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BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 292 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Obwohl der Cholesterinstoffwechsel ein häufiger Weg für die Entwicklung von Antitumormitteln ist, gibt es keine spezifischen Ziele und Medikamente für den klinischen Einsatz. Basierend auf unserer vorherigen Studie zu Sterol-O-Acyltransferase 1 (SOAT1) bei hepatozellulärem Karzinom wollten wir hier ein wirksames, zielgerichtetes Medikament zur präzisen Behandlung von hepatozellulärem Karzinom finden und aus der Perspektive des Cholesterinstoffwechsels den Zusammenhang zwischen Cholesterinregulation und klären Tumorentstehung und -entwicklung.

In dieser Studie haben wir eine in virtuelles Screening integrierte Affinitätsscreening-Technologie für das Screening von Zielprotein-Arzneimitteln entwickelt. Zur Überprüfung der Arzneimittelaktivität wurde eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Experimenten verwendet. Zur Erforschung der Antitumormechanismen wurden Multi-Omics-Analyse und Durchflusszytometrie-Analyse eingesetzt. Eine vergleichende Analyse von Proteom und Transkriptom in Kombination mit Überlebensdaten der Patienten zeigt das klinisch-therapeutische Potenzial der untersuchten Arzneimittel.

Wir haben drei Verbindungen gescreent, Nilotinib, ABT-737 und Evacetrapib, die eine optimale Bindung mit SOAT1 zeigten. Insbesondere Nilotinib zeigte eine hohe Affinität zum SOAT1-Protein und hemmte die Tumoraktivität sowohl in vitro als auch in vivo deutlich. Multi-Omics-Analyse und Durchflusszytometrie-Analyse zeigten, dass auf SOAT1 abzielende Verbindungen den Cholesterinstoffwechsel in Tumoren umprogrammierten und CD8+-T-Zellen und Neutrophile verstärkten, um das Tumorwachstum zu unterdrücken.

Zusammenfassend haben wir über mehrere hochaffine SOAT1-Liganden berichtet und deren klinisches Potenzial in der Präzisionstherapie von Leberkrebs nachgewiesen. Außerdem haben wir den potenziellen Antitumormechanismus von SOAT1-zielenden Verbindungen aufgezeigt.

Peer-Review-Berichte

Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Neuprogrammierung des Cholesterinstoffwechsels von Tumoren während der Tumorentstehung und -entwicklung erfolgt [1, 2]. Zu den Merkmalen des Cholesterinstoffwechsels von Tumoren gehören sowohl die Hochregulierung der Synthese und Aufnahme von Cholesterin als auch die Akkumulation verschiedener Cholesterinderivate wie Cholesterinester und oxidiertes Cholesterin [3]. Die Neuprogrammierung des Cholesterinstoffwechsels in Tumoren umfasst jedoch viele Prozesse, darunter Synthese, Aufnahme, Veresterung, Ausfluss und Umwandlung. Daher war es eine Herausforderung, die Rolle dieser Prozesse bei der Tumorentstehung und bei der Entwicklung potenzieller therapeutischer Arzneimittel aufzuklären.

Viele neuere klinische und präklinische Studien haben gezeigt, dass die gezielte Steuerung des Cholesterinstoffwechsels in Tumorzellen und Immunzellen eine offensichtliche Möglichkeit zur Behandlung von Tumoren darstellt [4]. Zu den bestehenden Zielen gehören Schlüsselenzyme in den Cholesterinsynthese- und Transportwegen sowie wichtige Transkriptionsfaktoren, die am Cholesterinstoffwechsel beteiligt sind. Beispielsweise üben Statine eine krebshemmende Wirkung aus, indem sie die Aktivität des wichtigen geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR) im Signalweg der Cholesterinsynthese hemmen [5], und Itraconazol bindet direkt an das Sterol- empfindliche Domäne des NPC intrazellulären Cholesterintransporters 1 (NPC1) und reduziert dadurch das Tumorwachstum und die Angiogenese [6]. Darüber hinaus werden derzeit auch LXR-623, GW3965, andere niedermolekulare Inhibitoren gegen den Leber-X-Rezeptor (LXR) und andere niedermolekulare Arzneimittel als Antitumormittel untersucht [7].

Es wird erwartet, dass die Entdeckung neuer cholesterinbezogener Wirkstoffziele die Entwicklung von Medikamenten beschleunigen wird, die auf die intrazelluläre Cholesterinhomöostase für die Tumortherapie abzielen. Das SOAT1-Protein kann überschüssiges intrazelluläres Cholesterin in Cholesterinester umwandeln und in Lipidtröpfchen speichern. Der Abbau oder die Hemmung von SOAT1 kann eine Vielzahl von Tumoren hemmen, indem es die Cholesterinhomöostase in Tumorzellen [8, 9] und den Immunzustand der Tumormikroumgebung [10, 11] reguliert. Wir haben zuvor herausgefunden, dass SOAT1 zur Stratifizierung von HCC-Patienten mit schlechter Prognose und als Wirkstoffziel für die Behandlung von Patienten mit diesem Subtyp verwendet werden kann. Es wurde gezeigt, dass Inhibitoren, die auf SOAT1 abzielen, sowohl in vitro als auch in vivo optimale Antitumorwirkungen entfalten. Allerdings gibt es nur wenige bekannte SOAT1-Inhibitoren – es wurde nur über Avasimibe, Nevanimibe und CI-976 berichtet –, was die Aussichten für die Arzneimittelentwicklung stark einschränkt.

Mehrere internationale Teams haben das Potenzial des SOAT1-Proteins in der Tumortherapie erkannt und nacheinander die genaue Kristallstruktur von SOAT1 beschrieben, was eine neue Möglichkeit für die Entwicklung von Zielprotein-basierten Arzneimitteln bietet [12, 13]. Das Hauptziel dieser Forschung bestand darin, die Vorarbeiten des Labors fortzusetzen und eine Hochdurchsatz-Liganden-Screening-Technologie zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele des SOAT1-Proteins für S-III-Leberkrebspatienten zu entwickeln. Darüber hinaus untersuchten wir den intrinsischen Zusammenhang zwischen der Cholesterinregulation und der Tumorentstehung und -entwicklung, um neue Erkenntnisse für die präzise Behandlung von Leberkrebs zu gewinnen.

Die humanen hepatoellulären Karzinomzelllinien HepG2, Hep3B und Huh7 wurden von ACTT mit den ACTT-Nummern HB-8065, HB-8064 und PTA-4583 erhalten. Die hepatoelluläre Karzinomzelllinie Hepa1-6 der Maus wurde von ACTT mit der ACTT-Nummer CRL-1830 erhalten. Die HEK293T-Zellen wurden von ACTT mit der ACTT-Nummer CRL-3216 erhalten. Die Expi293F™-Zellen wurden von Thermo Scientific mit der Kat.-Nr. A14527 bezogen. Alle Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS; Thermo Fisher Scientific), 100 μg/ml Streptomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin (Thermo Fisher Scientific) enthielt 37 °C mit 5 % CO2. Die Zellen wurden durch Inkubation mit 1 × TrypLE Express (Life Technologies) bei 37 ° C für 2 und 5 Minuten passagiert oder geerntet.

