Mikrobielle Mattenzusammensetzungen und Lokalisierungsmuster erklären die Virulenz der Schwarzbandkrankheit bei Korallen

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 15 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Black-Band-Krankheit (BBD) bei Korallen ist durch eine charakteristische, bandartige mikrobielle Matte gekennzeichnet, die sich über das Gewebe ausbreitet und häufig infizierte Kolonien tötet. Die mikrobielle Matte wird von Cyanobakterien dominiert, enthält aber häufig auch sulfidoxidierende Bakterien (SOB), sulfatreduzierende Bakterien (SRB) und andere Mikroben. Die Migrationsrate bei BBD variiert je nach Umgebungsbedingungen, einschließlich Temperatur, Licht und pH-Wert. Es bleibt jedoch unklar, ob Schwankungen in den Migrationsraten Unterschiede im mikrobiellen Konsortium innerhalb der BBD-Matte widerspiegeln. Hier zeigen wir, dass sich die Oberflächenstruktur im Mikromaßstab, die Bakterienzusammensetzung und die räumliche Verteilung bei BBD-Läsionen mit unterschiedlichen Migrationsraten unterschieden. Die Migrationsrate korrelierte positiv mit der relativen Häufigkeit potenzieller SOBs der Arcobacteraceae, die in der mittleren Schicht innerhalb der Matte lokalisiert waren, und korrelierte negativ mit der relativen Häufigkeit anderer potenzieller SOBs der Rhodobacteraceae. Unsere Studie hebt die mikrobielle Zusammensetzung bei BBD als wichtige Determinante der Virulenz hervor.

Cyanobakterien sind häufig Schlüsselorganismen, die in natürlichen Umgebungen mikrobielle Matten bilden. Ein auffälliges Merkmal der Cyanobakterienmatte ist ihre geschichtete Struktur und die spezifischen Schichten, in denen verschiedene trophische Mikroorganismen verteilt sind1. Die obersten Schichten werden im Allgemeinen von aeroben Cyanobakterien, Kieselalgen und anderen sauerstoffhaltigen Phototrophen dominiert, während die untersten Schichten von verschiedenen anaeroben Bakterien dominiert werden. Cyanobakterienmatten kommen in terrestrischen und aquatischen Umgebungen wie Gezeitensandflächen, hypersalinen Teichen, heißen Quellen, Gezeitenzonen und Korallenriffen vor1,2,3. Die vertikale Verteilung der Bakterien kann täglich schwanken4 und die Matten können sich horizontal in radialer Richtung ausdehnen5.

Die Coral Black Band Disease (BBD), die durch eine dunkle, von Cyanobakterien dominierte Mikrobenmatte gekennzeichnet ist, weist eine einzigartige Bandform auf, die linear durch lebendes Korallengewebe wandert (Abb. 1). Das charakteristische schwarze Band wandert über lebendes Korallengewebe, was zur Lyse und Nekrose des darunter liegenden Gewebes führt und ein nacktes Korallenskelett zurücklässt6. Die Breite des schwarzen Bandes zwischen scheinbar normalem Korallengewebe und frisch freigelegtem Skelett kann zwischen einigen Millimetern und sieben Zentimetern liegen7,8. Die Migrationsrate von BBD, die bis zu 2 cm/Tag beträgt9, variiert je nach Temperatur10,11, Licht10,11, pH-Wert12 und unterschiedlichen geografischen Bedingungen13. Innerhalb eines einzelnen Riffs traten gleichzeitig bis zu fünffache Unterschiede in der Migrationsrate auf14.

Repräsentativer BBD zur Einschließung von Montipora sp. Kolonie (a). Nahaufnahme der Grenzfläche mit schwarzem Band, das aus einer Cyanobakterienmatte zwischen lebendem Korallengewebe (gesunder Bereich) und freiliegendem weißem Korallenskelett (nacktes Skelett) bestand (b).

Die Biomasse der polymikrobiellen Matten wird von den filamentösen Cyanobakteriengattungen Oscillatoria, Roseofilum und Pseudoscillatoria dominiert, die jeweils im Indopazifik, in der Karibik und im Roten Meer identifiziert wurden15. Diese Cyanobakterien gehören einer monophyletischen Abstammungslinie an und kommen regelmäßig in BBD-Läsionen vor, was auf ihre zentrale Rolle in der BBD-Ätiologie hinweist15. Weitere häufige mikrobielle Bestandteile der BBD-Läsion sind SOB (z. B. Beggiatoa spp.16 und Rhodobacterales17), SRB (z. B. Desulfovibrio18 und Desulfobacteraceae19), einige verschiedene heterotrophe Bakterien15 und Archaeen20. Cyanobakterien befinden sich im oberen Teil der Mikrobenmatte; Tagsüber finden sich im unteren Teil SOB, SRB und heterotrophe Bakterien; und die aeroben Bakterien, einschließlich SOB, bewegen sich nachts über die Cyanobakterienschicht15. Ein Mechanismus für diese spezielle Verteilung wurde vorgeschlagen. Die Aktivität der Cyanobakterien während des Tages führt zu einem dynamischen vertikalen Mikrogradienten des Sauerstoffs8,21. Während der Nacht bildet sich innerhalb der Matte eine sauerstoffarme Umgebung, und dann vermehren sich die SRB und werden in den anoxischen Bedingungen unter der Matte aktiviert8. Der Sauerstoffmangel und die hohen Sulfidkonzentrationen im SRB sind für Korallengewebe tödlich und gelten daher als die wichtigsten Faktoren für die Ätiologie von BBD15,22. In einigen Studien wurden auch Toxine von Cyanobakterien mit der Nekrose von Korallengewebe an der Läsionsfront in Verbindung gebracht23. Unterdessen sind SOB-Mitglieder in BBD bisher unerklärlich. Gemeinsame SOB-Mitglieder (wie Beggiatoa spp. und/oder Rhodobacterales) stellen einen sehr kleinen Bestandteil der BBD-Mikrobenkonsortien dar, die aus sehr unterschiedlichen geografischen Standorten stammen17,19,20,24,25,26,27,28. Dies deutet darauf hin, dass die SOB-Aktivität selbst nicht der primäre Auslöser der BBD-Pathogenese ist, sondern dass ihr Mangel möglicherweise zur Anreicherung von Sulfid in den BBD-Läsionen beiträgt15. Dennoch ergaben andere Untersuchungen aus dem Roten Meer, dass Arcobacter sp. (dh die anderen lebensfähigen SOB-Mitglieder) kam in BBD-Läsionen sehr häufig vor28. Darüber hinaus haben BBDs im Sommer, wenn sie sehr aktiv sind, im Vergleich zu den nicht aktiven BBDs im Winter und dem abnehmenden Stadium der BBDs im Herbst auch eine geringe Bakterienvielfalt und ein ähnliches Bakterienzusammensetzungsmuster gezeigt29. Ein BBD-Vorläufer, bekannt als Cyanobakterium-Patch-Zustand (CP), zeigte im Vergleich zum normalen BBD-Zustand ebenfalls eine niedrige Migrationsrate und eine hohe Bakterienvielfalt20. Aufgrund der Komplexität und Dynamik des BBD-Mikrobenkonsortiums sind die Ätiologie und die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenese und Virulenz von BBD immer noch ungeklärt15, insbesondere wenn es um ihren Zusammenhang mit der Zusammensetzung und Lokalisierung der Bakterien geht. Darüber hinaus wurden feinskalige mikrobielle Lokalisierungen innerhalb von BBD-Läsionen nicht vollständig geklärt, und dies könnte die BBD-polymikrobielle Dynamik aufklären15.

