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Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6909 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Aufkommen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Isolaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, mehr Antibiotika zu entwickeln. ClpP ist eine hochkonservierte Protease, die durch ATPasen in Bakterien und Mitochondrien reguliert wird. Die fehlerhafte Aktivierung von bakteriellem ClpP ist eine alternative Methode zur Entdeckung von Antibiotika, während es weiterhin schwierig ist, selektive Staphylococcus aureus ClpP-Aktivatoren zu entwickeln, die eine Störung der ClpP-Funktionen des Homo sapiens vermeiden können. Hier verwenden wir ein strukturbasiertes Design, um (R)- und (S)-ZG197 als hochselektive Staphylococcus aureus ClpP-Aktivatoren zu identifizieren. Die Schlüsselstrukturelemente im Homo sapiens ClpP, insbesondere W146 und seine gemeinsame Wirkung mit dem C-terminalen Motiv, tragen wesentlich zur Unterscheidung der Aktivatoren bei. Unsere selektiven Aktivatoren zeigen in vitro umfassende antibiotische Eigenschaften gegenüber einer Reihe multiresistenter Staphylokokkenstämme und zeigen eine vielversprechende antibiotische Wirksamkeit in Hautinfektionsmodellen von Zebrafischen und Mäusen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die artspezifischen Aktivatoren von Staphylococcus aureus ClpP interessante therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung von Staphylokokkeninfektionen sind.

Staphylococcus aureus (S. aureus) besiedelt die Haut und Nasenlöcher des Menschen und verursacht häufig invasive und lebensbedrohliche Krankheiten1. Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) ist für viele im Krankenhaus erworbene Infektionen verantwortlich, darunter Infektionen der Operationsstelle, Bakteriämie und Sepsis2. MRSA hat eine Multiresistenz gegen viele Antibiotika entwickelt, darunter β-Lactam, Cephalosporin, Fluorchinolon, Aminoglycosid, Tetracyclin, Makrolid und Trimethoprim-Sulfamethoxazol3. Aufgrund dieser Resistenz führt die Antibiotikaprophylaxe von MRSA-Infektionen häufig zu nosokomialen Erkrankungen wie der Clostridium-difficile-Infektion4. Angesichts des schwindenden Angebots an wirksamen Antibiotika wird es immer wichtiger, neue Methoden zur Behandlung multiresistenter MRSA-Infektionen zu entwickeln5. Zu diesem Zweck ist die Entwicklung von Antistaphylokokken-Wirkstoffen, insbesondere solchen mit einer anderen Wirkweise, dringend erforderlich, um zukünftige Behandlungen für MRSA-Infektionen bereitzustellen6,7,8,9,10,11.

Caseinolytische Protease P (ClpP) ist eine hochkonservierte Protease, die durch ATPasen in Bakterien und menschlichen Mitochondrien reguliert wird und eine wichtige Rolle bei der Proteinqualitätskontrolle spielt, indem sie fehlgefaltete oder beschädigte Proteine ​​reguliert und abbaut12,13. In Bakterien ist ClpP für die Modulation der Expression von Virulenzfaktoren, der Antibiotikaresistenz und der Bildung von Biofilmen und Persistern verantwortlich14,15,16,17. Ebenso ist Homo sapiens ClpP (HsClpP), das in den Mitochondrien vorkommt, eine Schlüsselprotease, die die Homöostase mitochondrialer Proteine ​​reguliert. Diese Proteine ​​sind hauptsächlich an Atmungskettenkomplexen beteiligt18. Die fehlregulierte Expression oder Gewebeverteilung von HsClpP ist stark mit Krankheiten wie Krebs und neurologischen Störungen verbunden19,20.

Die Dysfunktion von ClpP durch kleine Molekülaktivatoren hat sich kürzlich als mögliche Methode zur Entdeckung antibakterieller und krebsbekämpfender Medikamente erwiesen21. Bemerkenswerterweise wurden Acyldepsipeptide (ADEPs) als vielversprechende Klasse von Antibiotika identifiziert, was zeigt, dass bakterielles ClpP ein mögliches Ziel für Antibiotika-Wirkstoffe ist22,23. Diese natürlich vorkommenden Aktivatoren versetzen S. aureus ClpP (SaClpP) allosterisch in einen Funktionsgewinnzustand, um mehrere essentielle Proteine ​​wie das filamentöse temperaturempfindliche Z (SaFtsZ) abzubauen, was die Zellteilung hemmt und schließlich zum Tod von Bakterienzellen führt24 ,25. Darüber hinaus unterdrückt ADEP 4 das Wachstum von Persistern und beseitigt eine chronische Biofilminfektion in Kombination mit vermarkteten Antibiotika23, was darauf hindeutet, dass die therapeutische Anwendung von ADEPs in einer Kombinationstherapie genutzt werden kann. Allerdings könnten die Probleme der chemischen Instabilität von ADEP-Analoga die Anwendungen der Antibiotika-Wirkstoffforschung erheblich einschränken26. Die Entdeckung von ADEPs als bakterielle ClpP-Aktivatoren hat Studien zu HsClpP inspiriert. Durch die fehlerhafte Aktivierung der HsClpP-Proteaseaktivität werden mehrere Proteine ​​im Atmungskettenkomplex erheblich abgebaut, was zu einer Antitumorwirkung führt27. Bemerkenswert ist, dass ADEP-28, ein Analogon von ADEP 4, HsClpP aktiviert und zytotoxische Wirkungen hervorruft, indem es die intrinsische, Caspase-abhängige Apoptose aktiviert28. Darüber hinaus aktivieren Imipridon ONC201 und ONC212 die HsClpP-Protease und erleichtern die ClpP-vermittelte Proteolyse, was zur Letalität von Krebszellen führt27,29. ONC212 fungiert auch als Antibiotikum, das in biochemischen und genetischen Tests ClpPs aus Escherichia coli, Bacillus subtilis und S. aureus aktiviert und schließlich die Proliferation von Bakterienzellen unterdrückt30. Kürzlich haben wir herausgefunden, dass ONC212 und ADEP 4 XooClpP fehlregulieren, um XooFtsZ abzubauen, was auf eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Krautfäule-Erkrankungen hindeutet31. Andere Aktivatoren wie Bengamid-Analoga und Aktivatoren selbstkompartimentalisierender Proteasen (ACPs) zeigen ebenfalls bestimmte Aktivitäten auf ClpP32,33,34. Allerdings gibt es bisher keinen artspezifischen Aktivator für die SaClpP-Protease.

In dieser Studie berichten wir über zwei hochselektive SaClpP-Aktivatoren, (R)- und (S)-ZG197, die selektiv SaClpP anstelle von HsClpP aktivieren. Darüber hinaus weist (R)-ZG197 ein breites Spektrum antibiotischer Eigenschaften gegenüber einer Reihe von MRSA-Stämmen auf und zeigt eine vielversprechende antibiotische Wirksamkeit in vivo.

Da ADEP 4 und ONC212 globale Aktivatoren für ClpP-Proteasen sind (ergänzende Abbildung 1a), ist es unser Ziel, niedermolekulare Aktivatoren zu entwickeln, die die SaClpP-Proteaseaktivität gegenüber HsClpP selektiv steigern (Abbildung 1a). Angesichts der etablierten Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von ADEP 4 und ONC212 als ClpP-Aktivatoren29,35,36,37,38 suchen wir nach unterschiedlichen chemischen Gerüsten als selektive Aktivatoren für SaClpP. Zu diesem Zweck führten wir ein Hochdurchsatz-Screening (HTS) an einer Substanzbibliothek mit 3.896 Kandidaten durch. Es wurde bestätigt, dass ICG-001 die Hydrolyse des mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Caseins (FITC-Casein) in Gegenwart von SaClpP fördert (ergänzende Abbildungen 1b und 1c). ICG-001 wurde ursprünglich als Inhibitor des Wnt-Signalwegs charakterisiert, während es kürzlich als Aktivator für HsClpP39,40 untersucht wurde. In Anbetracht des unterschiedlichen Gerüsts von ICG-001 und der praktikablen Synthese von Derivaten wählten wir ICG-001 als Ausgangspunkt für die anschließende Syntheseoptimierung41. Der Einbau des Isoleucinfragments und des 4,4,4-Trifluorbutylmotivs in das Kerngerüst von ICG-001 lieferte einen wirksamen ClpP-Aktivator ZG180 (Abb. 1b). ZG180 aktiviert SaClpP für die α-Casein-Hydrolyse wirksamer als ICG-001, was durch eine dreifache Abnahme von EC50 belegt wird (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1d). ZG180 fördert jedoch auch HsClpP für die α-Casein-Hydrolyse (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1e), was darauf hinweist, dass ZG180 auch ein globaler Aktivator sowohl für bakterielle als auch mitochondriale ClpP-Proteine ​​ist.

a Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung selektiver SaClpP-Aktivatoren. b Die synthetische Leitverbindung ZG180 als ClpP-Aktivator. c Quantifizierung der α-Casein-Hydrolyse durch SaClpP und HsClpP in Gegenwart von ICG-001 bzw. ZG180 (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (Fehlerbalken) dargestellt. Röntgenkristallstruktur der Komplexe ZG180/SaClpP (d) und ZG180/HsClpP (e). Gezeigt werden Seiten- und Draufsichten der Baukomplexe. SaClpP wird in einer grauen Cartoon-Röhre gezeigt, HsClpP wird in einer Weizen-Cartoon-Röhre gezeigt und ZG180 wird in einer cyanfarbenen Kugel gezeigt. f, g Die Elektronendichtekarten und Nahansicht der ZG180-Bindung in den hydrophoben Taschen von SaClpP (f) und HsClpP (g). Die fo-fc-Auslassungskarte ist bei 3,0 Å konturiert und in Grün eingefärbt, während die 2fo-fc-Karte bei 1,0 Å konturiert und in Magenta eingefärbt ist. ZG180 ist in Cyan-Stick dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen sind mit dunklen gestrichelten Linien dargestellt und der Abstand in Å ist angegeben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den molekularen Mechanismus unserer durch Aktivatoren geförderten Proteolyse von ClpP-Proteasen zu untersuchen, haben wir die Kristallstruktur von ZG180, gebunden an SaClpP (7WID in PDB) und HsClpP (7WH5 in PDB), mit einer Auflösung von 1,90 Å bzw. 2,13 Å aufgelöst (Ergänzung). Tabelle 1). Die ZG180/SaClpP- oder die ZG180/HsClpP-Struktur ist ein einzelnes Tetradecamer, das aus zwei gestapelten heptameren Ringen besteht (Abb. 1d, e). Wie bei den zuvor charakterisierten ClpP-Aktivatoren induziert die Bindung von vierzehn ZG180-Molekülen einen Zustand mit offenem Tor in den tetradekameren ClpP-Zylindern mit einer Eingangspore mit vergrößerter Achse42,43,44,45. Die scheinbaren Elektronendichten in den 2fo-fc- und fo-fc-Omit-Karten belegen eindeutig die Bindung von ZG180 an der apikalen Oberfläche von SaClpP und HsClpP (Abb. 1f, g). Das Naphthylmotiv und die Trifluorbutylkette in ZG180 bilden eine hydrophobe Stapelung in den Bindungstaschen von SaClpP, was zu den verstärkten Wechselwirkungen beiträgt. Ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ZG180 und den Seitenketten von D27, L49, Q52, Y61 und Q89 erhöht gemeinsam die Bindungsaffinität zu SaClpP (Abb. 1f). Eine ähnliche Bindungsweise wird in der ZG180/HsClpP-Struktur beobachtet (Abb. 1g). Diese Strukturmerkmale ähneln den zuvor berichteten Strukturkomplexen von SaClpP und HsClpP, gebunden an kleine Molekülaktivatoren, wie ADEP 4/SaClpP, ADEP-28/HsClpP und ONC201/HsClpP27,28,35, in denen alle Aktivatormoleküle enthalten sind sind ebenfalls in den hydrophoben Taschen positioniert und verhindern die Bindung der ATPase an ClpP.

