Direkte Einkapselung von Biomolekülen in Semi

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21391 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Kompartimentierung kann unterschiedlichen Zwecken dienen, beispielsweise dem Schutz biologisch aktiver Substanzen vor der Umwelt oder der Schaffung einer einzigartigen Kombination von Biomolekülen für diagnostische, therapeutische oder andere biotechnologische Anwendungen. Wir stellen eine Methode zur direkten Einkapselung von Molekülen in biokompatiblen und semipermeablen Mikrokapseln aus niedermolekularem Polyethylenglykoldiacrylat (PEG-DA 258) vor. Mikrokapseln werden unter Verwendung eines nichtplanaren PDMS-Mikrofluidchips hergestellt, der die einstufige Herstellung von Wasser-in-PEG-DA 258-in-Wasser-Doppelemulsionen ermöglicht, die mit UV-Licht zu einer Poly-PEG-DA 258-Hülle polymerisiert werden. Semipermeable Mikrokapseln werden durch Zugabe eines inerten Lösungsmittels zum PEG-DA 258 erhalten. Aufgrund der günstigen Hydrophilie von Poly-PEG-DA 258 adsorbieren Proteine ​​nicht an der Kapselhülle und wir demonstrieren die direkte Einkapselung von Enzymen, die kann in den Kapseln auch getrocknet werden, um die Aktivität zu erhalten. Schließlich nutzen wir die Kapselpermeabilität für die Implementierung einer zweischichtigen Kommunikationskaskade mithilfe kompartimentierter DNA-Strang-Verdrängungsreaktionen. In dieser Arbeit wird die direkte Einkapselung aktiver Biomoleküle in semipermeablen Mikrokapseln vorgestellt. Wir gehen davon aus, dass unsere Plattform die Entwicklung künstlicher Zellen und die Erzeugung eingekapselter Diagnostika oder Therapeutika erleichtern wird.

Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik, der Materialwissenschaft, der synthetischen Biologie und der Biotechnik ermöglichen die Präzisionstechnik mikrometergroßer Kompartimente und ermöglichen so die Manipulation immer komplexerer biomolekularer Systeme1,2. Die Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologie ermöglicht die Herstellung von Polymerkompartimenten mit genau definierter Größe und Struktur, basierend auf Doppelemulsionen oder Emulsionen höherer Ordnung mit einer polymerisierbaren Phase, wie von Datta et al.3 beschrieben. Ein Nachteil bei Polymervorläufern, die als Mittelphase verwendet werden, besteht darin, dass die erhaltenen polymerisierten Kompartimente im Allgemeinen hermetisch gegenüber der Permeation gelöster Stoffe sind. Kim et al.4 zeigten jedoch, dass semipermeable Polymerhüllen durch Einbringen eines inerten Verdünnungsmittels hergestellt werden können Porogen, in der Polymervorläuferphase. Bei der UV-Polymerisation wird das nicht reaktive Porogen in einem Prozess, der als polymerisationsinduzierte Phasentrennung (PIPS) bezeichnet wird, aus dem polymerisierenden Polymer ausgeschlossen. Der Nachteil der in dieser Studie verwendeten Polymere und der meisten Polymere, die aus mit Wasser nicht mischbaren Vorläufern gewonnen werden, ist jedoch die Hydrophobie der polymerisierten Kapselhülle, die zur Proteinadsorption führt und daher eine direkte Einkapselung von Proteinen oder Enzymen verhindert.

Kürzlich wurde gezeigt, dass PEG-Diacrylat mit einem Molekulargewicht von 258 g/mol PEG-DA 258 als polymerisierbare Mittelphase für die Herstellung von Doppelemulsionen mit einer mikrofluidischen Kapillarvorrichtung verwendet werden kann5. Die Forscher zeigten außerdem, dass Poly-PEG-DA 258 eine ähnliche Hydrophilie aufweist wie Hydrogele aus wasserlöslichen PEG-DA-Derivaten mit höherem Molekulargewicht. Diese günstigen Eigenschaften ermöglichten es ihnen, Fibrinogen direkt einzukapseln, ohne dass es zu einer merklichen Adsorption an der Polymerhülle kam. Allerdings waren die hergestellten Kapseln auch hermetisch und verhinderten, dass selbst niedermolekulare Farbstoffe (Erioglaucin-Dinatriumsalz: 793 g/mol, Ölrot O: 408 g/mol) aus den Kapseln diffundieren konnten, was die Verwendung und den Anwendungsbereich von erheblich einschränken würde solche Kapseln.