Die Tierpflege- und Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des National Center for Protein Sciences (Peking) genehmigt, Ethical Review-Nummer: IACUC-20210914-32MT. NOD-SCID- und C57BL/6 J-Mäuse wurden von Charles River, Inc (Peking, Vital River Laboratory Animal Technology) gekauft. Bei allen Mäusen handelte es sich um weibliche Mäuse im Alter von 4–5 Wochen. Nach der Tumortransplantation wuchs der Tumor auf 100 mm3 und begann, sich zufällig in drei Gruppen aufzuteilen: Kontrolle (200 μl – 30 % PEG400 + 0,5 % Tween 80 + 5 % Propylenglykol, intraperitoneale Injektion), Sorafenib (20 mg kg–1 Tag). −1, intraperitoneale Injektion), Nilotinib (20 mg kg−1 Tag−1, intraperitoneale Injektion). Nach 28-tägiger Behandlung wurden die Mäuse durch Wirbelsäulenluxation getötet. Der Prüfer war während des Experiments und bei der Beurteilung des Ergebnisses gegenüber der Gruppenmedikation blind. Die Tiere wurden in einer speziellen pathogenfreien Mäuseanlage im Tierzentrum National Center for Protein Sciences (Peking) gehalten. Die maximale Tumorgröße des CDX-Mausmodells des experimentellen Endpunkts beträgt gemäß IACUC in jeder Dimension weniger als 20 mm. In keinem der durchgeführten Experimente wurde eine der Richtlinien überschritten. Die Tumorgröße wurde mit einem Messschieber gemessen. Das Tumorvolumen in mm3 wurde nach der Formel berechnet: Tumorvolumen = 0,5 × Länge × (Breite)2.

Die Kristallstruktur des SOAT1-Proteins wurde von der Research Collaboration for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB) erhalten (Protein-PDB-Code: 6VUM und 6L47) [12, 13]. Die Screening-Verbindungsdatenbank enthält 31.276 von der FDA anerkannte Verbindungen von Selleck (https://www.selleck.cn/screening-libraries). Das virtuelle Screening wurde mit der zuvor beschriebenen Methode durchgeführt. Konkret verwendeten wir drei weithin akzeptierte Docking-Software: AutoDock 4.2 [14], Sybyl 2.0 [15] und Glide [16] für das molekulare Docking mit hohem Durchsatz. Für das molekulare Andocken mit autoDock haben wir zunächst die 3D-Kristallstruktur des Proteins geladen, polare Wasserstoffe hinzugefügt, dehydriert und energieoptimiert und dann eine Gittertasche geschaffen, um die gesamte katalytische SOAT1-Stelle aufzunehmen. Die Verbindungen werden außerdem einer polaren Hydrierung und Ladungsaddition sowie einer Energieoptimierung unterzogen, um das anzudockende Molekül zu erzeugen. Die Docking-Methode übernimmt den flexiblen Docking-Modus. Anschließend wurden die kleinen Moleküle in der Verbindungsbibliothek mithilfe eines genetischen Algorithmus in den Taschen der katalytischen Zentren angedockt und nach der klassischen Funktion der freien Energie sortiert. Diese Eingabedateien, einschließlich Proteinstruktur, aktiver Pocketbox und Gasteiger-Teilladung, wurden auf Standardparameter gesetzt. Das Andocken von Sybyl 2.0 wurde mithilfe des Surflex-Dock-Moduls durchgeführt. Zunächst wurden die Protein- und Verbindungsmolekülmoleküle polarisiert, hydriert, geladen und energieoptimiert. Der Schnittstellenbeutel war auf dem 15-Å-Rechteck mit den Koordinaten des His460-Rests an der katalytischen Stelle von SOAT1 zentriert. Die semiflexible Docking-Methode nutzte den integrierten Score als Scoring-Funktion. Das Glide-Docking-Modul wurde in der Schrödinger-Version 2015–4 implementiert. Wir haben zuerst das Modul des Proteinvorbereitungsassistenten verwendet, um polares Wasserstoff hinzuzufügen, aufzuladen und Wasser aus dem SOAT1-Protein zu entfernen. Anschließend wurde die Bindungsstelle als ein 15-Å-Rechteck definiert, das auf den Koordinaten des His460-Rests der katalytischen SOAT1-Stelle zentriert war. Gleichzeitig wurde das LigPrep-Modul mit Standardparametern zur Verarbeitung aller gescreenten Verbindungen verwendet. Für den Glide-Andockschritt haben wir Standardpräzision (SP) und Superpräzision (XP) für das molekulare Andocken ausgewählt. Das Andocken des Liganden übernimmt ein flexibles Andocken und der Energieverbrauch wird minimiert. Schließlich haben wir GlideScore als Bewertungsfunktion verwendet. Die Andockhaltung von Glide XP wurde verwendet, um das endgültige Andockergebnis anzuzeigen, und die Ergebnisbilder wurden mit PyMOL 2.3 vervollständigt [17].

Die Expression und Reinigung des SOAT1-Proteins bezieht sich auf die zuvor beschriebene Methode [12, 13]. Insbesondere haben wir die cDNA von menschlichem SOAT1 (NCBI-Referenzsequenz NM_003101.6) in einen pCAG-Vektor mit einem 6 × His-Tag am Carboxylende kloniert. Die HEK293F-Suspensionszellen wurden in Freestyle 293-Medium (Thermo Fisher Scientific) in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C kultiviert und mit 5 % CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit versorgt. Als die Zelldichte 2 × 106 Zellen pro Milliliter erreichte, wurden die Zellen vorübergehend mit dem Expressionsplasmid und Polyethylenimin transfiziert. Ungefähr 1 mg Expressionsplasmid und 3 mg Polyethylenimin (Sigma-Aldrich) werden in 50 ml frischem Medium vorgemischt und vor der Transfektion 15–30 Minuten lang inkubiert. Dann wurden 50 ml der Mischung zu 1 l Zellkultur gegeben und 15–30 Minuten lang inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden nach 48-stündiger Inkubation gesammelt. Um SOAT1 zu reinigen, wurden die gesammelten HEK293F-Zellen in einem Puffer resuspendiert, der 25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl (Puffer A) und eine Proteaseinhibitormischung (ungefähr 1 g Zellen plus 5–10 ml Puffer A) enthielt. Nach der Ultraschallbehandlung auf Eis wurde das Zellmembranpellet gesammelt und durch Zentrifugation bei 120.000 g in einer Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge bei 4 °C für 2 Stunden gewogen. Die Membranfraktion wurde 2 Stunden lang 25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl und 1 % (Gew./Vol.) Glykodiosgenin (GDN, Anatrace) (Puffer B) ausgesetzt. Nach einstündiger Zentrifugation bei 120.000 g wurde der Überstand gesucht und zur Affinitätsreinigung auf die Nickelsäule aufgetragen und mit einem Waschpuffer gewaschen, der 25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 40 mM Imidazol und 0,02 % GDN (Puffer C) enthielt ). Das Protein wurde mit einem Puffer eluiert, der 25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 400 mM Imidazol und 0,02 % GDN (Puffer D) enthielt. Anschließend wurde das Eluat konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie (SuperdexTM200 10/300 gL, GE Healthcare) in einem Puffer mit 25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl und 0,02 % GDN (Puffer E) gereinigt und anschließend gereinigt. Die Proteinkonzentration und der SDS-PAGE-Nachweis, die Proteinkonzentration und der Reinheitsnachweis durch den Standard (Reinheit > 95 %) können aufgeteilt und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert werden.