Um einen spezifischen Aktivator für SaClpP gegenüber HsClpP zu entwerfen, haben wir die Aminosäuresequenzen analysiert, die den Bindungsmodus von ZG180 in zwei ClpP-Proteinen beeinflussen können. Während SaClpP und HsClpP in den Primärsequenzen eine hohe Ähnlichkeit aufweisen (ergänzende Abbildung 2a), gibt es in HsClpP ein großes Indolmotiv von W146, in SaClpP jedoch eine viel kleinere Isopropylseitenkette von I91 in der konservierten Position. Tatsächlich zeigt die strukturelle Überlagerung der ZG180/SaClpP- und ZG180/HsClpP-Komplexe auch, dass der α-Kohlenstoff des Naphthylmotivs in ZG180 wahrscheinlich eine diskriminierende Stelle für die Einführung sterischer Konflikte mit der sperrigen Seitenkette von W146 in HsClpP ist (Abb. 2a). Zu diesem Zweck haben wir eine Methylgruppe in ZG180 eingebaut, um zwei Naphthalin-1-ylmethyl-Analoga (R)- und (S)-ZG197 zu erhalten (Abb. 2b). Ähnlich wie ZG180 aktivieren sowohl (R)-ZG197 als auch (S)-ZG197 SaClpP, um α-Casein und SaFtsZ in vitro abzubauen (Abb. 2c, ergänzende Abb. 2b, c). Im Gegensatz zum nichtselektiven ZG180-Aktivator aktiviert (R)-ZG197 SaClpP mit einem EC50-Wert von 1,5 μM, was eine 20-fach höhere Aktivität als die Aktivierung von HsClpP darstellt, während (S)-ZG197 HsClpP selbst bei 100 μM nicht aktiviert (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2d). Darüber hinaus fördern sowohl (R)-ZG197 als auch (S)-ZG197 den Abbau des zellulären SaFtsZ-Proteins in Zelllysaten des clpP-Knockout-Stamms (ΔclpP) S. aureus 8325-4 mit der Ergänzung des rekombinanten SaClpP-Proteins, jedoch keinen SaFtsZ-Abbau trat in Gegenwart des rekombinanten HsClpP-Proteins auf. Im Gegensatz dazu aktiviert der globale Aktivator ONC212 sowohl SaClpP als auch HsClpP, um das zelluläre SaFtsZ-Protein abzubauen (Abb. 2d). Zusammenfassend ist es uns mithilfe eines strukturbasierten Designs gelungen, die artspezifischen SaClpP-Aktivatoren (R)- und (S)-ZG197 zu entwickeln, die die Aktivität des mitochondrialen ClpP in vitro nur minimal stören.

a Strukturelle Überlagerung der Komplexe ZG180/SaClpP und ZG180/HsClpP, um die Strategie für die Entwicklung selektiver Aktivatoren für SaClpP gegenüber HsClpP aufzudecken. SaClpP und HsClpP werden in grauen bzw. weizenfarbenen Cartoon-Röhren dargestellt. ZG180 ist in der ZG180/SaClpP-Struktur cyanfarben, während es in der ZG180/HsClpP-Struktur gelb gefärbt ist. I91 in SaClpP und W146 in HsClpP sind als Stäbchen dargestellt. b Strukturen der SaClpP-Aktivatoren (R)- und (S)-ZG197, entwickelt durch das in (a) beschriebene strukturbasierte Design. Die chirale Methylgruppe ist rot markiert. c Quantifizierung der α-Casein-Hydrolyse durch SaClpP und HsClpP in Gegenwart von (R)- bzw. (S)-ZG197 (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (Fehlerbalken) dargestellt. d Wirkung von Aktivatoren auf den Abbau des zellulären SaFtsZ-Proteins mit der Ergänzung von Rinderserumalbumin (BSA), dem rekombinanten SaClpP bzw. HsClpP in Zelllysaten der clpP-Deletionsmutante (ΔclpP). Die Häufigkeit zellulärer SaFtsZ wird mit einem Western-Blot-Assay quantifiziert. Die Quantifizierung der Bandenintensität von SaFtsZ wird gegen die Beladungskontrolle von SaGAPDH normalisiert, und das Verhältnis in der DMSO-Gruppe wird mit 1,0 angenommen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu erklären, warum unsere Aktivatoren in vitro selektiv SaClpP anstelle von HsClpP aktivieren, haben wir die direkten Wechselwirkungen zwischen (R)- oder (S)-ZG197-Verbindungen und den beiden ClpP-Proteasen gemessen. Während der Differential Scanning Fluorimetry (DSF)-Analyse erhöht (R)-ZG197 die thermische Stabilität von SaClpP dosisabhängig deutlich, während es einen schwachen Einfluss auf HsClpP hat (Abb. 3a). Dies weist darauf hin, dass (R)-ZG197 eine stärkere Bindungsaffinität für SaClpP als HsClpP aufwies. In ähnlicher Weise erhöht (S)-ZG197 die Schmelztemperatur (Tm) von SaClpP, verändert jedoch kaum die Tm von HsClpP (Abb. 3b). Anschließend führten wir einen isothermen Titrationskalorimetrietest (ITC) durch, um die Stöchiometrien der Bindungskapazität zu bestimmen. Die Dissoziationskonstante (Kd) für die Bindung von (R)- und (S)-ZG197 an SaClpP wird quantitativ auf 2,5 ± 0,2 μM bzw. 5,0 ± 0,3 μM geschätzt (Abb. 3c). Wir haben auch die Bindung unserer Aktivatoren an SaClpP und HsClpP in der Biolayer-Interferometrie (BLI) analysiert. Ebenso weisen (R)- und (S)-ZG197 einen Kd von 58 ± 4,8 nM bzw. 470 ± 60 nM für die Bindung an SaClpP auf (ergänzende Abbildung 3a). Allerdings zeigen weder (R)-ZG197 noch (S)-ZG197 in der BLI-Analyse eine nachweisbare Bindungsaffinität zu HsClpP (ergänzende Abbildung 3b). Dies weist darauf hin, dass unsere Aktivatoren in vitro selektiv an SaClpP und nicht an HsClpP binden.

Einfluss von (R)- (a) und (S)-ZG197 (b) auf die thermische Stabilität von SaClpP bzw. HsClpP im DSF-Assay. Tm, Schmelztemperatur. c Bestimmung der Bindung von (R)- und (S)-ZG197 an SaClpP durch ITC-Titration. Die Dissoziationskonstante (Kd) und der Stöchiometriefaktor (N) sind angegeben. Einfluss von Aktivatoren auf die thermische Stabilität des zellulären SaClpP (d) bzw. HsClpP (e). Der S. aureus 8325-4 wurde in Gegenwart von 10 μM Verbindung 2 Stunden lang kultiviert, bevor CETSA (d) ausgeführt wurde, während Zelllysate von HEK 293 T/17 in CETSA (e) untersucht wurden. Die Proteine ​​in nicht erhitzten Proben werden als Input verwendet und als 100 % betrachtet. Die Daten (a, b, d und e) stammen aus drei biologisch unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SD (Fehlerbalken) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir, ob unsere Aktivatoren direkt mit SaClpP in Staphylokokkenzellen interagieren, indem wir den zellulären thermischen Verschiebungstest (CETSA) durchführten. Wir beobachteten eine signifikant erhöhte thermische Stabilität von SaClpP, wenn der Stamm S. aureus 8325-4 mit 10 μM (R)- oder (S)-ZG197 kultiviert wurde (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3c). Eine ähnliche Erhöhung von SaClpP Tm trat auf, wenn Bakterienzellen mit ONC212 behandelt wurden. Dies weist darauf hin, dass unsere selektiven Aktivatoren und der globale Aktivator ONC212 direkt an die SaClpP-Protease in Staphylokokkenzellen binden können. Wir haben auch CETSA in der Zelllinie HEK 293T/17 durchgeführt, um zu testen, ob unsere Aktivatoren an HsClpP binden. Ähnlich wie DMSO haben (R)- und (S)-ZG197 nur minimale Auswirkungen auf die thermische Stabilität von HsClpP in HEK 293 T/17-Zellen, während ONC212 die HsClpP-Stabilität signifikant erhöhte (Abb. 3e und ergänzende Abb. 3d). Daher verdeutlichen die Ergebnisse des zellulären Bindungstests direkte und selektive Wechselwirkungen unserer Aktivatoren mit SaClpP, jedoch nicht mit HsClpP im zellulären Kontext, was den Ergebnissen der biophysikalischen In-vitro-Bindungstests ähnelt.

Um den strukturellen Einblick in den Mechanismus der selektiven Aktivierung von (R)- und (S)-ZG197' bei der SaClpP-Proteolyse zu gewinnen, haben wir die Röntgenkristallstrukturen von (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ in PDB) und (S )-ZG197/SaClpP (7WGS in PDB)-Komplexe mit einer Auflösung von 2,15 Å bzw. 2,11 Å (Ergänzungstabelle 1). Die aufgelösten Strukturen zeigen, dass zwölf (R)-ZG197- oder vierzehn (S)-ZG197-Aktivatoren in den vierzehn hydrophoben Taschen von SaClpP binden (ergänzende Abbildung 4a), und die Elektronendichtekarten zeigen deutlich die Existenz von (R)- und ( S)-ZG197 (Abb. 4a, b). Die Naphthylmotive von (R)- und (S)-ZG197 zeigen aufgrund der chiralen Methylsubstituenten in unterschiedliche Richtungen. Die Carbonylgruppe sowohl in (R)- als auch in (S)-ZG197 bildet eine Wasserstoffbrücke mit H83 von SaClpP, und die Seitenkette von Q52 bildet auch eine Wasserstoffbrücke mit (R)-ZG197 direkt oder vermittelt durch (S)-ZG197 ein Wassermolekül. Zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen, die durch die Seitenketten von D27 und L49 vermittelt werden, tragen gemeinsam zur Bindung von (S)-ZG197 an SaClpP bei (Abb. 4a, b). Darüber hinaus werden umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen an (R)- und (S)-ZG197 in Ligandenbindungsstellen von SaClpP beobachtet (ergänzende Abbildung 4b). Die strukturelle Ausrichtung von SaClpP (6TTY in PDB), ADEP 4/SaClpP (6TTZ in PDB), (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ in PDB) und (S)-ZG197/SaClpP (7WGS in PDB) ergibt einen niedrigen Cα-Wurzelmittelwert Quadratabweichungswerte (RMSD) um 0,2 Å für ClpP-Monomer, was auf eine hohe Ähnlichkeit der ClpP-Faltung hinweist (ergänzende Abbildung 4c) 43, 46, 47. Wie der globale Aktivator ADEP 4 induzieren (R)- und (S)-ZG197-Bindungen einen erweiterten Zustand von SaClpP, der durch eine gerade Ausrichtung der α5-Helix26 gekennzeichnet ist. Darüber hinaus wird die katalytische Triade (S98, H123 und D172) in diesen Strukturen auch in sehr ähnlichen Ausrichtungen angezeigt (ergänzende Abbildung 4d). Interessanterweise sind in den Strukturkomplexen von (R)- und (S)-ZG197/SaClpP nur vier oder fünf der vierzehn N-terminalen Schleifen geordnet, was auf die hochdynamische Natur dieser Motive bei der Bindung von Aktivatoren schließen lässt.

Nahansicht der Wechselwirkungen von (R)- (a) und (S)-ZG197 (b) an der hydrophoben Stelle von SaClpP. Die fo-fc-Auslassungskarte zur Darstellung der (R)- und (S)-ZG197-Bindung ist bei 3,0 Å konturiert und grün gefärbt, während die 2fo-fc-Karte bei 1,0 Å konturiert und jeweils magentafarben ist. (R)- und (S)-ZG197 sind hellrosa bzw. hellblau gefärbt. Wasserstoffbrückenbindungen sind durch dunkle gestrichelte Linien dargestellt und der Abstand ist in Å angegeben. c Detailansicht der strukturellen Ausrichtungen von (R)- und (S)-ZG197, gebunden an SaClpP-Komplexe, und ZG180, gebunden an HsClpP in den hydrophoben Taschen. ZG180, (R)- und (S)-ZG197 sind in Cyan, Hellrosa bzw. Hellblau gefärbt. SaClpP ist grau gefärbt, während HsClpP weizenfarben ist. d Quantifizierung der α-Casein-Hydrolyse durch die SaClpPI91W-Mutante in Gegenwart von (R)-ZG197, (S)-ZG197 bzw. ONC212. e Einfluss von Aktivatoren auf die thermische Stabilität des im DSF-Assay nachgewiesenen SaClpPI91W-Proteins. f Repräsentative Western-Blot-Bilder, die die Auswirkungen von 10 μM Aktivatoren auf die thermische Denaturierung des SaClpPI91W-Proteins in intakten Zellen des komplementierten clpPI91W-Mutantenstamms zeigen. Die SaClpPI91W-Expression wurde in Gegenwart von wasserfreiem Tetracyclin (ATC) in einer Konzentration von 1 ng/ml induziert. Für jedes Experiment wurden drei biologische Replikate durchgeführt. g Quantifizierung der durch ClpP-Aktivatoren geförderten Hydrolyse von α-Kasein durch die HsClpPW146A-Mutante. h Wirkung von Aktivatoren auf die thermische Stabilität der im DSF-Assay nachgewiesenen HsClpPW146A-Mutante. i Eine genaue Betrachtung der strukturellen Ausrichtung in (c) zeigt die Wirkung der C-terminalen Reste auf die Bindung der Aktivatoren und die Aktivierung von HsClpP. j Quantifizierung der Wirkung der durch Aktivatoren aktivierten α-Casein-Hydrolyse durch die Verkürzungen HsClpPΔC (links) bzw. HsClpPW146AΔC (rechts). k Einfluss von Aktivatoren auf die thermische Stabilität von HsClpPΔC (links) und HsClpPW146AΔC (rechts), nachgewiesen im DSF-Assay. Die Daten (d, e, g, h, j und k) wurden aus drei biologisch unabhängigen Experimenten erhalten und als Mittelwert dargestellt ± SD (Fehlerbalken). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Strukturmechanismus zu verstehen, der dazu führt, dass (R)- und (S)-ZG197 selektiv an SaClpP binden und dieses aktivieren, nicht jedoch an HsClpP, haben wir unsere aufgelösten Strukturen von (R)-ZG197/SaClpP und (S)-ZG197/SaClpP daran ausgerichtet die ZG180/HsClpP-Struktur. Die Naphthylgruppe in (S)-ZG197 ist im Vergleich zu der in ZG180 und (R)-ZG197 in entgegengesetzter Richtung positioniert, was zu einer direkten Kollision mit der Seitenkette von W146 in HsClpP führt. Dies kann die Bindung von (S)-ZG197 an HsClpP in einem ähnlichen Modus wie SaClpP einschränken (Abb. 4c). Obwohl die Naphthylgruppe in (R)-ZG197 von der Seitenkette von W146 in HsClpP entfernt positioniert ist, kann der Methylsubstituent in (R)-ZG197 eine räumliche Behinderung erzeugen und mit W146 in HsClpP kollidieren, was wahrscheinlich erklärt, warum (R )-ZG197 kann nicht mit HsClpP interagieren. Die Strukturausrichtungsanalyse legt nahe, dass I91 in SaClpP und W146 in HsClpP in erster Linie kritische Stellen sind, die für die selektive Bindung und Aktivierung unserer Aktivatoren an SaClpP, nicht jedoch an HsClpP, verantwortlich sind.