Um biologisch aktive Makromoleküle direkt in biokompatiblen semipermeablen Kapseln einzukapseln, haben wir die günstigen Eigenschaften des niedermolekularen PEG-DA 258 mit der Porenbildung durch PIPS kombiniert. In dieser Studie verwendeten wir ein PDMS-Mikrofluidikgerät mit einer strömungsfokussierenden, koaxialen und nichtplanaren Geometrie, das keine Oberflächenbehandlung erfordert, um Doppelemulsionen von Wasser-in-PEG-DA 258-in-Wasser zu erzeugen. Um semipermeable Kapseln zu erhalten, haben wir PIPS verwendet, um kleine Poren in den Kapselhüllen zu bilden. Indem wir fluoreszierende Ladungen unterschiedlicher Größe einkapselten oder leere Kapseln in Fluorophor-haltigen Lösungen platzierten, zeigten wir, dass die Kapseln semipermeabel waren und einen Größengrenzwert hatten, der die direkte Einkapselung von Proteinen und Enzymen von 32,7 kDa und mehr ermöglichte und gleichzeitig den Transport kleinerer Moleküle ermöglichte. Biomoleküle blieben ohne Abbau in den Kapseln zurück und waren innerhalb der Kapseln homogen verteilt. Eingekapselte Enzyme überstehen die Lufttrocknung in Trehalose und weisen nach der Rehydratisierung enzymatische Aktivität auf. Die semipermeablen Kapseln waren in der Lage, mit ihrer Umgebung zu kommunizieren, wodurch wir eine zweischichtige Signalkaskade implementieren konnten, indem wir DNA-Strang-Verdrängungsreaktionen im flüssigen Kern zweier verschiedener Mikrokapselpopulationen immobilisierten6. Insgesamt beschreibt diese Arbeit die Entwicklung und Charakterisierung semipermeabler Mikrokapseln mit einer biokompatiblen Polymerhülle, die zur Einkapselung verschiedener Biomoleküle für den Einsatz in diagnostischen, therapeutischen oder synthetischen Biologieanwendungen verwendet werden können.

Da PEG-Derivate im Allgemeinen als biokompatibel, bioinert und biologisch abbaubar gelten7, haben wir verschiedene PEG-DAs mit niedrigem Molekulargewicht, wie PEG-DA MW 700, PEG-DA MW 575 und PEG-DA MW 258, als Vorläufer für die Herstellung von Mikrokapseln getestet nach Photopolymerisation durch UV-Beleuchtung. Bei PEG-DA mit einem MW von 575 oder höher verhinderte die Wassermischbarkeit, dass wir leicht Doppelemulsionen bilden konnten. Leonavicen et al. haben kürzlich gezeigt, dass es möglich ist, durch die Kombination von PEG-DA MW 575 und PEG-DA MW 8000 mit hohem Molekulargewicht in der inneren Phase ein Zweiphasensystem zu erhalten und unter Verwendung von PEG-DA als Kapselmaterial Kern-Hülle-Kapseln zu bilden8. Wir haben jedoch einen alternativen Ansatz in Betracht gezogen und PEG-DA MW 258 als potenziellen Polymervorläufer verwendet, da es mit Wasser nicht mischbar ist, wie auch von Nam et al.5 berichtet wurde. Diese Eigenschaft von PEG-DA MW 258 ermöglichte uns die Verwendung als mittlere Phase in Doppelemulsionen und war mit der Tröpfchenerzeugung in einem PDMS-Gerät kompatibel (Abb. 1A). Zur Bildung der Doppelemulsionen verwendeten wir eine wässrige kontinuierliche Phase, ergänzt mit 10 % PVA. Die mittlere Phase von PEG-DA 258 wird mit einem Photoinitiator (HMPP) und einem Tensid (Span80) ergänzt, optional mit der Zugabe eines milden organischen Lösungsmittels. Wir produzierten monodisperse Doppelemulsionen in einem Strahlverfahren mit Flussraten von 2500 \(\upmu \)L/h für die wässrige kontinuierliche Phase, 200 \(\upmu \)L/h für die mittlere Phase von PEG-DA MW 258, und 250 \(\upmu \)L/h für die wässrige innere Phase (Abb. 1B). Interessanterweise konnten die Doppelemulsionen erzeugt werden, ohne dass eine Oberflächenbehandlung des Geräts erforderlich war, da die nichtplanare Geometrie des PDMS-Geräts eine Benetzung des Sammelkanals durch die hydrophobe Mittelphase verhindert.

Herstellung semipermeabler Mikrokapseln in einem PDMS-Gerät mit 3D-Geometrie. (A) Schematische Darstellung des PDMS-Geräts mit 3D-Geometrie. W/O/W-Doppelemulsionen werden mit einer PEG-DA 258-Mittelphase erzeugt, die einen inneren wässrigen Kern einkapselt. (B) Mikroaufnahmen des PDMS-Gerätebetriebs. (C) Hellfeldbild von Mikrokapseln, die nach der UV-Polymerisation der gesammelten Doppelemulsion erhalten wurden. (D) Größenverteilung einer repräsentativen Charge polymerisierter Mikrokapseln. (E) Schematische Darstellung von PIPS bei UV-Beleuchtung. 15 % Butylacetat (Porogen) wurde mit PEG-DA 258 gemischt, um semipermeable Mikrokapseln zu bilden. (F) In der gesammelten Doppelemulsion werden sowohl FITC-Dextran mit hohem Molekulargewicht von 500 kDa als auch RITC-Dextran mit niedrigerem Molekulargewicht von 40 kDa in der inneren wässrigen Phase zurückgehalten. (G) Nach der UV-Polymerisation und PIPS bilden sich Poren in der Kapselhülle und die Kapseln werden semipermeabel.