Ein optischer Biosensor Biacore T200 (GE Healthcare) wurde für das Affinitätsscreening von Zielproteinen und die Bestimmung der Werte der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet. Der CM5-Chip (GE Healthcare) wurde verwendet, um das Zielprotein zu koppeln, und der Laufpuffer war Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS, Sigma-Aldrich) mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich). Vor der Kopplung wurde der Chipkanal mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, GE Healthcare) und N-Hydroxysuccinimid (NHS, GE Healthcare) bei einer Flussrate von 10 μL/min für 60 s aktiviert. Danach wurde das rekombinant exprimierte und gereinigte SOAT1-Protein mit 10 mmol/L Natriumacetatpuffer (pH 5,0) auf etwa 50 mg/ml verdünnt. Die Durchflussrate für die SOAT1-Proteinlösung betrug 10 μl/min und die Injektionszeit dauerte 120 s. Das Proteinkopplungsvolumen des Kanals betrug etwa 8000 RU und der Kanal wurde 120 s lang mit Ethanolamin bei einer Flussrate von 10 μl/min versiegelt. Für das Screening der Molekülfragmentbibliothek wurde die Konzentration jeder Verbindung mit Laufpuffer in einer 96-Well-Messplatte auf 100 nmol/l verdünnt und dann mit einer Flussrate von 30 μl/min durch den CM5-Chip geleitet, der an das Zielprotein gekoppelt war für 180 s. Nach Angabe einer Probe wurde der Chip 60 s lang mit NaOH bei einer Flussrate von 30 μL/min regeneriert. Alle Rohdaten wurden aufgezeichnet und gespeichert. Bei der Bestimmung des KD-Werts der Protein-Ligand-Wechselwirkungsaffinität wurde jede Verbindung 11-fach von 20 μM auf 0,0195 nM verdünnt und die kleinen Moleküle wurden von niedriger Konzentration zu hoher Konzentration durch den an das Zielprotein gekoppelten Chip geleitet. Die Flussrate betrug 30 μL/min und die Dauer betrug 180 s. Nachdem jeder Konzentrationspunkt durchflossen war, wurde der Chip 60 s lang mit NaOH bei einer Flussrate von 30 μL/min regeneriert und anschließend die Daten in Echtzeit aufgezeichnet und gespeichert. Molekulargewichtsanpassung und Lösungsmittelkorrektur wurden gleichzeitig verwendet, um unspezifische Bindungs- und Signaldrift-Molekulareffekte zu beseitigen. Schließlich wurde die gesamte Datenverarbeitung in der Analysesoftware Biacore T200 (GE Healthcare) durchgeführt.

Um die Wirkung der Verbindung auf die Lebensfähigkeit von Leberkrebszellen zu bestimmen, wurde das CCK-8-Kit (Sigma-Aldrich) zum Nachweis der Lebensfähigkeit der Zellen verwendet. HepG2-, Hep3B- und Huh7-Leberkrebszellen wurden in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von DMEM, das 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 12 Stunden lang kultiviert , wurde die Konzentration einer einzelnen Verbindung von 20 μM auf das Zehnfache verdünnt und jeder Konzentrationspunkt wurde dreimal wiederholt. Die verdünnte Verbindung wurde dem serumfreien Medium zugesetzt, um die Zellen 48 Stunden lang zu behandeln, und dann wurden die Zellen mit dem CCK-8-Kit auf Aktivität untersucht, wobei auf die Bedienungsanleitung für die experimentelle Methode verwiesen wurde. Nachdem das Mikroplatten-Lesegerät von Tecan alle Absorptionswerte erfasst hat, wird der IC50-Wert des Arzneimittels für die Zellen anhand des Konzentrations-Absorptionswerts in GraphPad (GraphPad Prism 8.2.1, GraphPad) berechnet.

Das Zellproliferationsexperiment wurde mit xCELLigence RTCA DP (Roche) durchgeführt und für die Zellkultur und den Nachweis wurde die Zellnachweisplatte E-plate-16 (Roche) verwendet. Insbesondere werden die HepG2-, Hep3B- und Huh7-Zellen zunächst zu einer Zellsuspension verarbeitet und gezählt, und die Zellkonzentration wird zur späteren Verwendung auf 8 × 104 Zellen/l verdünnt. Nach Zugabe von 50 µL Medium zu den Vertiefungen der E-Platte-16 für den Basisliniennachweis wurden 100 µL versöhnte Zellsuspension in die Vertiefungen gegeben, um die Anzahl der Zellen pro Vertiefung auf 8000 Zellen/100 µL zu erhöhen. Nach 30-minütigem Stehen auf der Reinbank bei Raumtemperatur wird die E-Platte-16 zum Testen erneut auf die RTCA-Station gelegt. Das Arbeitsprogramm ist so eingestellt, dass es alle 15 Minuten den Zellindex ermittelt, den Zellwachstumsprozess aufzeichnet, das Programm nach 3–4 Stunden Kultivierung pausiert und die vorbereiteten Arzneimittel hinzufügt (die Konzentration jedes Arzneimittels bezieht sich auf den IC50-Wert von). (Bestimmung der Zelllebensfähigkeit) und Fortsetzung der Kultivierung und Beobachtung. Nach der Zugabe des Arzneimittels ist das Programm so eingestellt, dass der Zellindex alle 15 Minuten einmal ermittelt und 120 Stunden lang kontinuierlich beobachtet und aufgezeichnet wird. Die Index-Zeit-Kurve des Zellwachstums wurde schließlich in GraphPad Prism 8.2.1 gezeichnet.