Um zu veranschaulichen, wie I91 die Bindung unserer Aktivatoren an SaClpP beeinflusst, konstruierten wir eine I91W-Mutante in SaClpP, um das entsprechende W146 in HsClpP nachzuahmen, und bestimmten, ob (R)- und (S)-ZG197 an die SaClpPI91W-Mutante binden und diese aktivieren. Wie vorhergesagt, zeigt (S)-ZG197 eine deutlich verminderte Aktivität auf die SaClpPI91W-Mutante für die α-Casein-Hydrolyse, während (R)-ZG197 und ONC212 SaClpPI91W weiterhin aktivieren, um α-Casein in vitro abzubauen (Abb. 4d und ergänzende Abb. 4e). ). Als nächstes untersuchten wir die Wechselwirkungen zwischen ClpP-Aktivatoren und der SaClpPI91W-Mutante in DSF. In Übereinstimmung mit der biochemischen Beobachtung kann (S)-ZG197 die SaClpPI91W-Mutante thermisch nicht stabilisieren, während (R)-ZG197 und ONC212 die Tm der SaClpPI91W-Mutante immer noch signifikant erhöhen (Abb. 4e). Anschließend haben wir die Affinität von (R)-ZG197 für die Bindung an SaClpPI91W quantitativ bestimmt und der Kd beträgt im ITC-Assay 0,93 ± 0,2 μM. Zwischen (S)-ZG197 und SaClpPI91W wurde keine Bindung beobachtet (ergänzende Abbildung 4f). Es ist zu beachten, dass (R)-ZG197 auf der SaClpPI91W-Mutante immer noch positiv ist. Dies ist auf den Methylsubstituenten in (R)-ZG197 zurückzuführen, der zur hydrophoben Affinität zu W91 in der SaClpPI91W-Mutante beitragen kann, während er in HsClpP wahrscheinlich mit W146 kollidiert (Abb. 4c). Eine aufgeklärte Struktur des (R)-ZG197/SaClpPI91W-Komplexes wäre hilfreich für die Aufklärung des Mechanismus dieses Phänomens. Darüber hinaus konstruierten wir den komplementierten clpPI91W-Mutantenstamm über einen Tetracyclin-induzierbaren Expressionsvektor pYJ335 in der ΔclpP-Mutante (ergänzende Abbildung 4g) und bewerteten die zellulären Wechselwirkungen zwischen den Aktivatoren und der SaClpPI91W-Mutante im komplementierten Stamm. In Übereinstimmung mit den beobachteten Wechselwirkungen in vitro induziert die Behandlung mit (S)-ZG197 die Tm-Verschiebung von SaClpPI91W in intakten Staphylokokkenzellen nicht, während (R)-ZG197 und der globale Aktivator ONC212 starke Auswirkungen auf die Stabilisierung von SaClpPI91W zeigen (Abb. 4f und). Ergänzende Abbildung 4h).

Wir haben auch die HsClpPW146A-Mutante konstruiert, um zu testen, ob der vorgeschlagene sterische Konflikt zwischen unseren Aktivatoren und der starren Seitenkette von W146 ihre Bindung an HsClpP einschränkt. Im Gegensatz zu der Beobachtung, dass (R)-ZG197 auf HsClpP inaktiv ist, wird (R)-ZG197 aktiv, um die HsClpPW146A-Mutante für die α-Casein-Hydrolyse zu fördern (Abb. 4g und ergänzende Abb. 4i) und zeigt eine Bindungsaffinität gegenüber HsClpPW146A gemessen im DSF-Assay (Abb. 4h). ONC212 bindet in vitro immer an HsClpP und die W146A-Mutante und aktiviert diese. Da (S)-ZG197 jedoch nicht an HsClpPW146A bindet und dieses aktiviert, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass andere Strukturfaktoren die Wechselwirkung von (S)-ZG197 und der HsClpP-Mutante abschwächen. Zuvor wurde vermutet, dass das zusätzliche Motiv im C-Terminus von HsClpP die Bindung des ClpX-Chaperons stört48. Insbesondere stellten wir fest, dass die P248- und P249-Reste ein Deckelmotiv bilden könnten, das die Annäherung und Bindung von Aktivatoren an die hydrophoben Stellen von HsClpP behindern könnte (Abb. 4i). Dieses zusätzliche Deckelmotiv in HsClpP ist auch in anderen eukaryotischen ClpPs konserviert, wie Mus Musculus ClpP (MoClpP) und Danio Rerio ClpP (DaClpP). Diese C-terminale Sequenz ist jedoch verkürzt und das entsprechende Deckelmotiv fehlt in den bakteriellen ClpPs wie SaClpP und Escherichia coli ClpP (EcClpP) (ergänzende Abbildung 2a).

Anschließend haben wir die C-terminal verkürzten Proteine ​​HsClpP (HsClpPΔC) und HsClpPW146A (HsClpPW146AΔC) gereinigt und die Auswirkungen unserer Aktivatoren auf die beiden Verkürzungen nachgewiesen. Ähnlich wie die schwachen Wirkungen auf HsClpPW146A aktiviert (S)-ZG197 HsClpPΔC in vitro immer noch minimal und stabilisiert es kaum (Abb. 4j und k sowie ergänzende Abb. 4j). (S)-ZG197 wird jedoch aktiv, um die HsClpPW146AΔC-Mutante für die α-Casein-Hydrolyse zu fördern, und zeigt eine in DSF gemessene Bindungsaffinität (Abb. 4j und k sowie ergänzende Abb. 4k), was auf die gemeinsame Wirkung von W146 und dem C-terminalen Motiv hinweist in HsClpP. Interessanterweise weisen sowohl (R)-ZG197 als auch ONC212 im Vergleich zu HsClpPW146A und HsClpPΔC verbesserte Fähigkeiten zur Bindung und Aktivierung von HsClpPW146AΔC auf (Abb. 4j und k und ergänzende Abb. 4k). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die beiden unterschiedlichen Aminosäuren (I91 in SaClpP und W146 in HsClpP) in den hydrophoben Taschen und das zusätzliche C-terminale Deckelmotiv in HsClpP entscheidende Faktoren sind, die die selektive Aktivierung von SaClpP gegenüber HsClpP durch unsere Spezies bestimmen können. spezifische Aktivatoren.

Als nächstes führten wir einen Test der minimalen Hemmkonzentration (MIC) in Flüssigkultur durch, um die antibakterielle Wirkung unserer Aktivatoren auf den Stamm S. aureus 8325-4 zu bestimmen. (R)-ZG197 unterdrückt S. aureus signifikant mit einer quantifizierten MHK von 0,5 μg/ml, was genauso aktiv ist wie ONC212 (Abb. 5a). (S)-ZG197 hemmt auch das Wachstum von S. aureus 8325-4 und die MHK beträgt 4 μg/ml. Sowohl (R)-ZG197 als auch (S)-ZG197 zeigen eine viel bessere Hemmwirkung auf das Staphylokokkenwachstum als die Erfolgsverbindung ICG-001. Um herauszufinden, ob die Antistaphylokokkenaktivität unserer Aktivatoren von ClpP in S. aureus abhängt, haben wir die hemmende Wirkung unserer Aktivatoren auf die ΔclpP-Mutante und die komplementierten clpP- bzw. clpPI91W-Mutantenstämme bestimmt (Abb. 5a). Die selektiven (R)- und (S)-ZG197-Aktivatoren oder die globalen Aktivatoren ICG-001 und ONC212 unterdrücken das Wachstum des ΔclpP-Mutantenstamms minimal, und es wird beobachtet, dass alle MHK-Werte über 256 μg/ml liegen. Der antibakterielle Phänotyp kann im komplementierten clpP-Stamm in Gegenwart von ClpP-Aktivatoren wiederhergestellt werden. Im Gegensatz zu (R)-ZG197 und ICG-001 und ONC212 ist die antibakterielle Aktivität von (S)-ZG197 im komplementierten clpPI91W-Mutantenstamm deutlich abgeschwächt, da (S)-ZG197 auf dem SaClpPI91W-Mutantenstamm in vitro und in Zellen inaktiv ist. Dies weist darauf hin, dass unsere Aktivatoren in S. aureus antibakterielle Aktivitäten in SaClpP-abhängiger Weise zeigten.

a Bewertung von ClpP-Aktivatoren auf das Wachstum von S. aureus 8325-4 mit genetischem Hintergrund von clpP, ΔclpP und komplementierter clpP- oder I91W-Mutante durch MHK-Messung. b Bewertung der Wirkung von SaClpP-Aktivatoren auf die zelluläre SaFtsZ-Häufigkeit in den intakten Zellen von 8325-4, ΔclpP, den komplementierten clpP- und clpPI91W-Stämmen, die im Western Blot nachgewiesen wurden. Die Quantifizierung der Bandenintensität von SaFtsZ wird gegen die Beladungskontrolle von SaGAPDH normalisiert, und das Verhältnis in der DMSO-Gruppe wird mit 1,0 angenommen. c Repräsentative Ansichten von REM-Aufnahmen, die die Auswirkungen von (R)- und (S)-ZG197 auf die Zellmorphologie von S. aureus 8325-4 mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen von clpP, ΔclpP und komplementiertem clpP oder clpPI91W zeigen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 1 μm. d Repräsentative Ansichten von REM-Aufnahmen, die die Wirkung von 20 µM (R)- und (S)-ZG197 auf die Zellteilung von Newman- und USA300-Stämmen zeigen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 1 μm. e Bestimmung der MHK der SaClpP-Aktivatoren gegen das Wachstum einer Reihe von S. aureus-Stämmen. (R)- und (S)-ZG197, ONC212 und die klinischen Antibiotika Oxacillin, Tetracyclin, Erythromycin, Norfloxacin, Clindamycin und Gentamicin wurden unter ähnlichen Bedingungen getestet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. f Bakterizide Wirkung der kombinierten Therapie mit (R)- und (S)-ZG197 auf die Eradikation der stationären Phase von USA300 (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Zellzahlen wurden in KBE/ml aufgezeichnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Zellteilungsprotein SaFtsZ könnte durch die fehlerhafte Aktivierung von SaClpP in Gegenwart von Aktivatoren in Zellen übermäßig abgebaut werden25. Tatsächlich verringern alle Aktivatoren, einschließlich (R)-ZG197, (S)-ZG197 und ONC212, die SaFtsZ-Häufigkeit im 8325-4 S. aureus, nicht jedoch im entsprechenden ΔclpP-Mutantenstamm, wie durch den Immunblotting-Assay nachgewiesen wurde (Abb. 5b). Die SaFtsZ-Häufigkeiten werden in der komplementierten clpP- oder clpPI91W-Mutante in Gegenwart des selektiven Aktivators (R)-ZG197 oder des globalen Aktivators ONC212 dramatisch verringert. Ähnlich wie bei der Beobachtung, dass (S)-ZG197 die Aktivität der mutierten SaClpPI91W-Protease nicht aktivieren konnte, beobachteten wir in Gegenwart von (S)-ZG197 keine offensichtliche Abnahme der Häufigkeit von SaFtsZ im komplementierten clpPI91W-Stamm. Dies weist darauf hin, dass unsere Aktivatoren den aberranten Abbau von SaFtsZ in S. aureus induzierten, der stark vom zellulären SaClpP abhängt.