Wir haben Doppelemulsionen 15 Minuten lang in einer UV-transparenten Küvette gesammelt, wonach die Kapseln durch UV-Bestrahlung ansatzweise polymerisiert wurden. Nach der Polymerisation erhielten wir monodisperse Kapseln mit einem mittleren Durchmesser von 62 \(\upmu \)m (Abb. 1C,D). Der Variationskoeffizient lag bei nahezu 5 %, was mit früheren Ergebnissen mit ähnlichen PDMS-Geräten übereinstimmt9. Die Dicke der Kapselhülle wurde anhand von Mikroskopbildern auf 5 bis 10 µm geschätzt. Unsere Ergebnisse bestätigen nicht nur die Beobachtung von Nam et al.5, dass mit Wasser nicht mischbares PEG-DA MW 258 eine geeignete Mittelphase ist, sondern zeigten auch seine Kompatibilität mit der Doppelemulsionserzeugung in einem PDMS-Gerät, das keine Oberflächenbehandlung erfordert, und führte zur Herstellung monodisperser Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln mit porösen dünnen Schalen (Abb. 1E – G).

PEG-DA 258-Mikrokapseln sind semipermeabel und die Porengröße kann durch Wechsel des Porogens angepasst werden. Schematische Darstellung von PEG-DA 258-Mikrokapseln, hergestellt unter Verwendung von (A) 15 % Butylacetat oder (C) 15 % 1-Decanol als Porogen. 15 % Butylacetat-Mikrokapseln ermöglichten selektiv die Permeation von 10 kDa RITC-Dextran, während 32,7 kDa EGFP ausgeschlossen wurde. Die größere Porengröße von Mikrokapseln, die mit 15 % 1-Decanol als Porogen hergestellt wurden, ermöglichte die Diffusion beider fluoreszierender Moleküle. Mikrokapseln, die unter Verwendung von (B) 15 % Butylacetat oder (D) 15 % 1-Decanol-Porogen hergestellt wurden, wurden in eine Lösung eingetaucht, die 10 kDa RITC-Dextran und 32,7 kDa EGFP enthielt. Die Entwicklung des Fluoreszenzsignals in den Cy3- und FITC-Kanälen wurde nach 5 Minuten, 1 Stunde und 24 Stunden beobachtet. Während Mikrokapseln, die mit 15 % 1-Decanol hergestellt wurden, für beide fluoreszierenden Moleküle durchlässig waren, beobachteten wir deutlich die selektive Permeabilität von Mikrokapseln, die mit 15 % Butylacetat als Porogen hergestellt wurden.

Um semipermeable Kapseln herzustellen, verwendeten wir das milde inerte Lösungsmittel Butylacetat, das der mittleren Phase zugesetzt wurde und als Porogen in PIPS4,10 diente. Butylacetat wurde von Kim et al.4 verwendet, um Nanoporen mit einem Durchmesser unter 30 nm in einer dünnen Hülle zu bilden, die aus einem vernetzten Netzwerk aus ethoxyliertem Trimethylolpropantriacrylat (ETPTA) und Glycidylmethacrylat (GMA) besteht. Um die Permeabilität der semipermeablen Kapseln zu bewerten, fügten wir 500 kDa FITC-Dextran und 40 kDa TMR-Dextran zur inneren wässrigen Phase hinzu und beobachteten, dass fast 90 % der polymerisierten Kapseln das 500 kDa FITC-Dextran nach den Kapseln behielten wurden durch aufeinanderfolgende Zentrifugation in wässrigem Puffer gründlich gewaschen und anschließend 24 Stunden lang in Puffer bei 4 °C inkubiert (Abb. 1G). Andererseits behielten nur etwa 40 % der Kapseln das 40 kDa TMR-Dextran mit niedrigerem Molekulargewicht. Diese Ergebnisse zeigten, dass einige Kapseln semipermeabel sind, was durch Kapseln belegt wird, in denen nur der Fluorophor mit höherem Molekulargewicht zurückgehalten wird. Obwohl der Größengrenzwert aus diesem Experiment nicht genau bestimmt werden konnte, schätzten wir ihn auf deutlich unter 500 kDa und möglicherweise nahe an der Größe des kleineren Fluorophors von 40 kDa.