Um das mikrobielle Konsortium zu charakterisieren, das an der Virulenz von BBD beteiligt ist, untersuchten wir, wie sich die Zusammensetzung und Lokalität der Bakteriengemeinschaften mit der BBD-Migrationsrate (ein Indikator für Virulenz) unterschied. Diese Studie untersuchte speziell, wie sich die polymikrobiellen Konsortien innerhalb von BBD-Läsionen in Bezug auf die Migrationsraten unterscheiden, und zwar mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops (REM), der Sequenzierung der Bakteriengemeinschaft und einer kombinierten Methode aus Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und nicht entkalktem Korallenschnitt. Um regionale Unterschiede zu berücksichtigen, wurden BBD-Proben an zwei geografischen Standorten in Okinawa, Japan, gesammelt (ergänzende Abbildung 1).

Auf Sesoko Island und Aka Island, Okinawa (ergänzende Abbildung 1), wiesen 38 BBD-Läsionen (eine Läsion pro Kolonie; jeweils n = 9 im Jahr 2014 und jeweils n = 10 im Jahr 2015) aus unterschiedlichen Tiefen lineare Migrationsraten im Bereich von 0,30 auf auf 6,36 mm/Tag (ergänzende Abbildung 2a). Es wurde keine Korrelation zwischen der Migrationsrate und der Tiefe gefunden (Rangkorrelation nach Spearman, ⍴ = 0,21, p-Wert = 0,21). Darüber hinaus schwankte die Wassertemperatur zwischen den Standorten und Jahren (ergänzende Abbildung 2b), es gab jedoch keinen Unterschied in den Migrationsraten, die für jeden Standort und jedes Jahr profiliert wurden (einfaktorielle ANOVA, F = 0, 95, p-Wert = 0, 43). Alle achtzehn BBD-Läsionen aus dem Jahr 2014 und eine zufällige Auswahl von zwölf der 20 BBD-Läsionen aus dem Jahr 2015 wurden in der nachgelagerten Analyse sowohl der SEM-Beobachtung als auch einer Kombination aus 16 S-Bakterienprofilierung und FISH verwendet.

SEM-Bilder der BBD-Mattenoberfläche neben gesundem Korallengewebe zeigten morphologisch das Vorhandensein zahlreicher Mikroben, bestehend aus dünneren filamentösen Cyanobakterien (ergänzende Abbildung 3a), relativ dickeren filamentösen Cyanobakterien (ergänzende Abbildung 3b) und filamentösen Mikroorganismen (ergänzende Abbildung 3c). andere stäbchenförmige Bakterien (ergänzende Abbildung 3d) und zwei Arten von Ciliaten (ergänzende Abbildung 3e-f). Strukturen von extrazellulären Polymersubstanzen (EPS) wurden auf der Oberfläche der Cyanobakterien-Aggregation in den Proben von Aka Island beobachtet, wohingegen EPS-Strukturen im Allgemeinen nicht auf den einzelnen Cyanobakterienfilamenten von Sesoko Island beobachtet wurden (Abb. 2). Unabhängig vom Vorhandensein oder Fehlen der EPS-Matrizen waren die in den BBD-Matten beider Standorte gefundenen Mikroorganismen morphologisch ähnlich. Im BBD-Bereich, innerhalb von 1 mm von der Grenze des gesunden Korallengewebes, dominierten die dünneren filamentösen Cyanobakterien (ergänzende Abbildung 3a) die Matte in allen Proben, unabhängig von Ort und Migrationsrate (Abb. 2). Die dickeren filamentösen Cyanobakterien (ergänzende Abbildung 3b) wurden nur in den Proben mit Migrationsraten von 2,74 mm/Tag von der Insel Aka und 4,18 mm/Tag von der Insel Sesoko gefunden. Die filamentösen Mikroorganismen (ergänzende Abbildung 3c) traten in den Proben beider Standorte mit Migrationsraten von 1,89 mm/Tag bis 3,99 mm/Tag auf. Die Ciliaten zeigten zwei unterschiedliche Formen: einen länglichen, röhrenförmigen Körper (Typ A, ergänzende Abbildung 3e) und einen pelletartigen Körper (Typ B, ergänzende Abbildung 3f). Die Ciliaten vom Typ A und B wurden weit verbreitet auf der Oberfläche in Proben mit unterschiedlichen Migrationsraten im Bereich von 0,30 bis 5,63 mm/Tag bzw. 1,53 bis 5,96 mm/Tag beobachtet.

Die Probe von Sesoko Island (a, obere Teile in Tafel b) zeigt Cyanobakterienfilamente mit Nichtverunreinigungen auf den Oberflächen als Aka Island. Auf der Insel Aka zeigten die Proben (untere Teile in Tafel b und c) extrazelluläre Polymersubstanzen (EPS) auf den Oberflächen. Vergleich der Oberflächenerscheinungen zwischen zwei Standorten über verschiedene Migrationsraten hinweg (b). Maßstabsbalken geben 200 µm (a und c) und 20 µm (b) an. Die Richtung der BBD-Migration verläuft von rechts nach links (a und c).