Der fehlregulierte Abbau von SaFtsZ könnte die Zellteilung in S. aureus beeinträchtigen24,25. Anschließend haben wir die Zellmorphologie von Staphylokokkenzellen mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops (REM) gemessen, was die hemmende Wirkung unserer Aktivatoren auf die Zellteilung von Staphylokokken widerspiegeln könnte49. Die Durchmesser von Staphylokokkenzellen betragen im Durchschnitt 0,64 μm, 0,69 μm, 0,73 μm und 0,75 μm für 8325-4-, ΔclpP- und komplementierte clpP- bzw. clpPI91W-Stämme in Vehikelgruppen (Abb. 5c und ergänzende Abb. 5a). . Interessanterweise vergrößern (R)- und (S)-ZG197-Behandlungen ähnlich wie die hemmenden Wirkungen des FtsZ-Inhibitors TXA709 auf die Zellteilung von Staphylokokken die Zelldurchmesser von 8325-4 und den komplementierten clpP-Stämmen erheblich, wobei die gemessenen Durchmesser normalerweise größer als 1,00 sind μm50. Bei Bakterien, die mit unseren Aktivatoren behandelt wurden, wurden Schrumpfung, Lyse und vollständiger Abbau der Staphylokokken-Zellmorphologie beobachtet. Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine Veränderungen im Bakteriendurchmesser oder in der Zellmorphologie, wenn die ΔclpP-Mutante (R)- und (S)-ZG197-Aktivatoren ausgesetzt wurde. Die Behandlung mit (R)-ZG197 führt zu einer Vergrößerung der Zellgröße im komplementierten clpPI91W-Mutantenstamm, während (S)-ZG197 keinen Einfluss auf den Bakteriendurchmesser in diesem Stamm hat. Wir haben auch die Wirkung unserer selektiven Aktivatoren auf die Zellteilung in Newman, einem klinischen Isolat des Methicillin-empfindlichen S. aureus-Stammes, und in USA300, einem repräsentativen MRSA-Isolat, getestet (Ergänzungstabelle 2). Ein ähnliches Phänomen vergrößerter Durchmesser in Newman- und USA300-Zellen wurde in Gegenwart von (R)- und (S)-ZG197 beobachtet (Abb. 5d, ergänzende Abb. 5b, c). Wir haben gezeigt, dass (R)- und (S)-ZG197 eine unterdrückende Wirkung auf die Zellteilung in S. aureus haben, die vom zellulären SaClpP abhängig ist.

Da unsere speziesspezifischen Aktivatoren das Wachstum von S. aureus 8325-4 unterdrücken, haben wir dann das Antistaphylokokkenspektrum von (R)- und (S)-ZG197 gegen eine Reihe von S. aureus-Stämmen getestet, darunter den Newman-Stamm und Multidrug- resistente MRSA-Stämme. Die MRSA-Stämme USA300, NRS-1, NRS-70, NRS-100, NRS-108 und NRS-271 wurden vom Netzwerk für antimikrobielle Resistenz bei S. aureus gesammelt (Ergänzungstabelle 2). (R)-ZG197 zeigt eine starke antibakterielle Aktivität auf ein breites Spektrum dieser S. aureus-Stämme mit MHK-Werten von 0,5–2 μg/ml, während (S)-ZG197 das Wachstum dieser Stämme mit moderaten MHK-Werten von 2– unterdrückt. 8 μg/ml (Abb. 5e, linkes Feld). Wir haben auch die antibakterielle Wirkung unserer Aktivatoren an fünf im Krankenhaus erworbenen, multiresistenten MRSA-Isolaten in China getestet, darunter XJ009, XJ036, XJ049, XJ051 und XJ052 (Ergänzungstabelle 2). Diese klinischen MRSA-Isolate haben eine bemerkenswerte Resistenz gegen mehrere klinische Antibiotika entwickelt, darunter Oxacillin, Tetracyclin, Erythromycin, Norfloxacin, Clindamycin und Gentamicin, aber sie reagieren alle empfindlich auf unsere Aktivatoren mit MHK-Werten von 0,5–1 μg/ml für (R)- ZG197 bzw. 2–8 μg/ml für (S)-ZG197 (Abb. 5e, rechtes Feld). Auch der globale Aktivator ONC212 weist bei diesen Stämmen niedrige MHK-Werte auf.

Ähnlich wie ONC212 und Vancomycin zeigen sowohl (R)-ZG197 als auch (S)-ZG197 hervorragende bakterizide Wirkungen auf den exponentiell wachsenden Newman-Stamm (ergänzende Abbildung 5d). Als nächstes untersuchten wir die antibakterielle Wirkung unserer Aktivatoren auf die Ausrottung von Persistern, bei denen es sich um Zellen handelt, die akutem Stress ausgesetzt sind, um eine Antibiotika-Persistenz zu wecken51. Eine Kohorte von über Nacht stationären S. aureus-Zellen, die unter Nährstoffmangel litten, sind persistierend und konnten mit herkömmlichen Antibiotika nur schwer beseitigt werden52. Wie die etablierten ClpP-Aktivator-ADEPs reduzieren (R)-ZG197, (S)-ZG197, Rifampicin und Ciprofloxacin jeweils einzeln die koloniebildenden Einheiten (CFU) des MRSA-Stamms von USA300-Kulturen minimal (Abb. 5f und Ergänzung). Abb. 5e), während eine kombinierte Therapie mit entweder (R)-ZG197 oder (S)-ZG197 mit Rifampicin oder Ciprofloxacin die Anzahl der USA300-Persister signifikant bis zur Nachweisgrenze reduziert (Abb. 5f). Um die unterdrückende Wirkung einer Kombinationstherapie auf persistierende S. aureus-Zellen weiter zu untersuchen, führten wir einen zweiphasigen Abtötungstest mit dem Stamm USA300 durch. Ähnlich wie bei ADEP 423 haben wir herausgefunden, dass die Zugabe eines zweiten herkömmlichen Antibiotikums wie Rifampicin oder Ciprofloxacin das Wachstum von Ciprofloxacin-induzierten Persistern leicht beeinträchtigt, während die Anwesenheit von (R)- und (S)-ZG197-SaClpP-Aktivatoren Persister vollständig ausrottet die Nachweisgrenze (ergänzende Abbildung 5f). Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass unsere Aktivatoren in Kombination mit herkömmlichen Antibiotika Staphylokokken-Persistenzen genauso effizient beseitigen wie ADEP 4.

Wir haben auch die resistenten Mutanten von SaClpP untersucht, die durch unsere artspezifischen Aktivatoren induziert wurden. Die Widerstandsraten werden gemäß dem etablierten Protokoll47 definiert. Die Häufigkeit spontaner Resistenzen, die durch 4 × MHK von (R)-ZG197 und (S)-ZG197 induziert werden, liegt im Bereich von 10−7, was mit ADEP 4 und ONC212, den globalen Aktivatoren von ClpP, vergleichbar ist. Alle Mutationsstellen sind zufällig verteilt und befinden sich außerhalb der hydrophoben Bindungstaschen von ClpP (Ergänzungstabelle 3).

Um die antiinfektiöse Wirkung unserer Aktivatoren in vivo zu testen, haben wir zunächst ihre bioaktiven Profile bewertet. Im Gegensatz zur Screening-Hit-Verbindung ICG-001, die ursprünglich als Wnt/β-Catenin-Inhibitor identifiziert wurde, stören (R)- und (S)-ZG197 den Wnt/β-Catenin-Signalweg in HEK 293T/17 und HK-2 nur minimal Zelllinien im Wnt/β-Catenin-Luciferase-Reporter-Assay (ergänzende Abbildung 6a)39. Anschließend untersuchten wir die Auswirkungen unserer SaClpP-Aktivatoren auf die Lebensfähigkeit der Zelllinien HEK 293T/17 und HK-2 im MTT-Assay. Wie erwartet haben (R)- und (S)-ZG197 minimale toxische Wirkungen auf die Proliferation von Säugetierzellen, was durch geringe Hemmaktivitäten mit hohen IC50-Werten belegt wird (ergänzende Abbildung 6b). Im Gegensatz dazu hemmen der globale Aktivator ONC212 und unsere erfolgreiche Verbindung ICG-001 die Lebensfähigkeit von Säugetierzellen dramatisch, insbesondere ONC212, das niedrige IC50-Werte von 20–60 nM aufweist. Wir haben auch die zytotoxische Wirkung unserer Aktivatoren auf Zebrafische untersucht. Die Verabreichung von (R)- oder (S)-ZG197 in einer Einzeldosis von 25 oder 50 mg/kg hat keine zytotoxische Wirkung auf das Überleben von Zebrafischen (ergänzende Abbildung 6c). Bei einer Verabreichung von 100 mg/kg führt ONC212 erheblich zum Tod von Zebrafischen, während (R)- oder (S)-ZG197 bei Zebrafischen immer noch sicher ist (ergänzende Abbildung 6c). Dies weist auf die biologische Sicherheit unserer artspezifischen Aktivatoren für Antistaphylokokken-Infektionen in vivo hin.

Anschließend bewerteten wir die antibakteriellen Wirkungen von ZG197 in vivo mithilfe eines Zebrafisch-Infektionsmodells, einem weit verbreiteten In-vivo-Modell zur Bewertung von Antistaphylokokken-Wirkstoffen gegen S. aureus-Infektionen53. Wir haben zunächst geeignete KBE von S. aureus ermittelt, die innerhalb eines angemessenen Zeitfensters zur Zebrafischsterblichkeit führen können (ergänzende Abbildung 6d). Wir haben die antibakterielle Wirksamkeit unserer SaClpP-Aktivatoren bewertet, indem wir die Überlebensrate von Zebrafischen nach einer fünftägigen Staphylokokkeninfektion gemessen haben (ergänzende Abbildung 6e). Eine einmalige Verabreichung von 50 mg/kg (R)- und (S)-ZG197 verlängert die Überlebensrate von USA300-infizierten Zebrafischen erheblich (Abb. 6a). Eine niedrigere Dosis von (R)- oder (S)-ZG197 von 25 mg/kg schützt Zebrafische auch wirksam vor einer durch USA300 verursachten tödlichen Infektion (ergänzende Abbildung 6f). In ähnlicher Weise verbessert die Verabreichung von 25 mg/kg oder 50 mg/kg (R)-ZG197 wirksam die Überlebensrate von Newman-infizierten Zebrafischen, die eine bessere Überlebensrate als ONC212 aufweisen (ergänzende Abbildungen 6g und 6b). Allerdings verliert (R)-ZG197 seine therapeutische Wirkung auf Zebrafische, die mit dem ΔclpP-Mutantenstamm infiziert sind, während Vancomycin immer noch gegen diese Infektion aktiv ist (Abb. 6c). Dies weist darauf hin, dass die vielversprechende Antistaphylokokkenwirkung von (R)-ZG197 auf infizierte Zebrafische in vivo von SaClpP abhängt. Eine einmalige Verabreichung von 50 mg/kg (R)-ZG197 führt zu einer signifikanten therapeutischen Wirkung auf Zebrafische, die mit dem klinischen MRSA-Stamm XJ049 infiziert sind. Im Gegensatz dazu ist dieser Stamm resistent gegen die Behandlung mit den klinisch eingesetzten Antibiotika Oxacillin und Erythromycin (Abb. 6d). Es ist nicht überraschend, dass der globale Aktivator ONC212 in einer Konzentration von 50 mg/kg die Überlebensrate von mit MRSA