Um die Semipermeabilität besser zu charakterisieren, haben wir leere Kapseln hergestellt und sie in eine Lösung aus fluoreszierenden Molekülen mit kleinerem Molekulargewicht gegeben (Abb. 2). Wir platzierten leere Kapseln, die mit 15 % Butylacetatporogen hergestellt wurden, in einer Lösung, die sowohl 10 kDa RITC-Dextran als auch 32,7 kDa EGFP enthielt (Abb. 2A, B). Wir beobachteten, dass die meisten Kapseln einen relativ schnellen Signalanstieg im roten Fluoreszenzkanal zeigten, was dem 10 kDa RITC-Dextran mit niedrigerem Molekulargewicht entspricht. Nach 1-stündiger Inkubation zeigten die meisten Kapseln ein rotes Fluoreszenzsignal und alle Kapseln zeigten nach 24-stündiger Inkubation ein rotes Fluoreszenzsignal. Gleichzeitig zeigte die Mehrzahl dieser Kapseln keinen Signalanstieg im grün fluoreszierenden Kanal, der dem 32,7 kDa EGFP entspricht. Durch Überlagerung des Signals der beiden Fluoreszenzkanäle konnten wir deutlich erkennen, dass ein Großteil der Kapseln semipermeabel war und EGFP für mindestens 24 Stunden ausschloss, während die Diffusion des 10 kDa RITC-Dextrans in ihr Inneres ermöglicht wurde. Wir beobachteten jedoch eine gewisse Variabilität in der Permeabilität der Kapseln, wobei einige Kapseln bereits nach einigen Minuten Inkubation für EGFP durchlässig zu sein schienen, während einige Kapseln nach einer Stunde immer noch 10 kDa RITC-Dextran ausschlossen.

Unter Verwendung von 1-Decanol als Porogen erhielten wir semipermeable Kapseln mit einem unterschiedlichen Cutoff-Wert. Die Verwendung von 1-Decanol wurde von Kim et al.4 beschrieben, um aufgrund eines anderen Wechselwirkungsparameters von 1-Decanol mit dem sich bildenden Polymer größere Poren in der ETPTA/GMA-Polymerhülle zu erzeugen. Hier zeigen wir, dass Kapseln, die mit 15 % 1-Decanol-Porogen in PEG-DA 258 hergestellt wurden, auch zu einer höheren Permeabilität führten als Kapseln, die mit Butylacetat-Porogen hergestellt wurden (Abb. 2C, D). Wir beobachteten einen Anstieg des grünen Fluoreszenzsignals entsprechend 32,7 kDa EGFP im Kapselinneren bereits nach wenigen Minuten Inkubation und alle Kapseln waren nach 24 Stunden fluoreszierend. Darüber hinaus waren alle Kapseln für 10 kDa RITC-Dextran vollständig durchlässig. Um die Kapselpermeabilität zu modifizieren, haben wir auch die Verwendung einer kleineren Porogenfraktion mit 10 % Butylacetat untersucht. Wir stellen fest, dass ein erheblicher Teil der Kapseln nach einstündiger Inkubation kein Fluoreszenzsignal aufwies, das 10 kDa RITC-Dextran entsprach, was auf einen niedrigeren Permeabilitätsgrenzwert hindeutet (ergänzende Abbildung S1). Wir verwendeten auch verschiedene Lösungsmittel als Porogen, wie z. B. 15 % Octanol (ergänzende Abbildung S2), was Kapseln mit einer mittleren Permeabilität zwischen dem ergab, was bei Verwendung von 15 % Butylacetat oder 15 % Decanolporogen beobachtet wurde. Unter Verwendung von 15 % 2-Ethyl-1-hexanol (ergänzende Abbildung S3) stellten wir Kapseln mit einer Permeabilität her, die mit 15 % Butylacetat vergleichbar ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Kapselpermeabilität durch Variation des Porogengehalts und der Porogenzusammensetzung zu modifizieren, und dass verschiedene Lösungsmittel mit unserer mikrofluidischen Produktion semipermeabler Kapseln kompatibel sind.

Direkte Einkapselung von Proteinen in semipermeablen PEG-DA 258-Kapseln. Zur direkten Einkapselung wurde der wässrigen inneren Phase EGFP zugesetzt. (A–C) Mikroskopbilder von Doppelemulsionen, die ein Fluoreszenzsignal im FITC-Kanal zeigen. (D–F) Nach der Polymerisation war das Fluoreszenzsignal im Inneren der meisten Kapseln noch vorhanden. Schwankungen in der Porengröße oder ein Größengrenzwert nahe dem 32,7-kDa-EGFP führten zu einem gewissen Proteinverlust. (G) Fluoreszenzintensitätsprofil der Kapsel, angegeben in Panel E. Das Fluoreszenzprofil deutet auf eine homogene Verteilung von EGFP im Inneren der Kapsel ohne Proteinadsorption an das Schalenmaterial hin. (H–J) Mikroskopbilder von polymerisierten Kapseln mit FITC-Streptavidin nach direkter Einkapselung. In allen Kapseln ist ein Fluoreszenzsignal vorhanden, was darauf hindeutet, dass die Porengröße für den Austritt von FITC-Streptavidin zu klein ist. (K) Fluoreszenzprofil über zwei Kapseln aus Panel I. Das Profil deutet auf eine homogene Verteilung von FITC-Streptavidin im Inneren der Kapsel ohne Proteinadsorption an das Schalenmaterial hin.