Die Wirkung des Arzneimittels auf die Migration von Leberkrebszellen wurde mithilfe eines klassischen Transwell-Migrationstests ermittelt. Es wurden HepG2-, Hep3B- und Huh7-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase entnommen und die Zellzahl mit serumfreiem DMEM-Medium auf 1 × 106 eingestellt. Zweihundert Mikroliter Zellen wurden in die obere Kammer von Transwell (Millipore) inokuliert. 600 Mikroliter DMEM-Medium mit 20 % FBS wurden in die Kammer gegeben. Nach 12-stündiger Kultivierung in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 wurde das zu testende Arzneimittel in die obere und untere Kammer des Transwells gegeben. Die Arzneimittelkonzentration muss dem IC50 oder dem Doppelten der oben ermittelten Konzentration entnommen werden. Nach 24-stündiger Kultivierung wurde das Transwell mit einem Wattestäbchen entfernt. Zellen, die die Kammer nicht durchdrangen, wurden 15 Minuten lang mit Methanol fixiert, dreimal mit PBS gewaschen, 30 Minuten lang mit Kristallviolett gefärbt und in fünf verschiedenen Sichtfeldern von oben, unten, links und rechts unter einem × fotografiert 100 Lichtmikroskop und die durchschnittliche Anzahl der Zellen wurde berechnet. Hemmungsrate des Arzneimittels auf die Zellmigration = (1 Zusatzgruppe/Kontrollgruppe) × 100 %.

Im Zellzyklustest wurde Durchflusszytometrie zum Nachweis der mit Propidiumiodid (PI) gefärbten Zellen verwendet. Die Zellen wurden in eiskaltem Puffer mit 70 % Ethanol fixiert (ungefähr 2 × 106). Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit PBS resuspendiert. Abschließend wurde den Proben eine Reaktionslösung mit 25 mg/ml PI (CWBIO, Peking, China) und 50 mg/ml RNase A zugesetzt und 30 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert, um die DNA anzufärben. Die von der PI-DNA einzelner Zellen emittierte Fluoreszenz wurde mit einem BD LSRFortessa (BD, USA) FACS-Durchflusszytometer gemessen.

HepG2- und Hep3B-Zellen wurden in einer Platte mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 103 Zellen/Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden mit Nevanimibe (5 μM) und Nilotinib (500 nM) sowie DMSO als Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden 8 Tage lang inkubiert. Das Medium wurde vorsichtig entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang mit 100 % Methanol fixiert. Nach dem Entfernen von Methanol wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 0,5 % (Gew./Vol.) Kristallviolett gefärbt und mit Leitungswasser gewaschen. Die Platte wurde bei 25 °C getrocknet und es wurden Bilder aufgenommen. Der gefärbte Bereich wurde automatisch mit ImageJ gemessen. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal durchgeführt. Die Fläche der Kolonie wurde als Prozentsatz der Gesamtfläche des Brunnens berechnet.

In dieser Studie wurden menschliche HepG2- und hepatozelluläre Hepa1-6-Karzinomzellen der Maus in unserem murinen Xenotransplantations-Tumormodell verwendet, und immungeschwächte NOD-SCID-Mäuse und normale C57BL/6 J-Mäuse (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology) wurden zur Modellierung der Zelle verwendet -abgeleitete Xenotransplantate. Wir resuspendierten 5 × 106 Zellen in 200 μl sterilem PBS und injizierten die resuspendierten Zellen in die rechte Flanke jedes NOD-SCID oder C57BL/6 J (weiblich, 4–5 Wochen alt). Sobald der Tumor 100 mm3 erreichte, wurden die Mäuse randomisiert in Gruppen eingeteilt. In diesem Experiment wurde gleichzeitig die Wirksamkeit von Nilotinib und Sorafenib bewertet und eine Placebo-Kontrollgruppe (n = 6 für jedes Modell) eingerichtet. Die Dosierung der drei Medikamente betrug 20 mg/kg/Tag und die Medikamente wurden den Mäusen durch intrapulmonale Injektion verabreicht. Die Verabreichung sollte voraussichtlich vier Wochen lang andauern und die Tumorgröße wurde jeden zweiten Tag gemessen. Die Mäuse wurden durch Wirbelsäulenverrenkung getötet. Während des Experiments und bei der Beurteilung der Auswirkungen war dem Forscher die Gruppenmedikation nicht bekannt. Die Tiere wurden in der pathogenfreien Mausanlage des National Protein Science Center (Peking, China) des Animal Center gehalten. Gemäß unserem Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) darf die maximale Tumorgröße des CDX-Mausmodells in keiner Größe 20 mm überschreiten. Alle Richtlinien wurden in dieser Studie befolgt. Zur Messung der Tumorgröße wurden Messschieber verwendet. Zur Berechnung des Tumorvolumens in mm3 wurde die folgende Formel verwendet: Tumorvolumen = 0,5 × Länge × (Breite)2.

Für Omics-Proben wurden in der logarithmischen Phase gezüchtete HepG2-Zellen für Experimente verwendet. Nachdem die Zellen 12 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert worden waren, wurden jeder Schale zwei Verbindungen Nevanimibe und Nilotinib zugesetzt (Dosierung siehe oben genannte IC50), und die Kontrollgruppe erhielt 1/1000 DMSO. und dann 12 Stunden lang weiter inkubieren. Zur Proteomanalyse wurden die Zellen in 75-cm2-Platten kultiviert. Jede Probe lieferte 5 × 10e6-Zellen und jede Gruppe wurde dreimal wiederholt. Bei der Stoffwechselanalyse wurden die Zellen in 150-cm2-Platten kultiviert. Die Anzahl der Zellen in jeder Probe betrug 1 × 10e7 und jede Gruppe wurde sechsmal wiederholt. Zur Zählung aller Zellen wurde der automatische Zellzähler Bio-Rad TC20TM (Bio-Rad) verwendet.

Gemäß den folgenden Versuchsbedingungen wurden HepG2-Zellen in drei Gruppen eingeteilt: (1) Nevanimibe-Behandlung, (2) Nilotinib-Behandlung und (3) DMSO-Behandlung. Jede Gruppe enthält drei biologische Kopien. Die Methoden zur Proteinextraktion, Verdauung, Peptidtrennung und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) entsprachen in etwa unseren bisherigen Forschungsmethoden. Kurz gesagt, die Probe wurde mit Lysepuffer Ultraschall lysiert und dann 10 Minuten lang bei 4 ° C und 12.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die gleiche Proteinmenge in jeder Probe wurde enzymatisch verdaut, und die durch Trypsin verdauten Peptide wurden mit Phenomenex entsalzt und dann im Vakuum gefriergetrocknet. Die Peptide wurden in der mobilen Phase A der Flüssigkeitschromatographie (0,1 % (v/v) wässrige Ameisensäurelösung) gelöst und dann mit dem gekoppelten Nanoflow-Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) (Easy nLC1000 System, Thermo Fisher) getrennt ein Orbitrap Fusion-Massenspektrometer (Thermo Fisher) mit einer Nanoelektrospray-Ionenquelle (Thermo Fisher). Die mobile Phase A ist eine wässrige Lösung mit 0,1 % Ameisensäure und 2 % Acetonitril; Puffer B ist eine wässrige Lösung, die 0,1 % Ameisensäure und 90 % Acetonitril enthält. Die Massenspektrendaten wurden mit ProteomeDiscover 2.0 und MaxQuant 1.6.1.0 durchsucht und in der SwissProt-Datenbank für menschliche Proteome abgeglichen. Beim Matching wurde auch die Anti-Datenbank verwendet, um die durch Zufallsmatching verursachte Falsch-Positiv-Rate (FDR) zu eliminieren. Die Protease wurde auf Trypsin/P eingestellt, die Mindestlänge des Peptids wurde auf 7 Aminosäurereste eingestellt, die maximale Anzahl fehlender Spaltstellen wurde auf 2 eingestellt und die maximale Anzahl an Ladungen wurde auf 5 eingestellt. Der maximal tolerierbare Massenfehler von Das primäre Vorläufer-Ion wurde auf 10 ppm und der maximal tolerierbare Massenfehler des sekundären Produktion-Ions auf 0,02 Da eingestellt. Die feste Modifikation wurde auf Cystein-Alkylierung und die variable Modifikation auf Methionin-Oxidation eingestellt. Der Peptid-Score lag über 20 Punkten. Wir verwendeten außerdem 1 % Glyco-Diosgenin (GDN) oder 5 % CHAPS für eine bessere Extraktion des Membranproteins während der Proteinextraktion.