a Therapeutische Wirkung von (R)- und (S)-ZG197 gegen USA300-Infektion bei Zebrafischen. Zebrafische (n = 11 Tiere) wurden mit 7 × 106 KBE USA300 infiziert und die Verbindungen wurden in einer Einzeldosis von 50 mg/kg verabreicht. Als Kontrollen wurden DMSO (5 %) und Vancomycin verabreicht. Therapeutische Wirkung von (R)-ZG197 gegen tödliche Infektionen durch Newman (b) und die ΔclpP-Mutante (c). Zebrafische (n = 11 Tiere) wurden mit 7 × 107 KBE Newman (b) oder 3 × 107 KBE der ΔclpP-Mutante (c) infiziert und den infizierten Zebrafischen wurden 50 mg/kg Verbindungen verabreicht. Als Kontrollen dienten Vancomycin und ONC212. d Therapeutische Wirkung von (R)-ZG197 auf die mit klinischen MRSA-Isolaten infizierten Zebrafische. Zebrafische (n = 11 Tiere) wurden mit 5 × 107 KBE XJ049 infiziert und die Verbindungen wurden in einer Einzeldosis von 50 mg/kg verabreicht. Als Kontrollen wurden DMSO (5 %), Antibiotika (Vancomycin, Erythromycin und Oxacillin) und der globale Aktivator ONC212 verwendet. e Quantifizierung der nekrotischen Hautläsionsgröße zu Beginn (linkes Feld) und 4 Tage nach der Infektion (rechtes Feld). Vancomycin wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 9 Tiere) angezeigt. f Repräsentative Bilder, die nekrotische Hautläsionen 4 Tage nach der Infektion zeigen. Der Maßstabsbalken entspricht 1 cm. g Auswirkungen unserer Aktivatoren auf die Bakterienzahl in den Hautproben (n = 8 biologisch unabhängige Proben). Hautgewebe wurde 4 Tage nach der Infektion von mit USA300 infizierten Mäusen herausgeschnitten und auf TSA ausplattiert, um die KBE zu zählen. h Mikroskopische Aufnahmen von H&E-gefärbtem Hautgewebe nach den angegebenen Behandlungen. Der Maßstabsbalken stellt 1 mm (oben) und 0,1 mm (unten) dar. Statistische Unterschiede wurden mithilfe von Log-Rank-Tests (a–d) und zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests (e, g) analysiert. Es werden genaue P-Werte bereitgestellt. ns, keine Bedeutung. Die Daten (e, g) werden als Mittelwert ± SD (Fehlerbalken) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Abschließend haben wir die antiinfektiöse In-vivo-Wirksamkeit unserer Aktivatoren in Mäusehaut-S.-aureus-Infektionsmodellen bewertet54. Die Haut von Mäusen wurde mit 2,5 × 106 KBE USA300 beimpft und nach 16 Stunden trat eine Läsion auf. Die anfänglichen Läsionsbereiche in jeder Gruppe sind vergleichbar (Abb. 6e). Die subkutane Injektion von (R)- und (S)-ZG197 mit 7,5 mg/kg zweimal täglich führt bei Mäusen zu einer kleineren nekrotischen Läsionsgröße im Vergleich zur Vehikelkontrolle (Abb. 6e, f). Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikante Verringerung der Bakterienlast, als wir die Läsionen von Mäusen entfernten, die mit (R)- und (S)-ZG197 behandelt wurden, im Vergleich zur Vehikelkontrolle (Abb. 6g). Die histologische Analyse mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) zeigt auch eine Abnahme des nekrotischen Bereichs und der entzündlichen Infiltrate im Hautgewebe, wenn sie mit unseren Aktivatoren oder Vancomycin behandelt werden, während die mit Vehikel behandelte Probe dichte entzündliche Infiltrate aufweist (Abb. 6h). Gemeinsam identifizieren wir unsere Aktivatoren als vielversprechende Antibiotika gegen multiresistente MRSA-Infektionen in vivo, jedoch mit minimalen zytotoxischen Wirkungen.

Die fehlerhafte Aktivierung der bakteriellen ClpP-Protease ist eine vielversprechende Methode zur Behandlung nosokomialer Infektionen mit antibiotikaresistenten grampositiven Bakterien. Der gewünschte SaClpP-Aktivator sollte vorzugsweise auf das Staphylokokken-ClpP abzielen, anstatt die ordnungsgemäße Funktion des Wirts-ClpP zu stören. Allerdings wurden in früheren Arbeiten mehrere globale Aktivatoren für die ClpP-Proteasen mehrerer Spezies identifiziert, darunter ADEP-Analoga und ONC212, die unweigerlich unbeabsichtigte Off-Target-Effekte hervorrufen und die Anwendung bei der Arzneimittelentwicklung gegen MRSA-Infektionen behindern würden. Daher wird die Identifizierung verschiedener chemischer Gerüste, die SaClpP selektiv aktivieren, sein antiinfektives therapeutisches Potenzial für MRSA-Infektionen mithilfe einer Chemoaktivierungsstrategie hervorheben.

Wir verwenden HTS für Verbindungen, die die ClpP-Proteaseaktivität fördern, und experimentelle Validierung, um die N-Benzyl- und Naphthalin-1-ylmethyl-disubstituierte peptidomimetische Verbindung (ICG-001) als Aktivator mit mäßiger Aktivität sowohl für SaClpP als auch für HsClpP zu identifizieren. Die synthetische Optimierung von ICG-001-Analoga führte zur Entdeckung von (6S,9aS)-6-((S)-sec-butyl)-8-(naphthalen-1-ylmethyl)-4,7-dioxo-N-(4, 4,4-Trifluorbutyl)hexahydro-2H-pyrazino[1,2-a]pyrimidin-1(6H)-carboxamid (ZG180) mit deutlich verbesserten Aktivitäten auf beide Proteasen. Der Einbau einer Methylsubstituentengruppe an ZG180 macht (R)- und (S)-ZG197 zu den wirksamsten und höchst selektiven Aktivatoren für SaClpP gegenüber HsClpP. Unsere Aktivatoren erhöhen den abnormalen Abbau des SaFtsZ-Proteins in Zellen, hemmen die Zellteilung von Staphylokokken und zeigen eine signifikante antibiotische Wirksamkeit bei der Verhinderung des tödlichen Ausganges der S. aureus-Bakteriämie in vivo. Frühere Arbeiten zeigten, dass ICG-001 ein Inhibitor des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist und antiproliferative Wirkungen in xenotransplantierten Mausmodellen ausübt. Dennoch hemmen unsere Aktivatoren die Lebensfähigkeit von Säugetierzelllinien minimal, was im Rahmen der klinischen Entwicklung von Antibiotika weiter untersucht werden sollte.

Unsere Identifizierung von (R)- und (S)-ZG197 als artspezifische Aktivatoren für SaClpP liefert strukturelle Einblicke in die Entwicklung der selektiven Bindung und spezifischen Chemoaktivierung bestimmter ClpP. Das sperrige W146 von HsClpP führt zu einer ungünstigen sterischen Kollision mit dem hindernden Naphthylsubstituenten im (S)-ZG197-Aktivator und verhindert daher die Bindung von Liganden an HsClpP. Dies weist darauf hin, dass der W146/I91-Rest ein entscheidender Faktor ist, der teilweise die Speziesselektivität unserer Aktivatoren bestimmt. Zusätzlich zu der Beobachtung, dass W146 in HsClpP einen kritischen Punkt für die Aktivatorunterscheidung darstellt, enthüllt unsere Arbeit auch die gemeinsame Wirkung von W146 mit dem C-terminalen Motiv in HsClpP, was durch die wiederhergestellten Aktivitäten von (S)-ZG197 und die verbesserten Aktivitäten von belegt wird (R)-ZG197 gegenüber der Bindung und Aktivierung von HsClpPW146AΔC im Vergleich zur HsClpPW146A-Mutante oder der HsClpPΔC-Verkürzung. Zusammen mit zuvor veröffentlichten Forschungsergebnissen zeigt dies, dass die wichtigsten Strukturfaktoren, einschließlich der räumlichen Unterschiede in hydrophoben Taschen und der Koordination anderer Aminosäuren, erheblich zur Unterscheidung von ClpP-Aktivatoren beitragen. Darüber hinaus reagieren Variantenaktivatoren unterschiedlich auf die bakteriellen und mitochondrialen ClpP-Proteine.

Die Chemoaktivierung von bakteriellem ClpP versetzt es effizient in einen unkontrollierbaren Zustand, um einen übermäßigen Abbau zahlreicher für Bakterien lebenswichtiger Substrate auszulösen und letztendlich die pathogenen Bakterien zu zerstören. Wir zeigen, dass sowohl (R)-ZG197 als auch (S)-ZG197 selektiv an SaClpP gegenüber HsClpP binden und das aktivatorgebundene SaClpP in der vollständig ausgedehnten, aktiven Konformation für die nichtselektive Hydrolyse essentieller Proteine ​​wie FtsZ induzieren. Obwohl bakterielles ClpP nicht überlebenswichtig ist, neigen die ClpP-Aktivatoren dazu, eine ClpP-Mutation zu induzieren und so Resistenzen zu entwickeln. Daher ist die Kombinationstherapie wahrscheinlich die beste Methode zur therapeutischen Anwendung von SaClpP-Aktivatoren, die die zielbasierte Resistenz verringern, das Antibiotikaspektrum erweitern und die Dosierung sowie unerwünschte Nebenwirkungen reduzieren könnte. Wir zeigen auch, dass entweder (R)-ZG197 oder (S)-ZG197 in Kombination mit Rifampin oder Ciprofloxacin die Persistenzpopulation dramatisch bis zur Nachweisgrenze ausrottet.

Angesichts hochkonservierter ClpP-Proteasen bei mehreren Spezies muss untersucht werden, ob unsere Aktivatoren andere ClpP-Proteasen verschiedener Spezies auf ähnliche Weise in Funktionsgewinnzustände versetzen können, insbesondere bei gramnegativen Bakterien und Darmmikrobiota. Weitere synthetische Optimierungen sind erforderlich, um die antimikrobiellen Fähigkeiten unserer artspezifischen SaClpP-Aktivatoren zur Behandlung von MRSA-Infektionen zu verbessern. Die Beurteilung der antiinfektiösen Wirkung unserer Aktivatoren an weiteren In-vivo-Tierinfektionsmodellen würde die antibakterielle Wirksamkeit dieser Aktivatoren vollständig charakterisieren.

Zusammenfassend berichten wir über (R)- und (S)-ZG197 als selektive SaClpP-Aktivatoren und identifizieren die kritischen Reste/Motive für die selektive Förderung von SaClpP anstelle von HsClpP. Unsere Daten liefern mechanistische Einblicke in die Chemoaktivierung von ClpP-Proteasen und beschleunigen die Entdeckung artspezifischer Antibiotika, die die Funktion der Staphylokokken-Protease selektiv stören können. Diese Arbeit hat das Potenzial, vielversprechende Strategien zur Behandlung von MRSA-Infektionen zu inspirieren und trägt zur Erzeugung wirksamer synthetischer Antibiotika-Gerüste mit minimaler Zytotoxizität für den Wirt bei.

Wildtyp-Zebrafische (7 bis 11 Monate alt, 300 ± 50 mg, unabhängig vom Geschlecht) wurden im Xiaoguan-Aquarium (Shanghai, China) gekauft und in einem 10-L-Tank bei Umgebungstemperatur und regelmäßiger Fütterung gehalten. Für die Infektion mit S. aureus wurden eine ähnliche Größe und zufällige Geschlechtsverteilung von Zebrafischen verwendet. Weibliche BALB/c-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt, 18–20 g) wurden von Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. gekauft. Alle Mäuse wurden mit einer Ad-libitum-Diät in der speziellen pathogenfreien Einrichtung von Shanghai Public gehalten Gesundheitsklinikzentrum. Bei Mäusen wurden Haltungsbedingungen mit einem Dunkel-/Hell-Zyklus von 12 Stunden, einer Umgebungstemperatur von 20–26 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40–60 % angewendet.

Antikörper von SaClpP (1:5.000, Kat.-Nr. C11185), SaFtsZ (1:5.000, Kat.-Nr. C11186) und SaGAPDH (1:5.000, Kat.-Nr. C1399) wurden von Shanghai Immune Biotech Ltd unter Verwendung des gereinigten Proteins als Antigen erzeugt validiert durch ELISA-Experimente. Antikörper von HsClpP (1:2.000, Clo#EPR7133, Cat#ab124822, Lot#GR3210822-8, Abcam), β-Actin (1:5.000, Clo#2D4H5, Cat#66009-1-Ig, Lot#10004156, Proteintech ), HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:10.000, Kat.-Nr. CW0103, Cwbio) und HRP-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG (1:10.000, Kat.-Nr. CW0102, Cwbio) wurden kommerziell erworben.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Medien aus Trypton-Soja-Brühe (TSB, OXOID), Trypton-Soja-Agar (TSA, OXOID), Brian-Herz-Infusion (BHI, OXOID), Mueller-Hinton-Agar (MHA, Für die Kultivierung von S. aureus wurden die Medien „Dalian Meilun Biotech“ und „Müller-Hinton-Bouillon“ (MHB, Dalian Meilun Biotech) verwendet. Für das Wachstum von Escherichia coli (E. coli) wurden Luria Bertani (LB) in Brühe oder LB-Agar-Medien verwendet.

