt, gefrorene Rückenmarksschnitte auf Objektträgern wurden vor der Blockierungsbehandlung (5,0 % Block Ace [DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan] Lösung mit 0,01 % Saponin in 0,1 M PB) aufgetaut, getrocknet und in Citratsäurepuffer (pH 6,0) autoklaviert. . Die Proben wurden mit den Primärantikörpern Anti-GFP (Ziegen-IgG, 1:100, Rockland) und Anti-mCherry (Kaninchen-IgG, 1:100, Abcam) und den Sekundärantikörpern Anti-Kaninchen-Biotin (Esel-IgG, 1:800) gefärbt , Jackson ImmunoResearch, PA, USA). Nach dem Waschen mit PBS wurde Alexa Fluor 488 – FluorNanogold™-konjugierter Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG-Antikörper (1:100, Nanoprobes, NY, USA) vor der Färbung mit Hoechst 33258 aufgetragen. Wir verwendeten die folgenden Ergänzungen: ABC-Komplex (VECTASTAIN Elite ABC Kit; Vector, CA, USA), TSA Plus Biotin (NEL749A001KT; PerkinElmer, MA, USA), SA-Alexa Fluor 555 (1:1000, Thermo Fisher Scientific), SA-HRP (1:100, Vector) und 3,3 ′-Diaminobenzidin (DAB)-Tabletten (FUJIFILM Wako Pure Chemical). Ultradünne Schnitte (80 nm Dicke) wurden mit einem Diamantmesser hergestellt, auf Kupfernetzgittern (Nr. 100 oder Nr. 150 Veco, Nisshin EM, Tokio, Japan) gesammelt und 10 Minuten lang in Kunststoffröhrchen mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt jede. Die Schnitte wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEM-1400Plus, JEOL, Tokio, Japan) bei 100 keV untersucht.

Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger Student-t-Test verwendet. Für die Analyse der Daten in Abb. 2h und den ergänzenden Abb. 4a, c wurde eine ANOVA mit wiederholten Messungen verwendet. Für die Analyse der Daten in der ergänzenden Abbildung 2a – c wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen verwendet. Für alle statistischen Analysen wurden Unterschiede bei p < 0,05 als signifikant angesehen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für alle Berechnungen wurde SPSS Statistics (Japan IBM, Tokio, Japan. Ver. 26) verwendet. SAS-Software (SAS Institute, NC, USA, Version 9.4) wurde auch für die ANOVA mit wiederholten Messungen verwendet. Da es sich um eine explorative Studie handelte, verwendeten wir eine bescheidene Anzahl von Proben, die möglicherweise nicht ausreichend waren. Die entsprechende Stichprobengröße wurde mithilfe der CRAB SWOG Statistical Tools Calculators (https://stattools.crab.org) berechnet. Der primäre Endpunkt der Studie war die Veränderung der BLI-Photonenzahl des Transplantats von vor und nach der CST-Aktivierung 10 Wochen nach TP (Abb. 4l). Eine mit dem Datensatz in Abb. 4l durchgeführte Post-hoc-Leistungsanalyse ergab, dass n = 11 transplantierte Mäuse ausreichten, um den primären Endpunkt mit einer Leistung von 0,8 (einarmig normal) zu erreichen. Cohens d wurde berechnet, um die Effektgröße zu messen. Wir definieren die Effektgröße als groß, wenn der d-Wert >0,878,79 war. Die Stichprobengrößen der PBS-Gruppe und der Scheingruppe in der ergänzenden Abbildung 2 wurden vor der Studie bestimmt, wobei der Griffstärketest als primärer Endpunkt verwendet wurde. Die A-priori-Leistungsanalyse ergab, dass insgesamt n = 27 Mäuse mit einer Leistung von 0,8 (Zwei-Arm-Normal) ausreichend waren. Die IBB- und Horizontalleiteranalysen wurden als zweitrangig betrachtet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten wurden als ergänzende Daten 1 aufgenommen. Die übrigen Daten, die die Ergebnisse stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken S. Yamanaka von der CiRA (Universität Kyoto) für die Bereitstellung der menschlichen 414C2-iPSCs. Wir danken K. Tanaka von der Abteilung für Psychiatrie (Keio-Universität) für die technische und konzeptionelle Beratung. Wir danken HJ Okano und M. Hasegawa von der Abteilung für Regenerative Medizin (Jikei University) für ihre Unterstützung bei den Experimenten. Wir danken Y. Sato und K. Nagashima vom Department of Preventive Medicine and Public Health (Keio University) für statistische Beratung. Wir sind dankbar für die Unterstützung von H. Miyoshi, S. Nori, O. Tsuji, S. Ito, Y. Hoshino, Y. Tanimoto, T. Shibata, S. Hashimoto, Y. Suematsu, Y. Saijyo, T. Nishijima , T. Tanaka, K. Ito, L. Tao und K. Nakanishi, die alle Mitglieder des Rückenmarksforschungsteams an der Abteilung für orthopädische Chirurgie und Physiologie (Keio-Universität) sind. Wir danken auch T. Harada, K. Yasutake und M. Akizawa für ihre Unterstützung bei den Experimenten und der Tierpflege. Diese Arbeit wurde von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) unterstützt (Zuschuss-Nr. JP20bm0204001, JP19bm0204001, JP20bk0104017 und JP19bk0104017 für HO und MN; Zuschuss-Nr. JP20bm0704046 für SS und TS; Zuschuss-Nr. JP18dm0207036 nach HB), die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (KAKENHI-Zuschussnummer 22H03205 an NN; 17H06312 an HB) und die General Insurance Association of Japan (Medical Research Grant 2018 an KA)