Als nächstes zeigen wir, dass wir Proteine ​​direkt in semipermeable Poly-(PEG-DA 258)-Mikrokapseln einkapseln können, ohne dass sie an der Polymerhülle adsorbieren oder ihre Funktion verlieren. Wir haben 15 % Butylacetat als Porogen ausgewählt, um die Retention von Proteinen und Enzymen im Inneren der Kapseln zu ermöglichen und gleichzeitig den Transport kleinerer Biomoleküle durch die Kapselhülle zu ermöglichen. Wir verkapselten 32,7 kDa EGFP in unseren Mikrokapseln, indem wir es in einer Endkonzentration von 2 μg/ml zur inneren wässrigen Phase hinzufügten. In der Doppelemulsion wurde ein EGFP-Fluoreszenzsignal ohne Anzeichen einer Ausfällung beobachtet (Abb. 3A–C), und nach der Polymerisation zeigten die Kapseln ein homogenes Fluoreszenzprofil ohne Anzeichen einer Proteinadsorption an das Kapselmaterial (Abb. 3D– G). Wir verkapselten außerdem 60 kDa FITC-markiertes Streptavidin in der wässrigen Innenphase bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml, und das Fluoreszenzsignalprofil in den polymerisierten Kapseln zeigte keine Anzeichen einer Proteinadsorption an der Kapselhülle ( Abb. 3H–K). Nach 24-stündiger Inkubation in PBS stellten wir fest, dass ein Teil der EGFP-haltigen Kapseln kein Fluoreszenzsignal enthielt (Abb. 3D – F). Diese Beobachtung legt einen Permeabilitätsgrenzwert nahe der Größe dieser fluoreszierenden Biomoleküle nahe. Wir erwarten auch eine gewisse Variabilität in der Porengröße der Kapseln aufgrund des Batch-UV-Polymerisationsprozesses, bei dem die UV-Intensität je nach Position der Kapsel in der Küvette leicht variieren kann. Außerdem könnten einige Kapseln zerbrochen oder beschädigt sein, was zur Freisetzung ihrer Ladung führen würde. Beim FITC-Streptavidin mit dem größeren Molekulargewicht von 60 kDa konnten wir feststellen, dass die meisten polymerisierten Kapseln nach wässrigen Waschvorgängen ein Fluoreszenzsignal aufwiesen, was auf einen Größengrenzwert unterhalb der Größe von FITC-Streptavidin hinweist.

Wir haben gezeigt, dass die nach der UV-Polymerisation erhaltene Poly-PEG-DA 258-Hülle mit der direkten Proteinverkapselung kompatibel ist. Die verwendeten Materialien führten nicht zu einer Adsorption von Proteinen an der Kapselhülle und der durch die Polymerisation induzierte Phasentrennungsprozess bildete Poren, die ausreichend klein waren, um Proteine ​​mit Molekulargewichten von 32,7 kDa und mehr zurückzuhalten.

Direkte Einkapselung funktioneller Enzyme in semipermeablen PEG-DA 258-Mikrokapseln. Ein Luciferase-GFP-Fusionsprotein wurde direkt in semipermeablen Kapseln eingekapselt. Das fluoreszierende Fusionsprotein ermöglicht die Visualisierung des Enzyms (A) in der Doppelemulsion und (B) in den polymerisierten Kapseln. (C) Die eingekapselte EconoLuciferase zeigt ein starkes Signal in einem Biolumineszenztest. Direkte Einkapselung von \(\beta \)-Galactosidase. (D,E) Enzymhaltige Kapseln wurden in Trehalose dispergiert und bei 37 \(^{\circ }\)C luftgetrocknet. (F) Nach der Rehydratisierung mit einer CPRG-haltigen Lösung wurde das Substrat zu Chlorphenolrot hydrolysiert. (G) Die Lösung wurde mit einer auf einem Umkehrmikroskop montierten Farbkamera mit \(\times \) 4-facher Vergrößerung abgebildet. Die Kapseln zeigten im Inneren eine violette Farbe, was auf die enzymatische Aktivität von \(\beta \)-Galactosidase hinweist.

Nach der erfolgreichen Einkapselung fluoreszierender Proteine ​​haben wir Enzyme eingekapselt und mit den hergestellten Kapseln enzymatische Tests durchgeführt. Wir verwendeten ein rekombinantes GFP-Luciferase-Fusionsprotein (econoLuciferase, Biosynth), das die Bestätigung der Einkapselung durch Messung seines Fluoreszenzsignals ermöglichte. Das Molekulargewicht des Fusionsproteins von über 90 kDa führte dazu, dass das Enzym im Inneren der Mikrokapseln zurückblieb. Tatsächlich sahen wir, dass sowohl die Doppelemulsion als auch die polymerisierten Kapseln ein Fluoreszenzsignal des fluoreszierenden Fusionsproteins econoLuciferase enthielten. In beiden Fällen beobachteten wir eine gesprenkelte Verteilung des Fluoreszenzsignals, die möglicherweise auf einen gewissen Niederschlag in der 10 %igen PVA-Innenlösung zurückzuführen ist (Abb. 4A, B). Die econoLuciferase-haltigen Kapseln wurden in eine Lösung mit D-Luciferin gegeben und wir haben ein Biolumineszenzsignal gemessen, das zwei Größenordnungen höher war als das bei leeren Kapseln beobachtete Signal (Abb. 4C). Diese Ergebnisse zeigten, dass ein aktives Enzym in Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln eingekapselt werden kann, wobei die semipermeable Hülle die Diffusion des Substrats D-Luciferin in den Kern der Mikrokapseln ermöglicht, um ein Biolumineszenzsignal zu erzeugen.