Die gesamten Metaboliten wurden aus jeder Gruppe unter Verwendung von etwa 1 × 107 Zellen in 1 ml wässriger MTBE-Methanollösung (Methyl-tert-butylether, Sigma-Aldrich) (7:2:1, Vol./Vol.) extrahiert. Zunächst wurden den gewaschenen Zellen 100 μl Wasser zugesetzt, um die Zellen zu resuspendieren. Nach dem Mischen wurden 200 μl Methanollösung hinzugefügt. Anschließend wurden die Proben in einen Schüttler gegeben und 3 Minuten lang gevortext. Dann wurden 700 μl MTBE zugegeben und die Proben 3 Minuten lang gevortext. Anschließend wurden die Zellen mittels Ultraschall bei 4 °C und 200 W Leistung 5 Minuten lang aufgeschlossen. Das Programm wurde auf Ultraschall für 1 s und Pause für 2 s eingestellt. Abschließend wurden die Proben 1 Stunde lang bei 25 °C inkubiert, 15 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert und anschließend der Überstand in ein neues EP-Röhrchen überführt. Die Proben wurden bei 45 °C vakuumgetrocknet, um organische Lösungsmittel zu entfernen, und dann in einen Gefriertrockner gegeben, um die verbleibende Feuchtigkeit zu entfernen. Für den LC-MS-Nachweis wurden die Proben mit einer wässrigen MTBE-Methanollösung (7:2:1, Vol./Vol.) gelöst. Die Proben wurden mittels LC-MS (ein UPLC I-Klasse/VION IMS QTOF-Massenspektrometriesystem, Waters) analysiert. Die Proben wurden mithilfe einer C18-Umkehrchromatographiesäule (3 μm, Durashell, Agela Technologies) getrennt. Die Säulentemperatur betrug 20 °C und die Flussrate betrug 0,3 ml/min. Die mobile Phase der Zusammensetzung A war eine wässrige 10 mM Ammoniumacetat-Acetonitril-Lösung (Acetonitril:Wasser = 6:4, Vol./Vol.) und B war eine 10 mM Ammoniumacetat-Acetonitril-Isopropanol-Lösung (Acetonitril: Isopropanol = 1:9, Vol./Vol.). ). Das Gradientenelutionsverfahren war wie folgt: 0–7 Minuten, B wurde bei 30 % gehalten; 7–25 Minuten, B änderte sich linear von 30 auf 100 %; 25,1–30 Minuten, B wurde bei 30 % gehalten. Die Probe wurde während der gesamten Analyse bei 10 °C in den Autosampler gegeben. Um den Einfluss zu vermeiden, der durch Schwankungen des Detektionssignals des Instruments verursacht wird, wurde eine Zufallssequenz zur kontinuierlichen Analyse der Probe übernommen. In der Probenwarteschlange wurde alle acht Versuchsproben eine QC-Probe eingestellt, um die Stabilität des Systems und die Zuverlässigkeit der Versuchsdaten zu überwachen und zu bewerten. Massenspektrometriebedingungen wurden mithilfe der Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven und negativen Ionenmodus erfasst. Die ESI-positiven Quellenbedingungen waren wie folgt: Heiztemperatur 300 °C; Sprühspannung 3,0 kV; Kapillartemperatur 350 °C; S-Objektiv RF-Level 50 %; MS1-Scanbereiche 50–1500. Die negativen ESI-Quellenbedingungen waren wie folgt: Heiztemperatur 300 °C; Sprühspannung 2,5 kV; Kapillartemperatur 350 °C; S-Objektiv RF-Level 60 %; MS1-Scanbereiche 50–1500. Die Masse-Ladungs-Verhältnisse von Lipidmolekülen und Lipidfragmenten wurden nach der folgenden Methode erfasst: Nach jedem vollständigen Scan wurden 10 Schnittmuster (MS2-Scan, HCD) erfasst. MS1 hatte eine Auflösung von 70.000 bei m/z 200 und MS2 hatte eine Auflösung von 17.500 bei m/z 200. Die Rohdaten wurden mit der MassLynx-Software (MassLynx 4.2, Watres) und dann mit Progenesis QI (Progenesis QI 2.4, Waters) erfasst ), MS-DIAL (kostenloser Download unter http://prime.psc.riken.jp/) und die Analysesoftware Unifi (Unifi 2.0, Waters) wurden für die nicht zielgerichtete und gezielte Identifizierung verwendet. Die Rohdaten von LC-MS/MS dienten der Peakausrichtung, der Retentionszeitkorrektur und der Peakflächenextraktion. Die Ausrichtung der MS1- und MS2-Toleranz wurde auf 0,001 Da und die Retentionszeittoleranz auf 0,02 Minuten eingestellt. Bei der Identifizierung der Metabolitenstruktur wurden Methoden zur genauen Massenanpassung (< 10 ppm) und sekundäre Spektrumsanpassungen verwendet, um selbst erstellte Datenbanken aus dem Labor abzurufen. Für die Datenstatistik und -analyse wurden SIMCA-P (SIMCA 14.1, Umetrics) und GraphPad-Software verwendet. R_studio (kostenloser Download auf https://www.rstudio.com/) wurde zur Durchführung von Korrelationsanalysen und Zuordnungen verwendet.