Zwölf separate BBD-Banden (eine Bande pro einzelne Kolonie) mit unterschiedlichen linearen Migrationsraten im Bereich von 2,13 bis 6,36 mm/Tag (Abb. 3a) enthielten eine Vielzahl von Bakteriengemeinschaften (Abb. 3b). Die Alpha-Diversität der Bakterien (aufgedeckt durch beobachtete OTUs und Chao1-Reichtumsindizes) korrelierte negativ mit den Migrationsraten (Rangkorrelation nach Spearman, ⍴ = −0,80, p-Wert < 0,01 und ⍴ = −0,74, p-Wert < 0,01) (Abb. 3c). Als Vorsichtsmaßnahme wurde eine Stichprobe von Zusammensetzungsdaten (SF_04), die eine geringe BBD-Migration (2,34 mm/Tag) und eine hohe Diversität zeigte, als potenzieller Ausreißer identifiziert (Z-Score = 3,04). Ohne den Ausreißer zeigte das Ergebnis immer noch eine signifikant negative Korrelation mit der Migrationsrate (Rangkorrelation nach Spearman, ⍴ = −0,76, p-Wert < 0,01 für beobachtete OTUs und ⍴ = −0,68, p-Wert < 0,05 für Chao1-Reichtumsindizes). Um Verzerrungen aufgrund der Zusammensetzungsdaten im Zusammenhang mit der Migration zu vermeiden, haben wir für die nachgelagerten Analysen eine zentrierte Log-Ratio-Transformation (clr) auf unsere Daten angewendet und diese in einer transformationsbasierten Hauptkomponentenanalyse (tb-PCA; Abb. 3d) visualisiert ). Ort und Tiefe der Probenahme hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Unterschiede in den clr-transformierten Bakteriengemeinschaften auf Familienebene (PERMANOVA, Ort: R2 = 0,12, p-Wert = 0,21; Tiefe: R2 = 0,06, p-Wert = 0,76; und beides). Ort und Tiefe: R2 = 0,07, p-Wert = 0,75). Um die Korrelation zwischen den Distanzmatrizen basierend auf der Migrationsrate und der clr-transformierten Häufigkeit der Bakteriengemeinschaft zu beurteilen, wurde ein Mantel-Test durchgeführt und zeigte keine signifikante Korrelation (R: 0,06786, p-Wert: 0,297). Das Muster der teilweisen Korrelation zwischen repräsentativen Bakterien auf Familienebene und den Migrationsraten wurde jedoch durch die clr-Transformationsmatrix verifiziert. Nur zwei potenzielle SOB-Familien, die Rhodobacteraceae und Arcobacteraceae, korrelierten signifikant negativ bzw. positiv mit den linearen Migrationsraten (Rangkorrelation nach Spearman, ⍴ = –0,59, p-Wert < 0,05, ⍴ = 0,85 und p-Wert < 0,01) (Abb . 4 und Ergänzungstabelle 3). 44 OTUs (operative taxonomische Einheiten) in allen Proben gehörten zur Familie der Rhodobacteraceae (Ergänzungstabelle 1) und nur zwei OTUs (OTU 6 und OTU24) im Bereich von 0,01 bis 13,47 % bzw. 0,01 bis 6,96 %. hatten > 1 % der gesamten relativen Häufigkeit bei der Gesamtsummenskalierung (Ergänzungstabelle 2). OTU 6 wurde der Gattung Ruegeria zugeordnet und stimmte genau mit der Sequenz eines nicht kultivierten Alpha-Proteobakteriums 128-64 (AF473938) überein, das aus BBD im Karibischen Meer gewonnen wurde (Ergänzungstabelle 2). OTU 24 wurde als Gattung Thalassobius identifiziert und war 100 % ähnlich sowohl einem unkultivierten Bakterienklon BBD-Aug08-3BB-36 (GU472129) als auch einem unkultivierten Bakterienklon Otu0020 (MH341656) in einer BBD-Matte aus dem Roten Meer (Ergänzungstabelle 2). ). Als lebensfähige Sulfidoxidationsmittel oder heterotrophe Bakterien (siehe ausführlichere Diskussion) wurden Arcobacteraceae mit 14 OTUs in allen BBD-Proben über die verschiedenen Migrationsraten hinweg gefunden, drei davon waren OTU 8, OTU 9 und OTU11, die zwischen 0,54 lagen - 10,84 % in sechs Proben, 0,03 - 10,81 % in neun Proben bzw. 0,01 - 5,46 % in allen Proben, bei Gesamtsummenskalierung (Ergänzungstabelle 2). Alle drei OTUs in den Arcobacteraceae waren eng mit Bakterien verwandt (mit 98,88 bis 100 % Ähnlichkeit), die bei BBD im Indopazifik und im Karibischen Meer beobachtet wurden (Ergänzungstabelle 2). Sechs der 14 OTUs (einschließlich repräsentativer OTU 9) in den Arcobacteraceae korrelierten positiv mit den Migrationsraten (ergänzende Abbildung 4a). Bei einer phylogenetischen Platzierung von OTU-Kurzablesungen waren die 14 OTUs in der Familie der Arcobacteraceae im Referenzbaum weit voneinander entfernt, obwohl einige OTUs in Gruppen zusammengefasst waren. Beispielsweise sind OTU 8 und OTU 1074 in einem Cluster zusammengefasst (ergänzende Abbildung 4b). Drei OTUs (OTU 27, OTU 192 und OTU 952) gehörten zur Gattung Malarcobacter, eine OTU (OTU 144) gehörte zur Gattung Halarcobacter und andere OTUs wurden in eine nicht kultivierte Gruppe eingeteilt (ergänzende Abbildung 4b). Obwohl andere Familien (weitere Einzelheiten in der Ergänzungstabelle 3 und der Ergänzenden Anmerkung 1) keine signifikante Korrelation zeigten, wie z. B. Cyanobakterien, die zu den Desertifilaceae gehören, stiegen sie tendenziell zusammen mit den Migrationsraten positiv an (Ergänzungstabelle 3).

Entlang verschiedener Migrationsraten von BBD von zwei Standorten (a) zeigen Blasendiagramme die relative Bakterienhäufigkeit (dargestellt nach Größe) der 24 größten Familien, nicht klassifizierter Bakterien und anderer (durchschnittlich <0,5 % dieser relativen Häufigkeit gepoolt) insgesamt Summenskalierung (b). Signifikante Korrelationen zwischen Migrationsraten und Alpha-Diversitäten (OTU-Reichtum und Chao1-Index) aus BBD, berechnet durch Spearmans Rangkorrelation bei der Gesamtsummenskalierung (c). Die graue Schattierung zeigt 95 %-Konfidenzintervalle für die Spearman-Rangkorrelation (c). Eine clr-transformierte Hauptkomponentenanalyse (tb-PCA), die die Bakteriengemeinschaften (Familienebene) in BBD darstellt (d). Die mit „AF“ und „SF“ gekennzeichneten Proben-IDs wurden jeweils auf der Insel Aka und der Insel Sesoko gesammelt.

Die clr-transformierte Matrix für jede Familie (a: Rhodobacteraceae und b: Arcobacteraceae) wurde über die OTUs summiert. Signifikante Korrelation markiert als * p < 0,05 und ** p < 0,01. Der schattierte graue Bereich stellt das 95 %-Konfidenzintervall dar.

Um die Lokalisierung von Bakterien in BBD über unterschiedliche Migrationsraten hinweg zu untersuchen, verwendeten wir FISH, um die Bakterienverteilung in denselben BBD-Proben zu untersuchen, die in der Analyse der Bakteriengemeinschaft verwendet wurden. Angesichts der Tatsache, dass Sequenzen, die zur Familie der Arcobacteraceae gehören, einen signifikanten Anstieg der Migrationsrate zeigten (Abb. 4b), verwendeten wir die Sonde Arc9430 zusammen mit der Breitband-Bakteriensonde EUB338mix31, um auf Arcobacteraceae abzuzielen. Vor der Durchführung des FISH haben wir die neu entwickelte Sonde, die die 14 OTUs in Arcobacteraceae abdecken könnte, mithilfe einer In-silico-Analyse evaluiert. Zehn der 14 OTUs, darunter zwei repräsentative OTUs (OTU 8 und OTU 9), wurden auf der Grundlage der phylogenetischen Platzierungsanalyse ideal auf die spezifische Sonde Arc94 abgestimmt (ergänzende Abbildung 4b).

Um die intakte Bakterienverteilung und ihre Lokalität in den Korallen, einschließlich ihres Gewebes und Skeletts, sichtbar zu machen, verwendeten wir eine kürzlich etablierte Methode, bei der FISH32 mit nicht entkalkten Korallenschnitten33 kombiniert wurde. Obwohl in der Korallenskelettregion unspezifische Bindungssignale der FISH-Sonde nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung 5), konnten wir die Bakterienlokalisation innerhalb des Korallengewebes und intakter Skelettstrukturen erfolgreich visualisieren (ergänzende Abbildung 6).

Viele EUB338mix-Sondensignale deuteten auf eine bakterielle Lokalisierung in der Mikrobenmatte von der Grenze des gesunden Korallengewebes bis zum schwarzen Band hin. Unterdessen waren im gesunden Gewebe keine oder nur wenige EUB338mix-Sondensignale vorhanden. Die bakterielle Lokalisierung zeigte eine vertikal geschichtete Struktur in der von Cyanobakterien dominierten Matte, wobei Cyanobakterien die oberste Schicht bedeckten, während sich viele Bakterien um nekrotische Korallengewebe und symbiotische Dinoflagellaten unterhalb der Cyanobakterienschicht ausbreiteten (Abb. 5a). In Serienschnitten wurden mit der spezifischen Sonde Arc94 auch Ansammlungen und einzelne Zellen von Arcobacteraceae unter der Cyanobakterienschicht beobachtet (Abb. 5b). Während Bakterienansammlungen aus EUB338mix-Signalen eine Vielzahl individueller Formen aufwiesen (Abb. 5c), zeigten Arcobacteraceae-Ansammlungen eine nahezu gleiche Zellmorphologie (stäbchenförmige Bakterien, Abb. 5d). Darüber hinaus deutete das Verteilungsmuster der Arcobacteraceae auf deren enge Assoziation mit nekrotischen Korallengeweben hin (Abb. 5d).