In einem zweiten Beispiel haben wir gezeigt, dass Kapseln unter Beibehaltung der Enzymfunktion getrocknet und rehydriert werden können. Wir verkapselten \(\beta \)-Galactosidase, ein tetrameres Enzym mit einem Molekulargewicht von 465 kDa. Um zu zeigen, dass enzymhaltige Kapseln getrocknet werden können und bei Rehydrierung ihre Aktivität behalten, dispergierten wir \(\beta \)-Galactosidase-haltige Kapseln in einer 0,5 M Trehaloselösung und trockneten kleine Tropfen über Nacht in einem Inkubator bei 37 \(^{\ circ }\)C, was zu Trehalose-Pellets führt (Abb. 4D,E). Nach der Rehydratisierung der getrockneten Pellets mit einer Chlorphenolrot-\(\beta \)-d-galactopyranosid (CPRG)-Lösung beobachteten wir eine Farbänderung bei der enzymatischen Umwandlung des gelben CPRG in Chlorphenolrot. Wir beobachteten, dass die Farbänderung an der Stelle der Kapseln auftrat, und die Visualisierung mit einem 4-fach-Objektiv zeigte, dass das Innere einiger Kapseln eine intensive purpurrote Farbe annahm (Abb. 4F, G). Obwohl die Bilder nicht zur Quantifizierung der Chlorphenolrot-Konzentration verwendet wurden, zeigten sie deutlich, dass die Umwandlung von CPRG in Chlorphenolrot innerhalb der \(\beta \)-Galactosidase-haltigen Kapseln stattfand. Diese Ergebnisse zeigten die Möglichkeit der direkten Einkapselung aktiver Enzyme in semipermeable Mikrokapseln und wir zeigten außerdem, dass Kapseln in einer lyoprotektiven Lösung von Trehalose luftgetrocknet werden können und nach der Rehydrierung immer noch ihre Aktivität behalten.

Immobilisierung des DNA-Strang-Verdrängungsreaktionsnetzwerks in semipermeablen Mikrokapseln und Implementierung einer zweischichtigen Signalkaskade. (A) Schematische Darstellung der zweischichtigen Signalkaskade, wie sie von Joesaar et al.6 entwickelt wurde. (B) Implementierung der zweischichtigen Signalkaskade in Poly-PEG-DA 258-Kapseln. Die beiden Kapselpopulationen wurden zusammengemischt und unmittelbar nach Zugabe von 50 nM Eingangsstrang (A) auf einem Objektträger zur Zellzählung abgebildet. Es wurde ein Anstieg der Cy5- und Cy3-Fluoreszenzsignale beobachtet, der der Aktivierung der ersten bzw. zweiten Population entsprach. (C) Mittlere Intensität der erkannten Partikel. Es wurde ein Anstieg des Cy5-Signals entsprechend der aktivierten ersten Kapselpopulation beobachtet. Nach der Freisetzung und Diffusion des Signalstrangs (\(Q_1\)) zur zweiten Kapselpopulation wurde ein Anstieg des Cy3-Signals entsprechend ihrer anschließenden Aktivierung beobachtet. Die größeren Symbole entsprechen dem Median aller erkannten Partikel in einem bestimmten Fluoreszenzkanal.

Wir untersuchten die Möglichkeit, komplexere biomolekulare Systeme einzukapseln, da dies zur Erkennung und Reaktion auf einen Reiz in diagnostischen, therapeutischen oder theranostischen Anwendungen genutzt werden könnte. Kürzlich wurde gezeigt, dass DNA-Strangverdrängungsreaktionen (DSD) in Mikrokompartimenten von Proteinosomen11 als Modell für protozelluläre Kommunikation und verteilte biomolekulare Berechnungen durchgeführt werden können6. Hier immobilisierten wir biotinylierte DNA-Stränge in unseren Poly-(PEG-DA 258)-Kapseln, die Streptavidin enthielten, und folgten dabei dem Design von Joesaar et al.6.