ZG180, (R)- und (S)-ZG197 wurden im Labor synthetisiert und vollständig charakterisiert. ONC212 und ADEP 4 wurden von Topscience bzw. ChemPartner (Shanghai, China) bezogen. Die Antibiotika Vancomycin, Spectinomycin, Erythromycin, Ciprofloxacin, Rifampicin, Tetracyclin, Norfloxacin, Clindamycin und Gentamicin wurden von Dalian Meilun Biotech bezogen. Oxacillin wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Wasserfreies Tetracyclin (ATC) wurde von APExBIO bezogen.

Die Zelllinien HEK 293T/17 (CRL-11268) und HK-2 (CRL-2190) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Corning), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, GIBCO) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Corning), kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2-haltiger Atmosphäre (Thermo Scientific) kultiviert. Alle Zellen wurden durch Short-Tandem-Repeat-Profiling (STR) validiert und regelmäßig auf Mykoplasmenfreiheit überprüft.

Für die SaClpP-Expression wurde das Plasmid pET28b-SaClpP verwendet49. E. coli BL21 (DE3) Gold-Stämme wurden mit dem Plasmid in Gegenwart von 30 μg/ml Kanamycin transformiert. Wenn OD600 (Absorption bei der Wellenlänge von 600 nm) 0,6–0,8 erreicht, wurde die Proteinexpression durch 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bei 30 °C für 4 Stunden induziert. Anschließend wurden Zellpellets geerntet und bei –80 °C gelagert. Die Zellen wurden lysiert und der Überstand wurde einer 5-ml-HisTrapTM-HP-Säule (GE Healthcare) in Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl und 50 mM Imidazol) ausgesetzt und dann mit Elutionspuffer (50 mM) eluiert Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl und 400 mM Imidazol). Die eluierten Proteine ​​wurden mit Amicon Ultra Centrifugal Filters mit 10 kDa Cutoff (Merck-Millipore) konzentriert und einer Gelfiltration auf einem AKTA-Reinigungssystem mit einer HiLoad 16/60 Superdex 200-Säule (GE Healthcare) in 20 mM HEPES, pH 7,0 und unterzogen 100 mM NaCl. Die ortsspezifische Mutation von SaClpPI91W wurde gemäß dem Quikchang Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) etabliert. Ein ähnliches Verfahren wurde auf die SaClpPI91W-Reinigung angewendet.

Das Plasmid pET28a-SaFtsZ wurde für die SaFtsZ-Expression49 verwendet und in Gegenwart von 30 μg/ml Kanamycin in E. coli BL21 (DE3) Gold transformiert. Wenn OD600 0,6 erreicht, wurde die Expression von SaFtsZ durch 0,5 mM IPTG für 12 Stunden bei 16 °C induziert. Dann wurden die Zellpellets lysiert und der Überstand mit einer 5 ml HisTrapTM HP-Säule in Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl und 50 mM Imidazol) gebunden und dann mit Elutionspuffer (50 mM Tris) eluiert -HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl und 400 mM Imidazol). Die eluierten Proteine ​​wurden mit Amicon Ultra Centrifugal Filters mit 10 kDa Cutoff (Merck-Millipore) konzentriert und bei –80 ° C gelagert.

Das pPSUMO-CLPPΔN56-Plasmid wurde zur HsClpP-Expression in E. coli Rosetta (DE3)-Zellen transformiert40. Die Zellen wurden bei 37 °C kultiviert, bis die OD600 0,6–0,8 erreichte, und die Expression von HsClpP wurde durch 0,5 mM IPTG bei 37 °C für 4 Stunden induziert. Die Zellen wurden in Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 10 % Glycerin) lysiert. Der Überstand wurde dann durch eine 5 ml HisTrapTM HP-Säule geleitet. Nach dem Waschen mit Bindungspuffer wurde das Zielprotein mit Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol und 10 % Glycerin) eluiert. Das gesammelte Protein wurde dann konzentriert und in Bindungspuffer resuspendiert. Dann wurde die ULP1-Protease hinzugefügt, um den N-terminalen His-SUMO-Tag bei 4 °C über Nacht unter leichtem Schütteln zu spalten. Die verbleibenden Fraktionen wurden dann durch die HisTrapTM HP-Säule geleitet, um den His-SUMO-Tag und den His-markierten ULP1 zu entfernen. Die weitere Reinigung erfolgte über eine HiLoad 16/60 Superdex 200-Säule in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl und 5 % Glycerin. Die Konstruktion der Plasmide für HsClpPW146A, HsClpPΔC und HsClpPW146AΔC wurde gemäß dem Quikchang Site-Directed Mutagenesis Kit durchgeführt. Die Reinigungen von HsClpPW146A, HsClpPΔC und HsClpPW146AΔC waren denen von HsClpP ähnlich. Die Proteine ​​wurden bei –80 °C in 30 % Glycerin gelagert.

Die zur Konstruktion von Plasmiden für Mutanten verwendeten Primersequenzen sind wie folgt dargestellt:

SaclpPI91W-F: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

HsCLPPW146A-F: CCGATTTGTACCGCCTGTGTGGGTC

HsCLPPW146A-R: GACCCACACAGGCGGTACAAATCGG

HsCLPPΔC-F: GTGCTGGTTCATTAGCCGCAGGATGGTGAAGATG

HsCLPPΔC-R: CATCTTCACCATCCTGCGGCTAATGAACCAGCAC

Zehn Mikrogramm SaClpP, SaClpPI91W, HsClpP oder HsClpPW146A wurden in 50 μL Puffer gelöst, der 25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 200 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerin und 2 mM enthielt DTT, während 10 μg HsClpPΔC oder HsClpPW146AΔC in 50 μL Puffer gelöst wurden, der 25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,03 % Tween-20, 10 % Glycerin und 2 mM DTT enthielt. Verschiedene Konzentrationen der Verbindung (Endkonzentration von DMSO bei 1 %) wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend wurden 0,72 mg/ml α-Casein zugegeben und die Reaktion 2 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt. Die Proben wurden mit SDS-Ladepuffer gemischt und durch 12 % SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer Coomassie Brilliant Blue R-250-Färbung. Die EC50-Werte wurden mit GraphPad Prism 8 aus drei biologischen Replikaten berechnet.

Das tetradekamerische SaClpP-Protein (0,6 μM) in PD-Puffer (25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 200 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerin und 2 mM DTT) und Verbindungen (40 μM) wurden in die schwarzen 384-Well-Platten mit flachem Boden gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde das fluoreszenzmarkierte Substrat FITC-Casein (0,048 mg/ml) (Sigma) zugegeben und die Hydrolysereaktion bei 37 °C gestartet. Nach 2 Stunden wurden die Fluoreszenzsignale mit einem Mikroplattenlesegerät (TECAN) bei der Wellenlänge 485 nm für die Anregung und 535 nm für die Emission aufgezeichnet.

ZG180 und (R)- und (S)-ZG197 wurden in diesem Labor synthetisiert. Die Synthesemethoden sowie die Charakterisierungen sind in den ergänzenden Methoden und in der ergänzenden Abbildung 7–23 aufgeführt.

Die SaClpP- und HsClpP-Proteine ​​wurden durch die Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen bei 16 °C kristallisiert. Die Probe von 10 mg/ml Protein wurde mit der 5-fachen Konzentration der Verbindung von ZG180, (R)- oder (S)-ZG197 (enthalten 5 % DMSO) gemischt und 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die Tropfen enthielten 1 oder 2 μl SaClpP-Probe und 1 μl Reservoirlösung von 30 % (v/v) 2-Methyl-2,4-pentandiol, 0,1 M Natriumacetat/HCl (pH 8,0) und 20 mM Calciumchlorid in Gegenwart von ZG180 oder 1 μL Reservoirlösung von 30 % v/v (+/−)-2-Methyl-2,4-Pentandiol, 0,1 M Natriumacetat-Trihydrat (pH 4,6), 200 mM Natriumchlorid in Gegenwart von (R )- und (S)-ZG197. Die HsClpP-Probe mit 10 mg/ml wurde in Gegenwart der 5-fachen Konzentration von ZG180 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und mit einer Reservoirlösung aus 20 % w/v Polyethylenglykol 3350, 0,2 M Natriummalonat (pH 5,0) gemischt. Diese Kristalle wuchsen nach einer Woche bis mehr als einem Monat heran. Dann wurden die Kristalle gefischt und 30 Sekunden lang in 20 % (v/v) Glycerin eingeweicht, gefolgt von der Lagerung in flüssigem Stickstoff.

Beugungsdaten von ZG180/SaClpP und (R)-ZG197/SaClpP wurden über Bluice an der Strahllinie BL19U155 der Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) gesammelt. Röntgendaten wurden über die HKL2000-Programmsuite verarbeitet. Beugungsdaten von ZG180/HsClpP oder (S)-ZG197/SaClpP wurden über Finback an der SSRF-Beamline BL02U1 gesammelt und automatisch von Aquarium56 verarbeitet. Die Strukturen wurden mithilfe von SaClpP (PDB-Code 3STA) und HsClpP (PDB-Code 1TG6) aufgelöst, da das Suchmodell und die Modelle in COOT43,48,57 erstellt wurden. Abschließend wurden die Daten mit dem Programm REFMAC558 verfeinert. Die freien Reflexionen wurden automatisch ausgewählt und in allen Verfeinerungen angewendet. Strukturausrichtungen wurden in PyMOL59 durchgeführt.

Der SaFtsZ-Abbau wurde in SDS-PAGE in vitro analysiert. Kurz gesagt, 10 μg SaClpP wurden in 50 μl PD-Puffer gelöst. Nach Zugabe verschiedener Konzentrationen der Verbindung (Endkonzentration von DMSO bei 1 %) wurde die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde SaFtsZ (1,5 μM) hinzugefügt und die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt. Die Proben wurden mit SDS-Ladepuffer gemischt und durch 12 % SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer Coomassie Brilliant Blue R-250-Färbung. Die EC50-Werte wurden mit GraphPad Prism 8 aus drei biologischen Replikaten berechnet.

Das Zelllysat des Stammes 8325-4/ΔclpP wurde auch im SaFtsZ-Abbautest verwendet. Eine Staphylokokken-Übernachtkultur von 8325-4/ΔclpP wurde 1:500 verdünnt und bis zur frühen bis mittleren exponentiellen Phase (OD600 = 0,4–0,6) bei 37 °C kultiviert. Die Kultur wurde dann dreimal mit PD-Puffer gewaschen, gefolgt von einer Zelllyse unter Verwendung von 0,75 U Lysostaphin (Sigma). Anschließend wurde das Zelllysat bei 12.396 × g zentrifugiert und der Überstand gesammelt und in 50 μl aufgeteilt. Neun mikromolares Rinderserumalbumin (BSA, Dalian Meilun Biotech), SaClpP- oder HsClpP-Protein und verschiedene Konzentrationen der Verbindung wurden dem System zugesetzt. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 2 Stunden wurden die Proben mit SDS-Ladepuffer gemischt und 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt. Anschließend wurden die Proben auf die SDS-PAGE geladen, um die zelluläre SaFtsZ-Häufigkeit zu ermitteln. Die Proteine ​​wurden auf eine Nitrozellulosemembran (Millipore) übertragen und mit TBST, das 5 % Magermilch enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit den Primärantikörpern SaFtsZ (1:5.000) und SaGAPDH (1:5.000) bei 4 °C C über Nacht. Nach dem Waschen mit TBST wurde HRP-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:10.000) für die Western-Blot-Analyse hinzugefügt.

Das SaClpP- oder SaClpPI91W-Protein wurde in 100 mM HEPES, pH 7,0, 100 mM NaCl bis zu einer Endkonzentration von 2 μM (Monomerkonzentration) gelöst, während HsClpP, HsClpPΔC, HsClpPW146A oder HsClpPW146AΔC im Testpuffer mit 20 mM Tris-HCl gelöst wurden , pH 7,5, 500 mM NaCl und 5 % Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 2 μM (Monomerkonzentration). Dem Testpuffer wurden Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen (enthaltend 1 % DMSO) zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde jeder Probe 5 × SYPRO Orange-Farbstoff (Invitrogen) zugesetzt. Die Detektion wurde in einem CFX96-Echtzeitsystem (Bio-Rad) bei einer Wellenlänge von 492 nm für die Anregung und 610 nm für die Emission aufgezeichnet. Die Proben wurden mit einer Geschwindigkeit von 1 °C/min von 25 °C auf 95 °C erhitzt. Die Datenanalyse wurde mit der Bio-Rad CFX Manager-Software und GraphPad Prism 8 durchgeführt. Die Tm der Proteine ​​in mit Verbindungen behandelten Gruppen wurden mit denen in der DMSO-Gruppe verglichen.