Konfokale Fusionsmikroskopaufnahmen der mikrobiellen Mattenstruktur von BBD mit Autofluoreszenz (blau zeigt Korallengewebe und grün zeigt Chlorophyll aus symbiotischen Dinoflagellaten [Sym] und Cyanobakterien) und den hybridisierten Bakterien mit der Sondenmarkierung Cy3 (rot) (Anzeige). Cyanobakterien werden in gelber Farbe dargestellt, die zwei Kanäle aus der Autofluoreszenz von Chlorophyll und bakteriellen Signalen mit Cy3 (a und c) zusammengeführt haben. Gepunktete Linien in a und b markieren vergrößerte Nahbereiche (c und d). Hybridisierte Signale von Arcobacteraceae zeigen ihre Ansammlungen und verstreuten Zellen (gepunktete Linie und gelbe Pfeilspitzen in b). Maßstabsbalken repräsentieren 30 µm.

Um den Zusammenhang zwischen Bakterienlokalität und Migrationsrate zu untersuchen, wurden die Bereiche der Bakterienpräsenz aller Bakterien und Arcobacteraceae in der oberen, mittleren und unteren Schicht der Mikrobenmatten räumlich quantifiziert (jedes vertikale Intervall 1 mm, Abb. 6a) und im Vergleich zu den Migrationsraten. Angesichts der SEM-Beobachtungen und der Analyse der Bakteriengemeinschaft, die zeigten, dass die dominanten Cyanobakterien immer in der oberen Schicht vorkamen, wurde der Bereich der filamentösen Cyanobakterien in dieser quantitativen Analyse ausgeschlossen (im Folgenden wird der „Bereich aller Bakterien“ als eine Bakterienverteilung ohne Ausnahme definiert). Cyanobakterien). FISH wurde mit den Sonden EUB338mix und Arc94 an Serienschnitten durchgeführt, damit die Verteilungen der Zielbakterien optimal verglichen werden konnten (Abb. 6b, c). Der Nachweisbereich aller Bakterien, der mit der EUB338mix-Sonde gemessen wurde, war größer als der Bereich der Arcobacteraceae, der mit einer spezifischen Arc94-Sonde gemessen wurde (Abb. 6d). Beide FISH-Signale wurden in allen drei Schichten mit unterschiedlichen Migrationsraten nachgewiesen (Abb. 6e – j). In der Oberflächenschicht zeigte der Nachweis aller Bakterien und Arcobacteraceae keinen Zusammenhang mit der Migrationsrate (Abb. 6e, f). Nur in der mittleren Schicht nahm die Fläche der Arcobacteraceae mit der Migrationsrate zu (adj. R-Quadrat 0,04 und p-Wert < 0,05) (Abb. 6g, h). Im Gegensatz dazu zeigte die Fläche aller Bakterien einen signifikant positiven Zusammenhang mit der Migrationsrate, allerdings nur in der unteren Schicht (adj. R-Quadrat 0,06 und p-Wert < 0,05) (Abb. 6I, g).

Schematische Darstellung, die drei Schichten (Oberfläche, Mitte und Boden; jeder vertikale Abstand beträgt 1 mm) in BBD-Matten für die räumliche Analyse zeigt (a). Konfokale Zusammenführungsmikroskopaufnahmen, die die räumliche bakterielle Lokalisierung (rot) aller Bakterien (b) und Arcobacteraceae (c) in zwei Serienschnitten zeigen; hybridisiert mit EUB338mix- bzw. Arc94-Sonden. Maßstabsbalken zeigen 50 µm an (b und c). Mit dem Boxplot verschmolzene Punktdiagramme zeigen die gesamte Fläche sowohl aller Bakterien (außer filamentösen Cyanobakterien) als auch der Arcobacteraceae-Detektionen in den verschiedenen Migrationsraten (durch Farbe dargestellt; die Proben-IDs „AF“ und „SF“ weisen auf die Sammlung von Aka Island und Sesoko Island hin , bzw.) (d). Die Mittellinien des Boxplots stellen die Medianwerte dar, die Boxgrenzen sind 25 und 75 % der Stichprobe und die in Balken dargestellten oberen und unteren Quartile sind 5 und 95 % der Stichprobe (d). Lineare Regressionen, die die Zusammenhänge zwischen Migration und Bereichen mit bakterieller Präsenz (alle Bakterien [e, g und i] und Arcobacteraceae [f, h und j]) in der Oberfläche (e und f), in der Mitte (g und h) zeigen. und untere Schichten (I und j). Signifikante Korrelation wird in Rot dargestellt, mit * p-Wert < 0,05.

In dieser Studie haben wir mithilfe einer neuartigen Kombination aus 16 S-Bakterienprofilierung, nicht entkalktem Schnitt und FISH erfolgreich gezeigt, dass die Migration (dh ein Proxy für Virulenz) von Cyanobakterien dominierten Mikrobenmatten sowohl mit der Bakterienzusammensetzung als auch mit der räumlichen Lokalisierung zusammenhängt. Die BBD-Bakteriengemeinschaft in dieser Studie, die ein einzigartiges Migrationsmuster als bandartiger Biofilm zeigte, bestand aus Gruppen, die mit zunehmender Migrationsrate weniger vielfältig wurden. In der Analyse der Bakteriengemeinschaft stellten wir außerdem fest, dass die relative Häufigkeit der Familien Rhodobacteraceae und Arcobacteraceae eine negative bzw. positive Korrelation mit den BBD-Migrationsraten aufwies. Darüber hinaus nahm mit zunehmender BBD-Migrationsrate die Population der Arcobacteraceae in der mittleren Schicht deutlich zu, während alle nicht-cyanobakteriellen Populationen in der unteren Schicht zunahmen.

Arcobacteraceae wurde kürzlich als neue Familie (in der Reihenfolge Campylobacterales, der Klasse Campylobacteria und dem Phylum Campylobacterota) aus der Gattung Arcobacter im Phylum Epsilonproteobacteria34 vorgeschlagen. Anschließend wurden sechs benannte Gattungen vorgeschlagen und aus der ursprünglichen Gattung Arcobacter in Arcobacteraceae entfernt35. Kürzlich wurde jedoch ein neuer Vorschlag von On et al. hat die Gattungen der Familie Arcobacteraceae erneut in die einzige Gattung Arcobacter umgegliedert36. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Arcobacteraceae (= Arcobacter sensu lato34,35,36) maßgeblich an der Pathogenität von BBD beteiligt sind. Das Vorkommen von Arcobacter bei BBD wurde häufig in einer Vielzahl geografischer Regionen in der Karibik, im Indopazifik und im Roten Meer gemeldet28,29,37,38. Arcobacteraceae sind im Allgemeinen aerotolerant, psychrotrophe36 und in der Umwelt und bei Tieren allgegenwärtig39. Unter Berücksichtigung des räumlich (insbesondere vertikal) und zeitlich heterogenen oxischen Zustands innerhalb der BBD-Matte40 lässt unsere Feststellung, dass Arcobacteraceae-Populationen in allen BBD-Schichten mit niedrigen bis hohen Migrationsraten auftraten, darauf schließen, dass die mit BBD assoziierten Arcobacteraceae aerotolerant sind.