Wir haben eine zweischichtige Signalkaskade implementiert, indem wir eine erste Population von Kapseln mit einem Transducer-DSD-Gate funktionalisiert haben, das nach der Verdrängung des Toeholds durch einen ssDNA-Eingangsstrang (A) aktiviert wird, was zur Freisetzung eines Signalstrangs (Q1) und zur Löschung von a führt Cy5-Fluorophor. Der Signalstrang (Q1) kann wiederum eine zweite Population von Kapseln aktivieren, die mit einem Transducer-Verstärker-DSD-Gate funktionalisiert sind, wodurch ein zweiter Signalstrang (Q2) freigesetzt wird, der dieses Mal ein Cy3-Fluorophor unlöscht. Wir haben auch einen Brennstoffstrang hinzugefügt, der als Verstärker fungiert (Abb. 5A). Die beiden Kapselpopulationen wurden zusammengemischt und die zweischichtige Signalkaskade wurde durch Zugabe des Eingangsstrangs (A) aktiviert. In diesem Experiment haben wir die beiden Kapselpopulationen gemischt, 50 nM Eingangsstrang (A) hinzugefügt und die frei beweglichen Kapseln in eine Zellzählkammer geladen. Wir haben zunächst einen Anstieg des Cy5-Signals gemessen, der der ersten Population von Kapseln entspricht, die das erste DSD-Transducer-Gate enthalten, das aktiviert wird. Nach einer Zeitverzögerung von einigen Minuten sahen wir einen anschließenden Anstieg des Cy3-Signals, der der zweiten Population von Kapseln entsprach, die das DSD-Gate des Wandlers und Verstärkers enthielten (Abb. 5B, C). Wir beobachteten einen Cy5-Anstieg bei etwa 10 Kapseln der ersten Population und einen Cy3-Anstieg bei etwa 15 Kapseln der zweiten Population. Die Aktivierung der Zweischichtkaskade konnte durch Änderung der Konzentration des Eingangsstrangs (A) modifiziert werden. Durch die Erhöhung der Konzentration auf 100 nM wurde die Aktivierung der ersten Population stark beschleunigt und es war schwierig, den anfänglichen Signalanstieg zu erfassen (ergänzende Abbildung S4). Andererseits führte die Reduzierung der Konzentration von (A) auf 10 nM zu einem viel geringeren Aktivierungsgrad (ergänzende Abbildung S4). In allen Fällen beobachteten wir eine Verzögerung von 5 bis 10 Minuten zwischen der Aktivierung der ersten Population und der Aktivierung der zweiten Population. Während dies eine prägnante Umsetzung der kürzlich entwickelten kompartimentierten DSD-Reaktionen ist, zeigten diese Ergebnisse, dass DSD-Reaktionen effizient in unseren semipermeablen Mikrokapseln eingekapselt und zum Aufbau kommunizierender biomolekularer Systeme eingesetzt werden können.

In dieser Arbeit stellen wir die Herstellung biokompatibler und semipermeabler Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln und deren Verwendung zur Verkapselung von Proteinen oder DNA-Netzwerken unter Beibehaltung der Funktionalität vor. Zunächst zeigen wir, dass PEG-DA 258 als polymerisierbare Mittelphase für die Herstellung von Mikrokapseln auf Basis einer Wasser-in-PEG-DA 258-in-Wasser-Doppelemulsion verwendet werden kann. Die Erzeugung einer solchen Doppelemulsion erfordert nicht die Verwendung eines Glaskapillargeräts5, sondern kann in einem PDMS-Gerät mit 3D-Geometrie hergestellt werden, das keine Oberflächenbehandlung erfordert12. Die relativ einfache Methode und Reproduzierbarkeit bei der Herstellung und Verwendung unbehandelter PDMS-Geräte zur Herstellung von Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln sollte diese Methode vielen Laboren mit Zugang zu grundlegender Soft-Lithographie-Herstellung zugänglich machen.

Durch Zugabe eines inerten Verdünnungsmittels zur mittleren Phase von PEG-DA 258 zeigen wir, dass durch PIPS semipermeable Mikrokapseln gebildet werden können. Diese Technik wurde zuvor bei der Bildung sermipermeabler Mikrokapseln aus anderen Polymeren auf Acrylatbasis wie Mischungen aus ETPTA/GMA4 oder EDGMA/GMA10 verwendet. Während die Semipermeabilität von Kapseln aus solchen Polymeren nachgewiesen wurde, wurde keine direkte Einkapselung biologischer Komponenten erreicht, abgesehen von der Einkapselung von Plasmid-DNA in den ETPTA/GMA-Mikrokapseln bei Niederholtmeyer et al.13. Es ist interessant festzustellen, dass die in diesen Kapseln enthaltene Plasmid-DNA nach dem Eintauchen in ein zellfreies Transkriptions-Translationssystem immer noch als Proteinexpressionsvorlage dienen könnte. Allerdings musste die ETPTA/GMA-Kapsel zunächst mit Amino-PEG12-Alkohol umgesetzt werden, um die Adsorption von Proteinen an der Kapselhülle zu verhindern, was auch darauf hindeutet, dass eine direkte Einkapselung von Proteinen oder Enzymen durch die Verwendung solcher Polymere ausgeschlossen gewesen wäre.