Abteilung für orthopädische Chirurgie, Keio University School of Medicine, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japan

Kentaro Ago, Narihito Nagoshi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Keita Kajikawa, Reo Shibata, Yasuhiro Kamata, Kota Kojima, Morio Matsumoto und Masaya Nakamura

Abteilung für Physiologie, Keio University School of Medicine, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japan

Kentaro Ago, Kent Imaizumi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Munehisa Shinozaki, Takahiro Kondo, Jun Kohyama und Hideyuki Okano

Labor für Zellfunktion und -dynamik, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japan

Satoshi Iwano und Atsushi Miyawaki

Labor für molekulare Analyse höherer Gehirnfunktionen, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japan

Masanari Ohtsuka

Abteilung für Neurochemie, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japan

Haruhiko Bito

Abteilung für virale Vektorentwicklung, National Institute for Physiological Sciences, 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8585, Japan

Kenta Kobayashi

Abteilung für mikroskopische Anatomie, Graduiertenschule für medizinische und zahnmedizinische Wissenschaften, Universität Niigata, 1-757 Asahimachi-dori, Chuo-ku, Niigata, Niigata, 951-8510, Japan

Shinsuke Shibata

Elektronenmikroskoplabor, Medizinische Fakultät der Keio-Universität, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japan

Shinsuke Shibata und Tomoko Shindo

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KA, NN, KI, T. Kondo, MS, SS, JK, MM, MN und HO haben die Experimente entworfen. KA, T. Kitagawa, MK, K. Kajikawa, RS, YK, KK und TS führten die Experimente durch. SI, AM, MO, HB und K. Kobayashi stellten die Plasmide oder viralen Vektoren her. KA und alle anderen Autoren haben das endgültige Manuskript erstellt.

Korrespondenz mit Narihito Nagoshi oder Hideyuki Okano.

MN erklärt eine Beraterrolle bei K-Pharma und Forschungsfinanzierung von RMic, Hisamitsu. HO erklärt eine Führungsposition an der Keio University Graduate School of Medicine und ist ein vergüteter wissenschaftlicher Berater für San Bio Co., Ltd und K Pharma Inc. Alle anderen Autoren geben an, keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu haben.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ivo Lieberam, Anam Akhtar und Karli Montague-Cardoso.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ago, K., Nagoshi, N., Imaizumi, K. et al. Ein nicht-invasives System zur In-vivo-Überwachung der Aktivität neuronaler Transplantate nach einer Rückenmarksverletzung. Commun Biol 5, 803 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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Eingegangen: 12. September 2021

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 10. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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