Ein aus Meeresumgebungen isoliertes Mitglied der Arcobacteraceae wurde durch In-vitro- und In-silico-Analysen entweder als autotrophes oder chemolithoheterotrophes Sulfidoxidationsmittel identifiziert41,42,43. In einer früheren BBD-Studie verringerte sich die relative Häufigkeit von Rhodobacteraceae während des BBD-Entwicklungsübergangs vom BBD-Vorläufer, einem so genannten „Cyanobakterienpflaster“ (CP), der langsamer voranschritt, während die relative Häufigkeit von Arcobacter spp. nahm zu, als sich BBD mit zunehmender Virulenz entwickelte20. Der Beitrag von Rhodobacterales zur BBD wurde durch Profilierung unter Verwendung eines wichtigen funktionellen Gens (soxB) für die Sulfidoxidation bei BBD bestätigt. Allerdings nahm die relative Häufigkeit der mit Rhodobacterales assoziierten soxB-Gene in der BBD-Matte im Vergleich zu CP17 stärker zu. Von Arcobacter abgeleitete soxB-Gene wurden nicht nachgewiesen, vermutlich weil die universellen Primer für soxB-Gene nicht in der Lage sind, Sequenzen aus der Gattung Arcobacter44 zu identifizieren. Tatsächlich ergab eine Shotgun-Metagenom-Sequenzierungsstudie, die frei von PCR-Verzerrungen war, Arcobacter als Hauptmitglieder von SOB bei BBD38. Insgesamt besteht eine starke Wahrscheinlichkeit, dass Arcobacter im BBD-Konsortium eine Rolle in der Sulfidoxidationsstufe des Schwefelkreislaufs spielt. Da schwefeloxidierendes Arcobacter außerdem sehr resistent gegen hohe Schwefelwasserstoff- und niedrige Sauerstoffwerte ist und somit effektiv mit anderen gleichzeitig auftretenden SOBs konkurriert, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine funktionelle Nische der Sulfidoxidation in der BBD möglicherweise von Rhodobacteraceae auf Arcobacteraceae übertragen wurde als die BBD-Virulenz höher wurde.

Unsere Ergebnisse von FISH zeigten, dass die Population von Arcobacteraceae, insbesondere in der mittleren Schicht der BBD-Matte, leicht, aber positiv mit den Migrationsraten korrelierte. Obwohl sich die vertikalen chemischen Verteilungen von Schwefelwasserstoff und Sauerstoff in der BBD-Matte dynamisch von Tag zu Tag (niedriger Schwefelwasserstoff und Sauerstoff nimmt vertikal mit der Mattentiefe ab) bis nachts (schwefelwasserstoff steigt vertikal an und die Matte wird vollständig anoxisch)40 ändert, könnte Arcobacter dazu in der Lage sein in jedem Zustand zu vermitteln und seine Fülle aufrechtzuerhalten46. Darüber hinaus wurde berichtet, dass ein Mitglied von Arcobacter (Candidatus A. sulfidicus) ein hochbewegliches Mikroaerophil ist, was typisch für Organismen zu sein scheint, die an oxisch-anoxischen Grenzflächen leben45. In Anbetracht des chemischen Zustands in BBD am Tag40, an dem wir Proben gesammelt haben, könnte die mittlere Schicht der BBD-Matte es den Arcobacteraceae ermöglichen, sich zu vermehren und sich an die Umweltbedingungen, einschließlich Schwefelwasserstoff- und Sauerstoffgehalt, anzupassen und gleichzeitig durch das Sulfid das Sulfat für SRB bereitzustellen Oxidation und spielen eine Rolle bei der Förderung oder Veränderung der Migration des Konsortiums, die mit der BBD-Virulenz in Zusammenhang stehen könnte. Da die Gattung Arcobacter außerdem über den vollständigen Satz an Genen verfügt, die gemäß der Gesamtgenomvorhersage46 für die assimilatorische Sulfatreduktion verantwortlich sind, sind zukünftige Studien erforderlich, um die Rolle von Arcobacteraceae nicht nur bei der Sulfidoxidation, sondern auch bei der Sulfatreduktion in der BBD-Matte zu bestätigen.

Arcobacteraceae in BBD könnten sich auch als Krankheitserreger verhalten, die Korallengewebe direkt schädigen. Arcobacter wurde auch häufig in erkrankten Läsionen vieler anderer Korallenkrankheiten als BBD nachgewiesen, wie zum Beispiel White Pox47, White Syndrome48, Brown Band Disease48 und Stony Coral Tissue Loss Disease49 in den Korallenriffen der Welt. In-vitro-Tests menschlicher und tierischer Zellkulturen haben gezeigt, dass Arcobacter eine erhebliche Virulenz aufweist, wenn es um die Bildung von Kolonien und die Etablierung einer Infektion im Wirtsgewebe geht50,51, und es ist auch bekannt, dass die meisten Arcobacter mit Virulenzgenen wie ciaB und irgA ausgestattet sind , und cadF52,53. Daher erfordert das Vorkommen von pathogenetischen Arcobacter in Meeresorganismen weitere gezielte Forschung.

Biofilme sind an vielen klinischen Infektionen beteiligt, und die gesammelten Erkenntnisse zeigen, dass Biofilme zur Pathogenese beitragen, insbesondere bei chronischen Infektionen54 und oraler Plaque55. Unter den pathogenen Biofilmen gehören zu den am besten untersuchten Systemen menschliche Mundplaques. Nach einer teilweisen Beseitigung des polymikrobiellen Biofilms durch physische Entfernung wiederholt sich der Kolonisierungszyklus im gleichen allgemeinen räumlich-zeitlichen Sukzessionsübergang, bis eine reife Mikrobengemeinschaft wiederbevölkert ist56. Während des Übergangs variieren die frühe bakterielle Besiedlung und Zusammensetzung von Individuum zu Individuum, aber die am häufigsten vorkommenden Gattungen bleiben normalerweise erhalten. Es wird oft angenommen, dass abrupte oder subtile Veränderungen in der Bakterienzusammensetzung krankheitsassoziierte Phänotypen fördern57. Spezifische polymikrobielle Assoziationen bei menschlicher Parodontitis können die Schwere und das Fortschreiten der Erkrankung verschlimmern57. Bei BBD wurde gezeigt, dass die Vielfalt der Alphabakterien negativ mit der Migration korreliert. Frühere Studien haben ergeben, dass inaktives BBD und CP (Cyanobakterienpflaster) mit einer hohen Bakterienvielfalt und nicht migrierenden bzw. niedrigen Migrationsraten verbunden sind20,29. Das FISH-Ergebnis zeigte einen leichten Anstieg der Bakterienpopulation zusammen mit einer zunehmenden Migrationsrate und könnte darauf hindeuten, dass das BBD-Bakterienkonsortium komplex sein könnte, wobei sich in einzelnen BBD-Matten eine geringe Diversität vermehrt. Die Variation der BBD-Migrationsraten konnte jedoch nicht mit den spezifischen Bakteriengemeinschaften in Verbindung gebracht werden, die bei BBD mit einer hohen Migrationsrate auftraten. Tatsächlich trat die Bakterienfamilie Vibrionaceae, zu der einige Arten gehören, die als Korallenpathogene58,59 bekannt sind, unabhängig vom Migrationsgradienten auf (Abb. 2b). Dennoch wurde ein Trend zur Abnahme von Rhodobacteraceae und zur Zunahme von Arcobacteraceae bei BBD mit hoher Migrationsrate mit Sicherheit bestätigt.

Im FISH-Experiment zeigten Bakterien in der BBD-Mikrobenmatte räumliche Verteilungsmuster mit unterschiedlichen Migrationsraten. Außer der Population der Arcobacteraceae zeigten alle Bakterienpopulationen in der unteren Schicht eine schwache positive Korrelation mit der BBD-Migrationsrate. In Kombination mit den Ergebnissen der Bakteriengemeinschaft deutete unsere mikrobielle Visualisierung darauf hin, dass die Struktur der Bakteriengemeinschaft, die mit einer hohen BBD-Virulenz verbunden ist, unter starker Selektion gedeiht, die andere Bakterien, insbesondere in der unteren Schicht, ausschließt. In der unteren BBD-Schicht, wo auch tagsüber mit sauerstoffarmen oder anoxischen Bedingungen zu rechnen ist15, könnte möglicherweise eine Nische sowohl für SRB als auch für anaerobe Heterotrophe geschaffen werden.