Die Proteine ​​wurden in 25 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl und 3 % (w/v) CHAPS-Puffer extrahiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung auf Eis für 5 Minuten (Beschallung für 3 Sekunden, Aus für 2 Sekunden; Leistung 60 W) lysiert, 15 Minuten lang bei 4 ° C mit 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Die Proteinlysate wurden mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay quantifiziert und dann mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese aufgetrennt. SDS-PAGE wurde auf einem 10 % SDS-PAGE-Gel 90 Minuten lang bei 160 V durchgeführt und anschließend wurde eine Bromphenolblau-Färbung durchgeführt. Die Fotos wurden nach dem Entfärben mit einer Essigsäure-Methanol-Wasser-Lösung aufgenommen. Die Western-Blot-Analyse wurde an ungefärbten SDS-PAGE-Gelen durchgeführt, die auf Nitrozellulosemembranen übertragen wurden. Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang bei 25 °C mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Membranen 12 Stunden lang bei 4 °C mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: polyklonaler Kaninchen-Anti-SOAT1-Antikörper (ABN66, Merck) und monoklonaler Kaninchen-Anti-β-Actin-Antikörper (6609, Proteintech). Anschließend wurden die Membranen gewaschen und mit sekundären Antikörpern 1 Stunde lang bei 25 °C inkubiert. Proteinbanden wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Western-Blot-Substrats sichtbar gemacht.

Um die Wirkung der SOAT1-zielenden Verbindungen auf den Tumorimmunphänotyp zu analysieren, wurden die Tumoren von Mäusen 28 Tage nach der Dosierung entnommen, zu einer Einzelzellsuspension gemahlen und in einem Zentrifugenröhrchen mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS, Gibco) 4 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit Kollagenase 2 und Kollagenase 4 verdaut, um Bindegewebe und Kollagenbestandteile zu entfernen. Abschließend wurde die Immunzellpopulation mit 35 % Percoll angereichert. Wir verwendeten einen Anti-CD45-APC/cy7-Antikörper (103.115, Biolegend), einen Anti-CD11b-APC-Antikörper (K009928M, Solarbio), einen Anti-CD3-BV510-Antikörper (100.233, BD Biosciences) und einen Anti-CD19b-FITC-Antikörper (53.343). , Cell Signaling Technology), Anti-F4/80-PE-Antikörper (64763S, Cell Signaling Technology), Anti-Ly6G-Alexa fluor 700-Antikörper (127.622, Biolegend), Anti-CD8-PerPC/cy5.5-Antikörper (100.733, Biolegend ) und Anti-CD49-BV421-Antikörper (740.030, BD Biosciences) zur Färbung. Die Proben wurden mit dem BD LSR Fortessa Durchflusszytometer (BD Biosciences) gesammelt. Anschließend verwendeten wir die FlowJo-Software (kostenloser Download auf https://www.flowjo.com/), um die Daten zu analysieren. Die Gating-/Sequenzierungsstrategie des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) ist in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt.

In dieser Studie werden die UniProt-GOA-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/GOA/) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Datenbank (https://www.kegg.jp/) verwendet Es werden Anmerkungen zur Ontologie (GO) und zum Stoffwechselweg bereitgestellt. Vulkan- und Venn-Diagramme wurden verwendet, um unterschiedliche Proteine ​​oder Metaboliten zu identifizieren und zu klassifizieren. Alle unterschiedlich exprimierten Proteine ​​oder Metaboliten wurden in R_studio importiert, um nach relevanten Signalwegen zu suchen. Die Ergebnisse der Pfade wurden automatisch in Rangkategorien eingeteilt und als signifikant angesehen, wenn der angepasste P-Wert < 0,05 war, und ein P < 0,01 wurde als sehr signifikant angesehen. GO analysiert die biologischen Prozesse, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen fehlregulierter Proteine ​​oder Metaboliten. Differenzielle Proteine ​​oder Metaboliten jedes Signalwegs wurden mithilfe der Online-Website KEGG markiert und die endgültigen Bilder wurden in Cytoscape 7.1 visualisiert [18]. R_studio wurde verwendet, um die verschiedenen Vulkankarten, Venn-Diagramme, Streudiagramme und Korrelations-Heatmaps zu zeichnen.

Eine detaillierte Analyse der statistischen Ergebnisse finden Sie in der jeweiligen Methode. Die in diesem Bericht erscheinenden P-Werte wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. AP < 0,05 galt als signifikant und ein P < 0,01 galt als sehr signifikant. Die relative Standardabweichung (RSD) wurde verwendet, um die Genauigkeit der analytischen Testergebnisse auszudrücken. Je kleiner der Wert, desto besser ist die Wiederholbarkeit. Die Falscherkennungsrate (FDR) ist der Erwartungswert der Anzahl falscher Ablehnungen als Prozentsatz aller abgelehnten Hypothesen. Als Kontrollindex für die Fehlerrate der Testhypothese wurde der Kontrollwert entsprechend dem Bedarf ausgewählt, und der Wert des traditionellen Hypothesentests wurde normalerweise auf 0,05 festgelegt. In dieser Studie wurden alle biochemischen Analysen mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Zur Analyse der Daten wurde GraphPad Prism 8.21 verwendet. Zur Messung der linearen Korrelation der Daten wurde eine Pearson-Korrelationsanalyse verwendet. Ein Vulkandiagramm wurde verwendet, um die Ergebnisse der Differentialausdrucksanalyse anzuzeigen, und ein Venn-Diagramm wurde verwendet, um die logische Verbindung zwischen verschiedenen Gruppen (Sets) anzuzeigen. Die GO-Anreicherungsanalyse und die KEGG-Pathway-Analyse basieren auf Online-Tools (wie KEGG-Mapper und String) und Offline-Tools (wie Cytoscape 3.7). Für andere nicht-rechnerische Analysen wurde Microsoft Excel verwendet (Microsoft Excel 2019).

Die Protein-MS-Daten wurden in iProX [19] (einem offiziellen Mitglied des ProteomeXchange-Konsortiums) als Anhangdatei (http://www.iprox.org) mit der Projekt-ID IPX0003944000 hinterlegt. Die in diesem Artikel berichteten Metabolomics-Daten wurden in MetaboLights [20] als Anhangdatei (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS4088) mit der Projekt-ID MTBLS4088 hinterlegt.

Zuvor haben wir herausgefunden, dass das SOAT1-Protein eng mit dem Überleben der Patienten mit dem bösartigsten hepatozellulären Karzinom zusammenhängt und vielversprechend ist, ein potenzielles Ziel für die Therapie mit hepatozellulärem Karzinom zu werden [8]. In dieser Studie haben wir eine integrierte Affinitätsscreening-Technologie für virtuelles Screening entwickelt, die auf dem SOAT1-Protein basiert, um Zielproteinliganden schnell zu entdecken. Der gesamte Arbeitsablauf begann mit der hochauflösenden Kristallstruktur des menschlichen SOAT1-Homodimers und -Tetramers (PDB-Code: 6VUM und 6L47) [12, 13] (Abbildung S1a). Als Screening-Zielstelle wurde der katalytische Hohlraum am His460-Rest von SOAT1 definiert, der als katalytische Stelle für die Synthese von Cholesterinestern zwischen Cholesterin und Acetyl-CoA gilt. Molekulares Docking wurde mithilfe von vier verschiedenen Ensembledocking-Tools (AutoDock 4.2, SYBYL 2.0 und den Modi Standard Precision (SP) und Extra Precision (XP) in Glide) implementiert, um die Genauigkeit und Trefferquote des virtuellen Screenings zu verbessern. Alle 31.276 Verbindungen in den FDA-Bibliotheken wurden verwendet, und als Ergebnis wurden insgesamt 62 Verbindungen, die von allen vier Docking-Tools mit einem höheren Wert als dem der Positivkontrolle bewertet wurden, als mutmaßliche Liganden identifiziert (Abb. 1a und Tabelle S1, voller Andockergebnisse, die in einer separaten Zusatzdatei angezeigt werden 1). Eine weitere hochpräzise molekulare Docking-Analyse zeigte, dass die gescreenten Verbindungen (Nilotinib als Vertreter) und die Kristallverbindung von Nevanimibe beide an die katalytische Tasche des SOAT1-Proteins banden (Abb. 1b).