ITC-Experimente wurden in einem Puffer mit 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,0, 5 % DMSO bei 25 °C und unter konstantem Rühren bei 750 U/min auf einem MicroCal iTC200-System (GE Healthcare) gemäß der angegebenen Methode44,60 durchgeführt. Die Proteine ​​und Verbindungen wurden in genau demselben Puffer gelöst. Die Zelle wurde mit 50 μM (R)- oder (S)-ZG197 gefüllt und die Spritze wurde mit 500 μM SaClpPI91W oder 700 μM SaClpP gefüllt. Nach einer automatischen Äquilibrierung des Systems wurden 2 μl Lösung in einer Spritze in die Zelle injiziert, um eine Bindungsreaktion auszulösen und die charakteristische Peaksequenz im aufgezeichneten Signal zu erzeugen. Die Datenanalyse inklusive Basislinienkorrektur und Auswertung erfolgte mit OriginPro 8.5 ITC. Anpassungen wurden unter Berücksichtigung aller Injektionen außer der ersten Injektion durchgeführt, um die maximale Wärme und den Wert der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd) zu berechnen.

Dieses Experiment wurde mit Octet RED96 (ForteBio) durchgeführt. Die SaClpP- und HsClpP-Proteine ​​wurden 1 Stunde lang in PBS-Puffer bei Raumtemperatur biotinyliert. Anschließend wurden die biotinylierten Proteine ​​mithilfe einer PD MiniTrap™ G-25-Entsalzungssäule (Cytiva) gesammelt. Die Streptavidin-Biosensoren wurden 10 Minuten lang in PBST (PBS mit 0,5 % Tween-20) mit 0,5 % DMSO inkubiert und anschließend mit 50 μg/ml biotinyliertem SaClpP oder HsClpP beladen. Als Referenzkontrolle wurde ein doppelter Sensorsatz verwendet, der nur in PBST mit 0,5 % DMSO inkubiert wurde. Zur Berechnung der Bindungskurve wurden verschiedene Konzentrationen von (R)- und (S)-ZG197 verwendet. Der Nachweis wurde mit einem Standardprotokoll in 96-Well-Schwarzplatten mit einem Gesamtvolumen von 200 μL bei 30 °C durchgeführt. BLI-Daten wurden mit Octet Acquisition 11.0 erfasst. Die Signale wurden durch ein Doppelreferenz-Subtraktionsprotokoll analysiert, um die Bindungskinetik mit Octet Analysis 11.0 zu berechnen. Die Kd-Werte wurden aus der stationären Anpassungskurve berechnet.

Um das Plasmid für die konstitutive Expression von SaClpP in S. aureus zu konstruieren, wurde ein DNA-Fragment, das das clpP-Gen und seine stromaufwärts gelegenen 29 Basenpaare abdeckt, aus genomischer DNA von S. aureus 8325-4 amplifiziert und in pYJ335 kloniert. Die SaclpPI91W-Mutante wurde gemäß dem ortsspezifischen Mutagenese-Kit QuikChange II mit den Primern SaclpPI91W-F und SaclpPI91W-R konstruiert. Zur Plasmiderhaltung wurden 100 μg/ml Ampicillin in E. coli und 10 μg/ml Erythromycin in S. aureus verwendet. Das Plasmid wurde aus DH5α extrahiert und anschließend in elektrokompetente S. aureus RN4220-Zellen transformiert, aus denen das Plasmid erneut extrahiert und schließlich in elektrokompetente S. aureus 8325-4/ΔclpP-Zellen transformiert wurde. Erythromycin wurde in einer Menge von 10 µg/ml für die Plasmidselektion verwendet und 1 ng/ml ATC wurde hinzugefügt, um die Proteinexpression zu induzieren.

SaclpP-F1-Primer: GTAACAGTTATTACAAGGAGG

SaclpP-R1-Primer: AGGGGGCCCTTATTTTGTTTCAGG

SaclpPI91W-F-Primer: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R Primer: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

Die Proteinüberexpression wurde mittels Western Blot nachgewiesen. Eine Bakterienkultur über Nacht wurde 1:1000 in TSB unter Belüftung bei 220 U/min verdünnt. Als die OD600 0,6 erreichte, wurde 1 ml Kultur gesammelt und 3 Minuten lang bei 12.396 × g zentrifugiert. Die Sedimente wurden dreimal mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang in 100 μl PBS mit 0,75 U Lysostaphin (Sigma) bei 37 °C resuspendiert. Die Proben wurden dann 30 Minuten lang bei 12.396 × g und 4 ° C zentrifugiert und die Überstände gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Beyotime) quantifiziert. Die Proben wurden mit SDS-Ladepuffer verdünnt, 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und zur Analyse auf die SDS-PAGE geladen. Die Proteine ​​wurden auf eine Nitrozellulosemembran (Millipore) übertragen und mit TBST, das 5 % Magermilch enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit den Primärantikörpern SaClpP (1:5.000) und SaGAPDH (1:5.000) bei 4 °C C über Nacht. Anschließend wurde HRP-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:10.000) hinzugefügt. Die verstärkte Chemilumineszenz (ECL) wurde für die Autoradiographie verwendet und die Bilder wurden mit GE ImageQuantLAS4000 aufgenommen.

S. aureus 8325-4-Stämme mit genetischem Hintergrund von clpP, ΔclpP und der komplementierten clpP- oder I91W-Mutante wurden auf SaFtsZ-Abbau in intakten Zellen untersucht. Eine Übernachtkultur wurde im Verhältnis 1:200 verdünnt und mit unterschiedlichen Konzentrationen jeder Verbindung inkubiert (0, 5, 10 und 20 μM, Endkonzentration von DMSO bei 1 %). Als die OD600 0,7 erreichte, wurden 300 μg/ml Spectinomycin zugegeben und die Reaktion 3 Stunden lang bei 37 °C und 220 U/min durchgeführt. Dann wurde 1 ml jeder Probe entnommen und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden resuspendiert und mit 0,75 U Lysostaphin 30 Minuten lang bei 37 °C lysiert. Der Überstand der lysierten Zellextrakte wurde abgetrennt und die Proteinkonzentration mit dem BCA Protein Assay Kit und anschließender Western-Blot-Analyse bestimmt. Die quantitative Analyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt. Der Grad des SaFtsZ-Abbaus wurde durch Messung der Bandenintensität von SaFtsZ gegenüber SaGAPDH bestimmt und das DMSO-Panel wurde mit 1,0 bewertet.

Einzelne Kolonien von S. aureus 8325-4 wurden aufgenommen und bei TSA unter Schütteln über Nacht gezüchtet. Die Kultur wurde mit 1:1000 verdünnt und auf OD600 = 0,6 gezüchtet. Dann wurde die Kultur in PBS resuspendiert und 5 × 106 Zellen wurden auf MHA-Platten ausgebreitet, die (R)-ZG197, (S)-ZG197, ADEP 4 oder ONC212 bei 4 × MIC jeder Verbindung enthielten. Nach 24 Stunden wurden resistente Kolonien nach dem Zufallsprinzip für die MHK-Bestimmung und Sequenzierung ausgewählt. Das SaclpP-Gen wurde durch PCR amplifiziert und zur Bestimmung der mutierten Stelle sequenziert.

Die Sequenzen der zur Amplifikation von SaclpP verwendeten Primer sind wie folgt dargestellt:

SaclpP-F2-Primer: GTTATTACAAGGAGGAAAT

SaclpP-R2-Primer: CAGACAGCTTAGTCTACTC

Übernachtkulturen von S. aureus-Stämmen wurden 1:200 in frischem TSB-Medium verdünnt und mit DMSO oder 20 μM (R)- und (S)-ZG197 inkubiert und dann 3 Stunden lang bei 37 °C und 220 U/min geschüttelt. Die Kulturen wurden dreimal mit PBS gewaschen und auf eine OD600 von 1,5 resuspendiert. Dann wurden 50 μl Kulturen entnommen und auf einem 13-mm-Deckglas mit 300 μl 2,5 % Glutaraldehyd (TED PELLA) in einer 24-Well-Platte (Corning) über Nacht bei 4 °C fixiert. Am nächsten Tag wurde der Glutaraldehyd in jeder Vertiefung entfernt und dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang vorsichtig mit Osminsäure gefärbt und anschließend dreimal mit ddH2O gewaschen. Die Proben wurden in einer abgestuften Reihe von Ethanol (30, 50, 70, 80, 95, 100 %) 10 Minuten lang unter leichtem Schütteln bei jedem Schritt dehydriert. Anschließend wurden die Proben einer kritischen Punkttrocknung mit flüssigem CO2 (Leica EM) unterzogen, um das ursprüngliche Aussehen der Proben beizubehalten. Getrocknete Proben wurden durch Sputterbeschichtung (Leica EM) mit einem Goldfilm beschichtet. Die Proben wurden in einem FEI Quanta 250 bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV abgebildet. Die Bilder wurden mit Adobe Photoshop CS5 aufgenommen und Kontrast und Helligkeit angepasst.

Übernachtkulturen von S. aureus 8325-4 oder den geretteten SaclpPI91W-Stämmen wurden 1:200 in frischem TSB verdünnt und mit DMSO oder 10 μM Verbindungen, einschließlich (R)-ZG197, (S)-ZG197 und ONC212, inkubiert 2 Std. Ein Milliliter jeder Kultur wurde gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben in PBS mit Cocktail-Inhibitoren (Sangon Biotech) resuspendiert, in 50-μL-Aliquots aufgeteilt und unter Verwendung eines Thermocyclers (BIO-RAD) 3 Minuten lang auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Anschließend wurden die Bakterien mit 0,75 U Lysostaphin 30 Minuten lang bei 37 °C lysiert, gefolgt von drei Einfrier-Auftau-Zyklen mit flüssigem Stickstoff, um die Bakterien vollständig aufzubrechen. Die löslichen Lysate wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 12.396 × g und 4 ° C gesammelt und die Überstände durch Western Blot analysiert. Es wurden Primärantikörper von SaClpP (1:5.000) und SaGAPDH (1:5.000) verwendet. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und eines der repräsentativen Ergebnisse wird gezeigt.

HEK 293 T/17-Zellen wurden mit Trypsin verdaut und gesammelt. Die Zellsedimente wurden in PBS mit Cocktailinhibitoren (Sangon Biotech) resuspendiert und durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen mit flüssigem Stickstoff lysiert. Die lysierten Proben wurden dann 30 Minuten lang bei 12.396 × g zentrifugiert, um die Trümmer zu entfernen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit 10 μM Verbindungen, einschließlich (R)-ZG197, (S)-ZG197 und ONC212, 20 Minuten lang inkubiert und dann in die 0,2-ml-PCR-Röhrchen überführt, gefolgt von einer 3-minütigen Denaturierung bei den angegebenen Temperaturen. Anschließend wurden die löslichen Überstände durch Zentrifugation gesammelt und mittels Western Blot analysiert. Es wurden primäre Antikörper von HsClpP (1:2.000) und β-Actin (1:5.000) verwendet. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und eines der repräsentativen Ergebnisse wird gezeigt.

Die Kulturen wurden in MHB-Medium bei 37 °C unter Schütteln bei 220 U/min über Nacht gezüchtet, bis die OD600 0,4–0,6 erreichte, und dann in MHB-Medium verdünnt, um eine endgültige OD600 von 0,025 zu ergeben. Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen wurden in dreifacher Ausfertigung zu verdünnten Bakterienkulturen gegeben (Endvolumen 100 µL/Vertiefung und DMSO-Endkonzentration 1 %). Die niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, die das sichtbare Wachstum von Bakterien hemmte, wurde nach 18-stündiger Inkubation bei 37 °C gemessen. Die MHK-Werte wurden durch drei unabhängige Experimente bestimmt.

Eine Übernachtkultur von USA300 wurde in TSB mit einer endgültigen OD600 von 0,025 verdünnt und bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD600 von 0,6) bei 37 °C und 220 U/min kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in TSB auf 1 × 106 KBE/ml verdünnt und mit DMSO, Vancomycin (20 μg/ml, 10 × MHK), (R)-ZG197 (5 μg/ml, 10 × MHK), (S) behandelt. -ZG197 (80 μg/ml, 10 × MIC) oder ONC212 (5 μg/ml, 10 × MIC). Nach 6-stündiger Inkubation bei 37 °C und 220 U/min wurden 200 μl Kulturmedium entnommen und dreimal mit PBS gewaschen. Verdünnungen jeder Bedingung wurden dann in Abwesenheit von Verbindungen ausplattiert und über Nacht bei 37 °C auf TSA-Platten wachsen gelassen. Die KBE wurden durch Zählen der Kolonien am nächsten Tag gemessen.