Diese Studie zeigt zum ersten Mal den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Bakterienzusammensetzung/räumlichen Lokalisierung und der Migrationsrate von BBD, insbesondere BBD in Montipora-Korallen. Kurz gesagt, diese Studie liefert neue Einblicke in die mikrobielle Dynamik von BBD und zeigt, dass das mikrobenvermittelte Pathogenesemodell bei BBD komplizierter ist als bisher angenommen. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass Arcobacteraceae eine der Schlüsselgrundlagen in der Bakteriengemeinschaftsstruktur virulenter BBD sein könnte. Angesichts der positiven Korrelation zwischen Arcobacteraceae und BBD-Virulenz schlagen wir Arcobacteraceae als potenziellen Biomarker für BBD-Virulenz vor. Diese Ergebnisse sollten an anderen verschiedenen Korallenarten getestet werden, da bekannt ist, dass viele Arten von BBD betroffen sind. Darüber hinaus fördern wir die weitere Erforschung anderer Korallenkrankheiten mithilfe unserer neu entwickelten Kombination aus Bakteriengemeinschaft und FISH mit nicht entkalkten Schnitttechniken, um die Bakterienzusammensetzung/intakte räumliche Lokalisierung sowie die Virulenz von Korallenkrankheiten aufzudecken.

Diese Studie wurde an zwei Riffen in der Nähe der Insel Sesoko (26°38′35,2″N, 127°51′49,5″E) und der Insel Aka (26°12′00,0″N, 127°16′45,0″E) in Okinawa durchgeführt. Japan (Ergänzende Abbildung 1). Die Standorte liegen etwa 70 km voneinander entfernt und haben zwischen sich offenes Meer. Im Sommer 2014 (n = 9 an jedem Standort) und 2015 (n = 10 an jedem Standort) wurden insgesamt 38 BBD-infizierte, verkrustende Montipora-Kolonien hinsichtlich ihrer linearen Migrationsraten gemessen. Um die lineare Migrationsrate von BBD in jeder einzelnen Kolonie zu bestimmen, wurden sowohl drei Tage vor der Probenahme als auch am Tag der Probenahme Fotos von der Vorderseite der BBD-Läsion in einem flachen Bereich der Kolonie gemacht. Die durchschnittlichen linearen Migrationsraten (mm/Tag) von BBD als Variable in den folgenden Modellen wurden an fünf zufälligen Punkten in der Region jeder Kolonie mit der Fidschi-Software60 berechnet. Wir haben während der Beobachtung auch die Tiefen für jede BBD-infizierte Kolonie gemessen und die Wassertemperatur (in Abständen von einer Stunde) mit einem Onset HOBO Pendant Logger® aufgezeichnet. Um die Korrelation zwischen der Migrationsrate und der Tiefe zu beurteilen, wurde die Rangkorrelation nach Spearman mit der Statistiksoftware R v4.0.261 durchgeführt. Der Vergleich der Varianz der Migrationsraten über Standorte und Jahre hinweg wurde auch durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (einfaktorielle ANOVA) mit der Statistiksoftware R v4.0.261 verifiziert.

Für nachgelagerte Analysen wurden die Proben aller 18 Kolonien im Jahr 2014 und 12 von 20 Kolonien im Jahr 2015 (n = 6 von jedem Standort) für die Rasterelektronenmikroskop-Beobachtung (REM) und die kombinierte Analyse der Bakteriengemeinschaft bzw. der FISH entnommen. Jede Probe (eine Probe pro einzelne Kolonie) der BBD-Region, die gesundes Gewebe und Skelett enthielt (ungefähr 3–4 cm lang und breit und 1 cm tief), wurde mit einem Hammer und einem Meißel an der Stelle geschnitten, an der die lineare Migration stattfand Es wurden Raten gemessen. Für die SEM wurden die Proben auf ein etwa 1 cm großes Quadrat zugeschnitten, sofort mit 2 % Glutaraldehyd (GA) in 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) auf Eis fixiert und anschließend bei 4 °C gelagert. Für die Analyse der Bakteriengemeinschaft und die FISH-Kombinationsanalyse wurden die Proben in zwei Stücke von jeweils etwa 2 cm² geschnitten. Eine Probe wurde mit einem sterilisierten Lederstanzer (4 mm Kreisdurchmesser) aus dem schwarzen Band ausgestanzt und das Band zur Analyse der Bakteriengemeinschaft in 300 µl 100 % Ethanol bei –80 °C gelagert. Die zweite Probe (ungefähr ein Quadrat von 2 cm) wurde sofort 8 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS (Wako, Japan) bei 4 °C fixiert, dreimal mit 70 % Ethanol gespült und in 70 % Ethanol gelagert 4 °C für FISCH unten.

Die GA-fixierten Proben (n = 18) wurden dreimal 15 Minuten lang sanft in PBS gespült und in einer Ethanol/Wasser-Gradientenreihe (20, 40, 60, 70, 90 und 100 % einmal und absolutes Ethanol) dehydriert dreimal) für jeweils 20 Min. bei Raumtemperatur. Dehydrierte GA-fixierte Proben wurden in ABS getaucht. Ethanol/t-Butylalkohol abgestufte Reihe (7:3 und 1:1 für jeweils 15 Minuten), 60 Minuten lang bei über 25,5 °C in tert.-Butylalkohol überführt und nach Austausch des alten tert.-Butylalkohols in einen Kühlschrank gestellt mit neuem Alkohol. Die Proben wurden unter Verwendung eines Gefriertrocknungsgeräts (VFD-21S, SHINKKU VD, Japan) 3 Stunden lang getrocknet und im Ionensputterverfahren mit einer Platin/Palladium-Legierung beschichtet (E-1010, HITACHI, Japan). Beobachtung und Bildaufnahme wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEMS-3500N, HITACHI, Japan) durchgeführt. Wir beobachteten die Mikroorganismen im Oberflächenbereich innerhalb von 1 mm von der Grenze mit gesundem Korallengewebe bis zu den BBD-Matten und stellten das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Mikroorganismen durch zufälliges Fotografieren fest. Von jeder BBD-Läsion wurden insgesamt 42 Bilder (6 Bilder mit 100-facher Vergrößerung, 18 Bilder mit 1000-facher Vergrößerung und 18 Bilder mit 2000-facher Vergrößerung) aufgenommen.

Den BBD-gestanzten Proben (n = 12) in 300 µl 100 % Ethanol wurden direkt 120 µl nukleotidfreies Wasser und 12 µl 3 M Natriumacetat zugesetzt, durch Vortexen gemischt und 45 Minuten bei –20 °C gelagert Mindest. Nach einer 20-minütigen Zentrifugation bei 18.000 × g wurde das Pellet in 300 µl vorgekühltem 70 %igem Ethanol resuspendiert, erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert, aus der Lösung entfernt und getrocknet. Genomische DNA wurde aus dem Pellet mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) extrahiert, das die Zugabe eines Lysozym-basierten enzymatischen Lyseschritts beinhaltete (Puffer: 20 mg/ml Lysozym, 20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 2 mM). EDTA [pH 8,0] und 1,2 % Triton X-100) gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Die genomische DNA wurde als Matrize für die Amplifikation der V4-Region des bakteriellen 16 S-rRNA-Gens unter Verwendung des universellen Primersatzes (515 F und 806 R, Ergänzungstabelle 4) und des folgenden PCR-Verfahrens verwendet: 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 95 ° C (Denaturierung), 30 Sek. bei 51 °C (Annealing), 30 Sek. bei 72 °C (Verlängerung), gefolgt von einer weiteren Verlängerung für 5 Min. bei 72 °C. Anschließend wurden Indexsequenzen durch PCR unter Verwendung des Nextera XT-Indexkits (Illumina, USA) hinzugefügt. Die Amplikons wurden zur Sequenzierung mit einer Paired-End-Read-Chemie durch einen MiSeq-Sequenzer (Illumina, USA) geschickt. Die Sequenzierungsablesungen sind in der Ergänzungstabelle 5 zusammengefasst.