Wirkstoffscreening auf Basis des SOAT1-Proteins. Ein strukturbasiertes virtuelles SOAT1-Protein-Screening ergab 62 potenzielle Verbindungen (in Orange). Die 200 besten Verbindungen wurden aus den Screening-Ergebnissen jeder Software ausgewählt und von mindestens drei anderen Softwareplattformen gescreent. Alle Ergebnisse wurden mit Avasimibe verglichen, mit einer relativen Standardabweichung (RSD) < 15 %. b Sowohl der SOAT1-Rezeptor als auch die Kontrollverbindung (Nilotinib) der gescreenten Verbindungen banden im Vergleich zur Positivkontrolle Nevanimibe an der katalytischen Stelle. c Arzneimittelscreening-Schema des SOAT1-Proteins mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR). d Der KD der bekannten Co-Kristallliganden (Nevanimibe) von SOAT1 wurde durch SPR berechnet, um die Zuverlässigkeit des Systems zu bestätigen. Das Screening der SPR-Fragmentbibliothek verifizierte 33 virtuelle Screening-Ergebnisse. Darunter waren 10 Verbindungen mit einer Response Unit (RU) > 10 (orangefarbenes Histogramm), darunter drei Positivkontrollen (roter Stern), 16 Verbindungen, die nicht an das Protein banden (schwarzes Histogramm), und 7 weitere Verbindungen hatten ein Signal Fehler (graues Histogramm). f Der KD-Wert der gescreenten Liganden wurde durch SPR berechnet

Ein SOAT1-basiertes Affinitätsscreening wurde durchgeführt, um die mutmaßlichen Liganden des virtuellen Screenings zu verifizieren. Die cDNA voller Länge von menschlichem SOAT1 (NCBI-ID: 6646) wurde mit einem carboxyterminalen 6 × His-Tag in den pCAG-Vektor kloniert (Abbildung S1b, c und d). Das Protein wurde in HEK293F-Zellen exprimiert und nach einer Reihe von Proteinreinigungsschritten wurde eine stabile Dimerform des SOAT1-Proteins erhalten (Abbildung S1e und f). Das gereinigte Protein wurde für das Affinitätsscreening und die Verifizierung durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) auf einem CM5-Chip fixiert. Der allgemeine Prozess ist in Abb. 1c dargestellt. Zunächst zeigte die Analyse der Positivkontrollen Nevanimibe, dass eine geeignete Bindung an das SOAT1-Protein auftrat, was darauf hinwies, dass das Screening-System robust war (Abb. 1d). Anschließend wurden die 33 am höchsten bewerteten und leicht zu erhaltenden Verbindungen (etwa die Hälfte der 62 Kandidatenverbindungen im virtuellen Screening) durch Screening der SPR-Fragmentbibliothek weiter identifiziert. Von diesen 33 wurde festgestellt, dass 10 Verbindungen an SOAT1 binden (einschließlich drei Positivkontrollen: Avasimibe, Nevanimibe und CI-976) (Abb. 1e, orangefarbene Spalte), 16 Verbindungen zeigten fast keine Bindung an SOAT1-Protein (Abb. 1e, schwarze Säule) und 7 Verbindungen konnten durch SPR aufgrund der Eigenschaften der Moleküle selbst nicht genau bestimmt werden (Abb. 1e, graue Säule). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es trotz strenger Formulierung der Screening-Regeln während des virtuellen Screening-Prozesses immer noch falsch positive Ergebnisse gibt. Schließlich wurden diese falsch positiven Ergebnisse durch Affinitätsscreening eliminiert.

Anschließend haben wir den Affinitätsindex-KD-Wert der oben genannten 10 Verbindungen mit SOAT1 bis SPR weiter bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass drei Verbindungen, Nilotinib, ABT-737 und Evacetrapib, einen KD-Wert von 2,02 E−7 M, 7,19 E−7 M bzw. 3,91 E−6 M aufwiesen (Abb. 1f). Nilotinib hatte niedrigere KD-Werte für SOAT1-Protein im Vergleich zu den Positivkontrollen Nevanimibe, was auf das Potenzial von Nilotinib als gezielt auf SOAT1 ausgerichtete Arzneimittel hinweist. Zusammenfassend haben wir ein virtuelles Screening und eine integrierte Affinitätsscreening-Strategie für die schnelle und effiziente Entdeckung von Liganden für das SOAT1-Protein entwickelt und letztendlich drei Kandidatenverbindungen erhalten, die auf das SOAT1-Protein abzielen.

Das Expressionsniveau von SOAT1 korrelierte mit der Gesamtüberlebensrate von Hepatozytenpatienten in unserer Proteomik- und Gewebe-Microarray-Kohorte (TMA) sowie dem Datensatz des Cancer Genome Atlas (TCGA) [21]. Je höher die SOAT1-Expression, desto geringer ist das Gesamtüberleben der Patienten. In unserer vorherigen Studie haben wir auch gezeigt, dass der Abbau des SOAT1-Gens das Wachstum hepatozellulärer Karzinomzelllinien signifikant hemmen kann [8]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, das Potenzial haben, das Wachstum von hepatozellulärem Karzinom zu hemmen. Um die Wirkung der auf SOAT1 gerichteten Verbindungen auf hepatozelluläres Karzinom zu bestimmen, haben wir drei verschiedene hepatozelluläre Karzinomzelllinien, Hep3B, HepG2 und Huh7, für die Prüfung der Arzneimittelaktivität ausgewählt. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die relative Expression von SOAT1 in HepG2-Zellen höher war als die in Hep3B-Zellen und Huh7-Zellen (Abb. 2a, ursprüngliche, nicht beschnittene Blots in der Zusatzdatei 2). Die repräsentative Verbindung Nilotinib wurde mit der Positivkontrolle Nevanimibe verglichen. Sowohl die Zellmigrations- als auch die Zellproliferationsergebnisse zeigten, dass die beiden Verbindungen die Migration und Proliferation von Leberkrebszellen in verschiedenen Konzentrationen signifikant hemmten, Nilotinib jedoch die hemmende Wirkung bei niedrigeren Konzentrationen erzielte (Abb. 2b und Abbildung S2a, b). Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der beiden Verbindungen auf den drei Leberkrebszelllinien zeigte auch, dass der IC50-Wert von Nilotinib viel niedriger war als der der Positivkontrollen Nevanimibe (Abb. 2b). Darüber hinaus war die hemmende Wirkung der Verbindungen auf Zelllinien mit hoher SOAT1-Expression besser als auf Zelllinien mit niedriger SOAT1-Expression. Dies deutete darauf hin, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, eine bessere therapeutische Wirkung bei Patienten mit hoher SOAT1-Expression haben, was auch mit unseren früheren Ergebnissen übereinstimmt. Schließlich zeigten die Ergebnisse von Koloniebildungs- und Zellzyklusexperimenten, dass Nevanimibe und Nilotinib Zellen im frühen DNA-Synthesestadium signifikant anhalten und die DNA-Replikationsphase (G1-Phase und S-Phase) blockieren können (Abbildung S2c) und die Koloniebildung von hepatozellulären Karzinomzellen hemmen (Abb. 2c, d).