Es wurden zwei Tests durchgeführt, um die Wirkung von (R)- und (S)-ZG197 auf die Ausrottung von MRSA-Persistenzen zu testen. Zunächst wurden S. aureus-Zellen verwendet, die in der stationären Phase wachsen61. Nach der Kultivierung über Nacht wurden MRSA USA300 in der stationären Phase in BHI-Brühe hergestellt und in Gegenwart von (R)-ZG197 (10 μg/ml), (S)-ZG197 (80 μg/ml) und Ciprofloxacin (8 μg/ml) inkubiert. oder Rifampicin (0,4 μg/ml) bei 37 °C und 220 U/min mit Belüftung. Zu jedem angegebenen Zeitpunkt (0, 24, 48 und 72 Stunden) wurden 100 μl Kultur entnommen und 2 Minuten lang bei 12.396 × g zentrifugiert. Anschließend wurde die Mischung dreimal mit PBS gewaschen. Es wurden 10-fache Reihenverdünnungen durchgeführt und 10 μl jeder Verdünnung entnommen und auf TSA-Platten getupft. Alle Platten wurden über Nacht bei 37 °C aufbewahrt. Die KBE wurden durch Zählen der Kolonien am nächsten Tag gemessen.

Der zweite Persistenzzelltest wurde unter Verwendung der biphasischen Abtötungsanalyse23 durchgeführt. Über Nacht wurde die stationäre USA300-Kultur im Verhältnis 1:100 in TSB verdünnt. Die Bakterien wurden zunächst 6 Stunden lang bei 37 °C und Belüftung bei 220 U/min mit Ciprofloxacin (8 μg/ml, 10 × MHK) inkubiert, und die verbleibenden Zellen bildeten überlebende Persister. Dann werden Verbindungen mit 10 × MHK, einschließlich (R)-ZG197 (10 μg/ml), (S)-ZG197 (80 μg/ml), ADEP 4 (5 μg/ml), Ciprofloxacin (8 μg/ml) oder Rifampicin (0,4 μg/ml) wurden hinzugefügt und 100 μl-Proben wurden zum angegebenen Zeitpunkt (0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 und 48 Stunden) entnommen und 2 Minuten lang bei 12.396 × g zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben in PBS resuspendiert. Die KBE wurden durch Zählen der Kolonien am nächsten Tag gemessen.

Die Toxizität der Verbindungen auf 293T/17- und HK-2-Zelllinien wurde mittels 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay ermittelt. Säugetierzellen (3000 Zellen/Well) wurden in 96-Well-Platten ausgesät, über Nacht haften gelassen und 72 Stunden lang mit einer verdünnten Reihe von ICG-001, (S)-ZG197, (R)-ZG197 oder ONC212 behandelt. Anschließend wurden 10 μl vorbereitete MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden dann für weitere 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurde der Formazan-Niederschlag in jeder Vertiefung in DMSO gelöst und die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm mit einem Tecan Spark 10 m-Plattenlesegerät gemessen. DMSO wurde als Kontrolle verwendet und seine Lebensfähigkeit wurde mit 100 % angenommen. Die IC50-Werte wurden durch Anpassen der Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung wurde mit TOPFlash/FOPFlash-Reporter-Assays wie zuvor beschrieben mit Modifikationen nachgewiesen39. TOPFlash (Nr. 21-170, Millipore) wurde als auf Wnt reagierender Reporter verwendet und FOPFlash (Nr. 21-169, Millipore) war ein mutierter, auf Wnt nicht reagierender Reporter. Etwa 1,5 × 105 HEK 293 T/17- oder HK-2-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Nach der Anheftung wurden die Zellen mit 500 ng Firefly Reporter TOPFlash oder FOPFlash unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. In der Zwischenzeit wurden 50 ng des Renilla-Reporter-pRL-TK (Promega) als interne Kontrolle co-transfiziert, um Unterschiede sowohl in der Transfektions- als auch in der Ernteeffizienz zu korrigieren. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium in DMEM-Wachstumsmedium in Gegenwart von 20 mM LiCl und Verbindungen in den angegebenen Konzentrationen ausgetauscht. Nach 24 Stunden wurden die Zellen lysiert und mit dem Dual-Luciferase Reporter Assay System (#E1910, Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Die Firefly-Luciferase-Aktivität (TOPFlash oder FOPFlash) wurde mit der Renilla-Luciferase-Aktivität (pRL-TK) normalisiert. Die Wnt-Signalaktivität wurde als normalisierte TOPFlash/FOPFlash-Werte dargestellt.

Zebrafische (7 bis 11 Monate alt, 300 ± 50 mg, unabhängig vom Geschlecht) wurden vor den Experimenten mindestens drei Tage lang in einem 10-L-Tank mit regelmäßiger Fütterung gehalten. Die Sicherheitsprofile wurden durch intraperitoneale Injektion von 25, 50 oder 100 mg/kg Verbindungen (gelöst in 5 % DMSO, 20 % PEG 300, 5 % Solutol und 70 % PBS) in den nicht infizierten Zebrafisch (n = 11 pro Gruppe) durchgeführt. . Zur Bestimmung einer geeigneten Staphylokokkenbelastung für eine Infektion wurden Zebrafische eine Reihe von KBE Bakterien verabreicht und die Überlebensraten wurden über 5 Tage überwacht. Einer Zebrafischgruppe wurde das gleiche Volumen PBS (8 μl) wie die Blindkontrolle intraperitoneal injiziert.

Zur Untersuchung der antiinfektiösen Wirksamkeit von Verbindungen wurden den Zebrafischen intraperitoneal S. aureus-Stämme (USA300, Newman, Newman ΔclpP oder MRSA XJ049) mit den angegebenen KBE injiziert. 30 Minuten nach der Infektion wurden Zebrafische nach dem Zufallsprinzip in verschiedene Gruppen eingeteilt, gefolgt von der Verabreichung von Verbindungen in einer Dosis von 25 oder 50 mg/kg und der Vehikelkontrolle. Die Überlebensraten von Zebrafischen wurden 5 Tage lang aufgezeichnet.

Das Infektionsmodell wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methode mit einigen Modifikationen erstellt62. Die Rücken von Mäusen (6 bis 8 Wochen alt, 18–20 g) wurden einen Tag vor der Infektion rasiert und mit Enthaarungscreme behandelt. Übernachtkulturen von S. aureus USA300 wurden im Verhältnis 1:1000 verdünnt und auf OD600 bei 0,6 gezüchtet. Anschließend wurden die Kulturen dreimal mit PBS gewaschen und bei einer Konzentration von 5 × 107 KBE/ml resuspendiert. Vor der Infektion wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 70 mg/kg Pentobarbital-Natrium anästhesiert. Ein Aliquot von 50 µL S. aureus USA300-Suspension (mit 2,5 × 106 KBE) wurde subkutan in den rasierten Bereich injiziert. 16 Stunden nach der Infektion wurden die Mäuse zufällig in verschiedene Gruppen eingeteilt (n = 9 pro Gruppe). Die Läsionsfläche wurde gemessen und unter Verwendung der Formel A = π(L/2) × W/2 (A, Fläche; L, Länge; W, Breite) berechnet. Der Unterschied der anfänglichen Läsionsbereiche hat in jeder Gruppe keine Bedeutung. Dann wurden 50 µL 7,5 mg/kg Verbindungen (gelöst in 5 % DMSO, 20 % PEG 300, 5 % Solutol und 70 % PBS) und Vehikel (als Negativkontrolle) subkutan in die Nähe der infizierten Haut injiziert. Die Behandlungen wurden 3 Tage lang zweimal täglich durchgeführt. Anschließend wurden die Mäuse getötet und die Haut von der darunter liegenden Faszie und dem Muskelgewebe getrennt. Eine der neun Hautproben jeder Gruppe wurde zufällig verwendet und in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Für mikroskopische Beobachtungen wurden dünne Schnitte geschnitten und mit H&E gefärbt. Die verbleibenden acht infizierten Hautproben in jeder Gruppe wurden aseptisch entnommen und gewogen und anschließend in 1 ml PBS homogenisiert. Das seriell verdünnte Homogenat wurde auf TSA-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienzahlen wurden als log10 KBE/mg Gewebe ausgedrückt.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad-Software) durchgeführt. Zum Vergleich der beiden Überlebenskurven wurden Log-Rank-Tests durchgeführt. Zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests wurden durchgeführt, um die Mittelwerte zwischen den Gruppen zu vergleichen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. P-Werte sind in den Abbildungen angegeben. Die Anzahl der unabhängigen Experimente/Mäuse/Proben ist in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle Replikationsversuche sind erfolgreich. Alle Blots und Gele wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und es wird ein einziges experimentelles Bild gezeigt. Experimente zu Hautinfektionen bei Mäusen, SEM und H&E-Färbung wurden einmal durchgeführt. Von jeder Probe wurden mindestens 5 repräsentative SEM-Bilder aufgenommen. In jeder Probe wurden drei repräsentative Bilder der H&E-Färbung aufgenommen und eines ist abgebildet. Alle mit REM oder H&E-Färbung aufgenommenen Bilder zeigten einen ähnlichen Trend.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Daten zu Atomkoordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank (PDB, www.pdb.org) unter dem Zugangscode 7WH5 für ZG180/HsClpP, 7WID für ZG180/SaClpP und 7XBZ für (R)-ZG197 hinterlegt /SaClpP bzw. 7WGS für die (S)-ZG197/SaClpP-Struktur. Weitere in dieser Studie verwendete Röntgenstrukturdaten sind in der PDB-Datenbank unter den Zugangscodes 6TTY, 6TTZ, 3STA und 1TG6 verfügbar. Die Aminosäuresequenz kann im National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Zugangsnummer NP_006003 für HsClpP, CAA06443 für MoClpP, NP_001018520 für DaClpP, KFL07692 für SaClpP und CAD6014684 für EcClpP gefunden werden. Alle relevanten Daten, die in dieser Studie generiert wurden, sind in der Datei mit ergänzenden Informationen und Quelldaten enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Hanne Ingmer (The Royal Veterinary and Agricultural University, Dänemark) für die Schenkung von S. aureus NCTC 8325-4 und 8325-4/ΔclpP und Dr. Jiahai Zhou (Shanghai Institute of Organic Chemistry, China) für die Gabe des pPSUMO-Vektors. Wir danken den Mitarbeitern der Strahllinien BL19U1 und BL02U1 der Shanghai Synchrotron Radiation Facility für die Unterstützung bei der Datenerfassung. Wir danken den Mitarbeitern der Abteilung für Labortiermodelle des Shanghai Public Health Clinical Center der Fudan-Universität für die Unterstützung der Einrichtung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China finanziert (22037007, 81861138046 und 21725801 an C.-GY und 22107109 an TZ).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang.

School of Pharmaceutical Science and Technology, Hangzhou Institute for Advanced Study, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Hangzhou, 310024, China

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Lefu Lan und Cai-Guang Yang

Staatliches Schlüssellabor für Arzneimittelforschung, Zentrum für chemische Biologie, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, 201203, China

Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan und Cai-Guang Yang

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, 100049, China

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan und Cai-Guang Yang

School of Physical Science and Technology, ShanghaiTech University, Shanghai, 201210, China

Weizhong Chen & Quanjiang Ji

Abteilung für Labormedizin, Shanghai East Hospital, Medizinische Fakultät der Tongji-Universität, Shanghai, 200123, China

Min Zhang & Wenjuan Wu

School of Life Sciences, Fudan-Universität, Shanghai, 200433, China

Jianhua Gan

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C.-GY konzipierte das Projekt und betreute die Forschung. BW führte Forschungen mit Hilfe von TZ, PW, YP, JL, WC und MZ durch; TZ synthetisierte Aktivatoren; QJ, WW, LL, JG und C.-GY steuerten Agenten und Datenanalysen bei; BW, TZ, PW und C.-GY haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Cai-Guang Yang.

BW, TZ, PW und C.-GY sind benannte Erfinder der anhängigen Patentanmeldung (CN202210377247.X, beim chinesischen Patentamt), die sich auf die beschriebene Arbeit bezieht. Patentantragsteller ist das Shanghai Institute of Materia Medica der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Der Antragsstatus ist die offizielle Einreichung. Die Strukturen von ZG180, (R)- und (S)-ZG197 sind zum Patent angemeldet. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Die Protokolle für Hautinfektionsexperimente bei Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Shanghai Public Health Clinical Center überprüft und genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten ethischen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Lizenz zur Verwendung von Labortieren (SYXK-HU-2015-0027) ist vom Shanghai Committee of Science and Technology zertifiziert.

Nature Communications dankt Youfu Luo, Dacheng Wang, Maria Bewley und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wei, B., Zhang, T., Wang, P. et al. Antiinfektive Therapie mit artspezifischen Aktivatoren von Staphylococcus aureus ClpP. Nat Commun 13, 6909 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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Eingegangen: 12. April 2022

Angenommen: 07. November 2022

Veröffentlicht: 14. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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