Die Paired-End-Lesevorgänge von jeder Probe wurden in der Software QiimeI unter Verwendung von MacQIIME v.1.9162 zusammengeführt. Die erhaltenen zusammengeführten Sequenzen wurden in der Software MOTHUR v.1.39.563 nach folgenden Kriterien gefiltert: (1) Leselängen zwischen 249 und 256 bp; (2) Lesequalitäts-Score durchschnittlich 27; und (3) Homopolymer-Leselänge < 8 bp. Darüber hinaus haben wir chimäre Sequenzen mithilfe des USEARCH-Algorithmus v.11.0.66764 erkannt und anschließend chimäre Sequenzen ausgeschlossen. Wir haben USEARCH mit einem Ähnlichkeitsgrenzwert von 97 % für Cluster-OTUs implementiert. Die OTUs wurden bekannten taxonomischen Gruppen zugeordnet, indem sie mithilfe des MOTHUR mit einem Cut-off-Wert von 80 auf die Silva SSU r138.1-Datenbank65 abgebildet wurden. Nach dem Entfernen von Sequenzen aus Eukaryota, Archaea, Unbekannt und Chloroplasten wurden insgesamt 1.593 bakterielle OTUs zugeordnet auf 255 Familien (1401 OTUs), nicht klassifizierte Bakterien (151 OTUs), unkultivierte Bakterien (31 OTUs in 10 Ordnungen), unkultivierte Familien (vier OTUs in drei Klassen) und unbekannte Familien (sechs OTUs in zwei Ordnungen).

Statistische Analysen für den Datensatz der Bakteriengemeinschaft wurden mit der Statistiksoftware R v4.0.261 durchgeführt, die das R-Paket phyloseq v.1.34.066 und vegan v. 2.5–767 enthielt. Alpha-Diversitätsindizes (OTU-Reichhaltigkeit und Chao1) wurden mithilfe der Funktion „estimate_richness“ innerhalb des Phyloseq berechnet, und die Korrelation entlang der Migrationsraten erfolgte mithilfe der Spearman-Rangkorrelation in der Statistiksoftware R v4.0.261. Für die Beta-Diversitätsanalyse wurden die Phyloseq-Daten auf Familienebene mithilfe der Transformationsfunktion Centered Log Ratio (clr) in ein R-Paket-Mikrobiom v. 1.12.068 transformiert und eine Distanzmatrix mithilfe der euklidischen Distanz mit der Funktion „Distanz“ von berechnet das R-Paket phyloseq. Die transformationsbasierte Hauptkomponentenanalyse (tb-PCA) wurde mit der Funktion „ordinate“ aus dem R-Paket phyloseq visualisiert. Um den Einfluss von Unterschieden im Ort und in der Probentiefe auf Zusammensetzungsdaten zu bewerten, wurde ein Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA)-Test mit der Funktion „adonis2“ aus dem R-Paket vegan durchgeführt. Um die Korrelation zwischen dem Unterschied in den Migrationsraten und dem Unterschied in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft zu beurteilen, wurde die Migrationsrate mithilfe der Funktion „dist“ in der Statistiksoftware R in eine Distanzmatrix mit euklidischem Abstand umgewandelt und ein Mantel-Test angewendet zur clr-transformierten Distanzmatrix der Bakterienstruktur und den Migrationsdistanzmatrizen im R-Paket vegan (Spearman-Rangkorrelation und 999 Permutationen). Anschließend wurde eine partielle Korrelationsanalyse unter Verwendung der clr-Transformationsmatrix jeder repräsentativen Bakterienfamilie und der linearen BBD-Migrationsrate ermittelt, die mithilfe des Rangkorrelationstests nach Spearman in der Statistiksoftware R berechnet wurde.

Darüber hinaus wurden die repräsentativen OTUs (mit > 1 % bei der Gesamtsummenskalierung) einer Nukleotid-Nukleotid-BLAST-Suche unterzogen, um ihre nächsten Verwandten in der GenBank-Datenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) zu identifizieren. cgi). Die nächstliegenden Sequenzen wurden aufgrund hoher Ähnlichkeit und Abstammungsposition in Blastn (Nukleotidsammlung Nr./Nt) und der Funktion „Blast Tree View (Baummethode: Fast Minimum Evolution und Max Seq Differences: 0,75)“ ausgewählt. Wenn die Ergebnisse mehrere Sequenzen trafen, wählten wir diejenigen aus Quellen aus, die sich auf MHD, Korallenkrankheiten und gesunde Korallen beziehen.

Laut der partiellen Korrelationsanalyse umfasste die Familie Arcobacteraceae 14 OTUs, die positiv mit der BBD-Migration korrelierten. Daher führten wir FISH an 12 Proben unter Verwendung der spezifischen Sonden EUB338mix31,69 für die meisten Bakterien und Arc9430 für Arcobacteraceae (Ergänzungstabelle 4) mit einer nicht entkalkten Dünnschnittmethode durch, nachdem wir die Sondenspezifität für die 14 OTUs geschätzt hatten.

Um die Sondenspezifität für die 14 OTUs von Arcobacteraceae abzuschätzen, wurden 653 Referenzsequenzen, die der Familie Arcobacteraceae zugeordnet sind, bestehend aus den Gattungen Arcobacter, Malaciobacter, Halarcobacter, Pseudarcobacter, Poseidonibacter und unkultivierten Arcobacteraceae, aus der Silva SSU r138-Datenbank abgerufen65. Die Referenzsequenzen wurden auch mit TestProbe 3.0 (https://www.arb-silva.de/search/testprobe/) auf Übereinstimmung mit der Arc94-Sonde30 für Arcobacter getestet, und die Sonde schätzte eine Abdeckung von Arcobacteraceae auf 78,0 % (509). von 653 Referenzsequenzen). Für die Konstruktion des Referenzbaums wurden die Referenzsequenzen mit der Software Infernal v.1.1.370 abgeglichen und ein Maximum-Likelihood-Baum in RAxML-NG v.1.0.271 mit Modell GTR + G und 200 Bootstrap-Replikaten erstellt. Anschließend wurden 14 OTU-Sequenzen mit dem Programm PaPaRa core v.2.572 an der Referenz-Mehrfachsequenzausrichtung ausgerichtet, anschließend von der Software EPA-ng v.0.3.673 mit dem höchsten Schätzwert (like_weight_ratio) im Referenzbaum platziert und dann Der Baum wurde mithilfe des interaktiven Tree of Life (iTOL) v.474 zur Bewertung der Sondenspezifität visualisiert. Die phylogenetischen Platzierungen der OTU-Sequenz wurden von EPA-ng im Referenzbaum geschätzt und mit einem hohen Score von „like_weight_ratio“ definiert, wenn der Algorithmus mehrere Plätze im Referenzbaum berechnet (der definierte Score liegt im Bereich von 0,15 bis 0,99). .