Hier bestätigen wir die frühere Beobachtung von Nam et al.5, dass Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln nicht zur Adsorption von Biomolekülen, einschließlich fluoreszierender Proteine ​​oder Enzyme, führen, was deren direkte Einkapselung im Inneren der semipermeablen Mikrokapseln ermöglicht. Darüber hinaus wurde geschätzt, dass die durch PIPS bei Verwendung von Butylacetat als Porogen erhaltenen kleinen Poren nahe am hydrodynamischen Radius des 32,7 kDa kleinen EGFP liegen oder sogar kleiner als dieser sind. Dies ermöglicht die Einkapselung einer Vielzahl von Proteinen, RNA, DNA oder anderen (Bio-)Molekülen von Interesse, solange ihre Größe diesen Grenzwert nicht unterschreitet. Wir zeigen, dass die Einkapselung aktiver Enzyme möglich ist und dass die Semipermeabilität der Kapseln die Herausforderungen einer stabilen Einkapselung ohne Freisetzung des Enzyms überwindet und gleichzeitig die Diffusion von Reaktanten und Produkten in und aus den Kapseln ermöglicht. Alternativ schlagen wir vor, dass die Einkapselung von Streptavidin als Immobilisierungspartner für kleinere Moleküle dienen kann. Für den gleichen Zweck könnte auch die Einkapselung funktionalisierter magnetischer Perlen oder Partikel geeigneter Größe verwendet werden. In zukünftigen Entwicklungen könnte dies dazu dienen, Peptide und kleine Proteine ​​mit Affinitätsmarkierungen oder sogar kleinen Molekülen zu immobilisieren, die bei Wahrnehmung eines externen Reizes aktiviert oder freigesetzt werden könnten14. Hier haben wir dieses Konzept angewendet, indem wir kurze DNA-Stränge, die mit einem Biotin-Griff modifiziert waren, auf eingekapseltem Streptavidin immobilisierten, was zur Implementierung einer zweischichtigen Signalkaskade aus DNA-Strangverdrängungsreaktionen (DSD) diente. Während die von Joesaar et al.6 vorgeschlagene Implementierung von DSD-Reaktionen in Mikrokompartimenten ursprünglich in Proteinosomen durchgeführt wurde, zeigen wir, dass unsere semipermeablen Mikrokapseln auch in der Lage sind, solch komplexe Anwendungen der synthetischen Biologie umzusetzen.

Diese Arbeit ist die erste Demonstration der direkten Einkapselung aktiver Biomoleküle in semipermeablen biokompatiblen Poly-PEG-DA 258-Kapseln, jedoch mit einigen Einschränkungen. Obwohl die ausgewählte Verkapselungsmethode und die ausgewählten Parameter für die gewählten Anwendungen geeignet waren, sind wir uns darüber im Klaren, dass Verbesserungen vorgenommen werden könnten, um die Ausbeute intakter Mikrokapseln zu erhöhen und einen spezifischen Semipermeabilitätsgrenzwert zu erreichen. Die wirksame Entfernung von Porogen in wässrigen Wäschen und anderen nachgeschalteten Prozessen, die sich auf die Kapselpermeabilität auswirken, kann weiter verbessert werden, um homogenere Kapseln herzustellen. Da die Kontrolle der UV-Beleuchtung, die den Polymerisationsprozess initiiert, für PIPS und die Erzeugung der gewünschten Durchlässigkeit von entscheidender Bedeutung ist, könnten zukünftige Entwicklungen die Inline-Polymerisation15 zur Herstellung von Kapseln nutzen, um eine gleichmäßige Beleuchtung jedes Doppelemulsionströpfchens sicherzustellen. Schließlich müssen die Dichte zwischen den verschiedenen Phasen angepasst, die Schalendicke verändert und verschiedene Porogen-, Tensid- und Photoinitiatorzusammensetzungen untersucht werden, um Kapseln mit maßgeschneiderten Eigenschaften für andere spezifische Anwendungen herzustellen.

Zusammenfassend haben wir die einstufige Einkapselung einer Vielzahl von Biomolekülen in Poly-PEG-DA 258-Mikrokapseln auf Basis von Doppelemulsionen demonstriert. In den Kern der biokompatiblen semipermeablen Kapseln können fluoreszierende Moleküle, Proteine, Enzyme und DNA-Stränge mit biologischer Aktivität geladen werden. Dies öffnet Türen für den Bau komplexer und robuster biomolekularer künstlicher Zellen mit mehreren Komponenten für diagnostische, therapeutische und synthetische Biologieanwendungen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Rohan Thakur für seinen Beitrag beim Aufbau der Spritzenpumpen und für seine Beiträge bei der anfänglichen Plattformentwicklung. Sie danken Prof. Esther Amstad, Jui-Chia Chang, Dr. Gianluca Etienne und dem SMaL-Labor der EPFL für die Bereitstellung der Fotomaske für das Mikrofluidikgerät und für ihre Hilfe bei Vorversuchen. GM wurde durch das MD-PhD-Programm des Schweizerischen Nationalfonds (SNF, 323530\(\_\)171144) und durch ein SNF NRP (National Research Program) 78 Covid-19 Grant 198412 (an SJM) unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen der EPFL MD-Doktorarbeit Nr. 838516 veröffentlicht.

School of Engineering, Institut für Bioingenieurwesen, Eidgenössische Polytechnische Schule Lausanne, Lausanne, Schweiz

Gregory Michielin & Sebastian J. Maerkl

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GM und SJM konzipierten Forschung; GM führte Forschungen durch; GM und SJM analysierten Ergebnisse und Daten; GM und SJM haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Sebastian J. Maerkl.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Michielin, G., Maerkl, SJ Direkte Einkapselung von Biomolekülen in semipermeablen Mikrokapseln, hergestellt mit Doppelemulsionen. Sci Rep 12, 21391 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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Eingegangen: 21. September 2022

Angenommen: 06. Dezember 2022

Veröffentlicht: 10. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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