Die PFA-fixierten Proben in 70 % Ethanol wurden 1 Stunde lang bei 4 °C in PBS mit 10 % Saccharose gegeben und über Nacht bei 4 °C in 20 % Saccharose überführt. Die PFA-fixierten Proben wurden dann in die Einbettmasse (SCEM, SECTION LAB Co. Ltd, Japan) eingebettet und in eine Mischung aus Trockeneis und Hexan getaucht, bis sie vollständig gefroren war. Die nicht entkalkten Schnitte, die an der Klebefolie33 befestigt waren, wurden durchgeführt, um drei Serienschnitte aus den PFA-fixierten Proben für Korallenproben mit einer Dicke von 5 µm mit einer Wolframkarbidklinge (SL-T30, SECTION LAB Co. Ltd., Japan) unter Verwendung eines Kryostats zu erhalten System (Leica CM1850, Deutschland). Die an der Klebefolie befestigten, nicht entkalkten Abschnitte wurden 30 Sekunden lang in 100 %iges Ethanol getaucht, um die Verbindung zu entfernen, und an der Luft getrocknet. FISH wurde wie in Wada et al.32 beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt, einschließlich eines Schritts ohne Entparaffinierung und eines Schritts ohne Eintauchen mit HCl-Lösung. Mit anderen Worten, die luftgetrockneten Schnitte wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer 20 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8,0) gewaschen und in einer Proteinase K (50 µg/ml) mit der 20 mM Tris-HCl-Lösung montiert 5 Minuten bei 37 °C inkubiert und vor der Hybridisierung in der 20 mM Tris-HCl-Lösung gespült. Jeder Serienabschnitt führte eine Sondenhybridisierung unter Verwendung von drei Sonden durch, die mit dem Cy3-Fluorochrom markiert waren: (1) EUB338mix31,69, (2) Non33875 in einem Hybridisierungspuffer (0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl und 0,01 % SDS). 30 % Formamid und (3) Arc9430 mit 20 % Formamid (Ergänzungstabelle 4) bei 46 °C für 1,5 Stunden. Jeder hybridisierte Abschnitt wurde in Waschpuffern (20 mM Tris-HCl, 0,01 % SDS, 5 mM EDTA (pH 8,0) und NaCl (0,112 M für EUB338mix- und Non338-Sondenbehandlungen und 0,225 M für Arc94-Sondenbehandlung)) bei 48 °C gewaschen C für 10 Min. Die am Klebefilm befestigten gewaschenen Schnitte wurden mit kaltem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, auf einem Glasobjektträger (S2441, MATSUNAMI) gesammelt und dann wurde ein Deckglas in einer Antifading-Lösung (Fluoromount/Plus, Diagnostic BioSystems) auf dem Objektträger angebracht. .

Die Bildaufnahme wurde mit einem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung (HC PL APO 40x/1,30 OIL CS2) in einem konfokalen Mikroskop (TCS SP8, Leica) durchgeführt. Cy3-Fluorochrom und Chlorophyll (für Symbiodiniaceae und Cyanobakterien) wurden bei 552 nm (2,0 %) angeregt und in einem Emissionsbereich von 571–582 nm mit HyD (Standardmodus und Verstärkung 100) und von 650–696 nm mit PMT (Verstärkung 700) nachgewiesen ). Korallen-Autofluoreszenz wurde ebenfalls bei 405 nm (1,5 %) angeregt und in einem Emissionsbereich von 460–510 nm mit HyD (Standardmodus und Verstärkung 161) nachgewiesen. Um den Bereich quantitativ auf das Vorhandensein von Bakterien zu analysieren, wurden sechs Bilder (jede Größe 1024 × 1024 Pixel) von jedem der drei Bereiche des BBD-Querschnitts aufgenommen: obere, mittlere und untere Schicht (jedes vertikale Intervall 1 mm). , Abb. 6a). Von jeder Sonde begrenzte Fluoreszenzsignale (EUB338mix und Arc94) wurden mit spezifischen Signalen oder unspezifischen Sondenbindungen (unter Verwendung der Non338-Sonde) gemäß den von Wada et al.32 beschriebenen Kriterien identifiziert.

Die Bildverarbeitung wurde mit der Software Fiji60 durchgeführt, nachdem die Bilder von Cy3-Fluorochrom und Chlorophyll mit der Software LAS X (Leica) in 8-Bit-Graustufen-TIFF-Bilder exportiert wurden. Jedes Graustufenbild wurde durch eine Schwellenwertfunktion unter Verwendung des Algorithmus „Max Entropy“76 in ein Binärbild umgewandelt. Um das Vorhandensein anderer Bakterien als Cyanobakterien im Cy3-Signal der EUB338mix-Sonde zu analysieren, wurde der Bereich der Cyanobakterien im Chlorophyllsignal mit der Funktion „Subtrahieren“ und manueller Kuration vom Binärbild des EUB338mix-Signals subtrahiert. Das Binärbild wurde zur Reduzierung des Rauschens mit der Funktion „Ausreißer entfernen“ gefiltert (Radius 1,5 und Schwelle 50). Da die Signale des Cy3-Fluorochromkanals außerdem unspezifische Fluoreszenz aus den Skelettregionen enthielten (ergänzende Abbildung 5), wurde die Fluoreszenz aus den Skelettregionen manuell aus dem Binärbild entfernt. Basierend auf den Binärbildern wurden die Flächen der gesamten Bakterien, mit Ausnahme von Cyanobakterien und Arcobacteraceae, in Pixeln berechnet (was ihre Populationsgröße in Bezug auf Biomasse widerspiegelt). Die Beziehung zwischen jeder Fläche aus den drei Schichten und der linearen BBD-Migrationsrate wurde mithilfe eines linearen Regressionsmodells (einer Funktion „lm“) in der Statistiksoftware R v4.0.261 gemessen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie erstellten Sequenzierungsdaten wurden unter der Zugangsnummer DRA010783 an das DDBJ Read Archive übermittelt.

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Diese Forschung wurde durch Grant-in-Aid for JSPS Fellows DC1 26·6085 und Mittel der Academia Sinica unterstützt. NW bedankt sich herzlich bei Dr. Kataaki Okubo, Dr. Yukika Kawabata-Sakata und dem verstorbenen Herrn Kiyoshi Nakasone für die technische Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopbildgebung und die Förderung der Motivation von NW für seine Doktorarbeit. NW dankt auch seinem verstorbenen Vater und seiner verstorbenen Mutter dafür, dass sie ihm neue Möglichkeiten für die Forschung eröffnet haben. NW hofft aufrichtig, dass ihre Reise im Himmel gut verläuft.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Sen-Lin Tang, Nobuhiro Mano.

Biodiversity Research Center, Academia Sinica, No.128, Sec 2, Academia Rd, Nangang, Taipei, 11529, Taiwan

Naohisa Wada & Sen-Lin Tang

Abteilung für Meereswissenschaften und Ressourcen, College of Bioresource Science, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa, 252-0813, Japan

Naohisa Wada, Yuta Urabe, Natsumi Abe, Kazuki Takase, Shuji Hayashi, Saeko Kawanabe und Nobuhiro Mano

Geological Survey of Japan, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8567, Japan

Akira Iguchi

Forschungslabor für umweltbewusste Entwicklungen und Technologien [E-Code], National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, 305-8567, Japan

Akira Iguchi

Abteilung für Bioressourcentechnik, National Institute of Technology, Okinawa College, 905 Henoko, Nago-City, Okinawa, 905-2192, Japan

Yuki Yoshioka

College of Science and Engineering, James Cook University, Townsville, Queensland, 4811, Australien

Yui Sato

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NW und NM haben die Studie konzipiert. NW, YU, NA, KT, SH und SK führten die eingereichten Probenahmen einschließlich der Messung der BBD-Migrationsrate durch. NW und YU führten die SEM-Beobachtung durch. NW, AI und YY führten molekulare Verarbeitung sowie bioinformatische und statistische Analysen der Sequenzdaten durch. NW führte die histologischen Arbeiten, die FISH-Beobachtung und die statistische Analyse durch. NW und S.-LT leisteten einen wichtigen Beitrag zum Schreiben von Manuskripten und zur Herstellung von Figuren. AI, YS und NM trugen zum Verfassen und Bearbeiten des Manuskripts bei. S.-LT und NM sind korrespondierende Autoren des Manuskripts. Alle Autoren kritisch begutachtet.

Korrespondenz mit Sen-Lin Tang oder Nobuhiro Mano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wada, N., Iguchi, A., Urabe, Y. et al. Mikrobielle Mattenzusammensetzungen und Lokalisierungsmuster erklären die Virulenz der Schwarzbandkrankheit bei Korallen. npj Biofilms Microbiomes 9, 15 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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Eingegangen: 06. Oktober 2022

Angenommen: 13. März 2023

Veröffentlicht: 04. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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