Überprüfung der In-vitro- und In-vivo-Aktivität der identifizierten Verbindungen. a Relative Expression von SOAT1 in verschiedenen Leberkrebszelllinien (n = 3). b Dosis-Wirkungs-Kurven von hepatozellulären Karzinomzelllinien auf die Behandlung mit Nilotinib im Vergleich zur Positivkontrolle (Nevanimibe), mit einer Endpunktmessung nach 48 Stunden (n = 3). c, d Koloniebildungstest in Hep3B- und HepG2-Zellen. Die Fläche der Kolonie wurde mit der ImageJ-Software analysiert und mit GraphPad Prism 8.21 grafisch dargestellt (n = 3). Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SD. e Bilder des Tumorvolumens bei Mäusen, die 28 Tage lang mit Nilotinib, Sorafenib und der Kontrollgruppe behandelt wurden. Die Positivkontrolle ist Sorafenib und wurde mit Placebo-Kontrollen verglichen. f Tumorwachstumskurve von Tumor-Xenotransplantat-Mäusen, die an den angegebenen Tagen mit Nilotinib (20 mg/kg/Tag), Sorafenib (20 mg/kg/Tag) und Kontrollen behandelt wurden (n = 6 Mäuse pro Gruppe). Der Kreis, das Dreieck und das Kästchen geben das durchschnittliche Tumorvolumen an (± SEM). Die P-Werte wurden durch den zweiseitigen Log-Rank-Test berechnet. g Immunhistochemische Färbung von SOAT1 in Tumoren nach Nilotinib, Sorafenib und Kontrolle (Maßstab = 50 μm)

Um die therapeutische Wirkung der Verbindungen auf hepatozelluläres Karzinom weiter zu bestimmen, haben wir die Bewertung der Wirksamkeit auf ein Maustumor-Xenotransplantatmodell ausgeweitet. Zunächst beobachteten wir die Wirkung der Verbindung auf den physiologischen Zustand der Zielmäuse (NOD-SCID). Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die vierwöchige Behandlung mit Nilotinib und dem Positivkontrollmedikament Sorafenib keinen Einfluss auf das Körpergewicht der Xenotransplantat-Mäuse hatte (Abbildung S2d). Anschließend wurde Nilotinib in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag (n = 6) intraperitoneal in aus HepG2-Zellen gewonnene Xenotransplantatmäuse injiziert. Als Blindkontrolle diente ein Placebo und als Positivkontrolle das Erstlinienmedikament Sorafenib zur Behandlung von Leberkrebs. Die Verabreichung wurde 4 Wochen lang fortgesetzt und das Tumorwachstum beobachtet und aufgezeichnet. Wie in Abb. 2e gezeigt, war das Tumorvolumen in den mit Nilotinib behandelten Gruppen nach 4 Wochen kontinuierlicher Verabreichung deutlich kleiner als in der Blindkontrollgruppe und vergleichbar mit dem der Positivkontrollgruppe. Die Tumorwachstumskurve zeigte auch, dass die Tumorwachstumsrate der mit Nilotinib behandelten Gruppen und der Positivkontrollgruppe signifikant niedriger war als die der Blindkontrollgruppe (Abb. 2f). Die immunhistochemische Färbung von SOAT1 in Tumoren nach Verabreichung der Verbindungen zeigte, dass das SOAT1-Protein im Tumorgewebe von Mäusen signifikant niedriger war als das der Kontrollgruppe (Abb. 2g). Diese Ergebnisse bestätigten nicht nur, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, das Wachstum von hepatozellulärem Karzinom signifikant hemmen können, sondern deuteten auch darauf hin, dass sie möglicherweise klinisches Potenzial als neue Behandlung für hepatozelluläres Karzinom haben könnten.

Bei vielen Tumorpatienten sind die Cholesterinsynthese und -aufnahme deutlich hochreguliert, wobei es zu einer erheblichen Anhäufung von Cholesterinderivaten wie Cholesterinester und oxidiertem Cholesterin kommt [22]. Allerdings ist der zugrunde liegende molekulare Mechanismus des Cholesterinstoffwechsels in Leberkrebszellen noch nicht vollständig verstanden. Hier führten wir eine Proteomanalyse der Leberkrebszelllinie HepG2 durch, die mit SOAT1-zielenden Verbindungen behandelt wurde, und versuchten, den Zusammenhang zwischen der Regulierung der Cholesterinhomöostase und Tumoren sowie die Rolle der regulatorischen Proteine ​​der Cholesterinhomöostase bei der Tumorentstehung und -entwicklung zu klären. Um einen umfassenden Überblick über das Proteom in Leberkrebszellen nach der Behandlung mit SOAT1-zielenden Verbindungen zu erhalten, untersuchten wir gleichzeitig HepG2-Zellen, die 12 Stunden lang mit Nevanimibe und Nilotinib behandelt wurden, um Proteinveränderungen mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/ MS) und 0,1 % DMSO wurden als Kontrolle verwendet (n = 3) (Abbildung S3a). Im Allgemeinen waren die Daten aller Gruppen mit einer biologischen Wiederholungsrate von > 95 % sehr gut wiederholbar und der Korrelationskoeffizient aller Proben betrug > 85 % (Abbildung S3b). Insgesamt wurden 3960 Proteine ​​aus 7307 identifizierten Proteinen quantifiziert (Abbildung S3c, voller Proteomdaten, dargestellt in separater Zusatzdatei 3). Nach der Korrektur mehrerer Tests durch Festlegen des P-Werts auf 0,01, der Falscherkennungsrate (FDR) auf 0,05 und einer Faltungsänderung > 2 wurden 226 differenzielle Proteine ​​(180 herunterregulierte und 48 hochregulierte) gleichzeitig im Proteom von zwei Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, fehlreguliert ( Abb. 3a und Abbildung S3d). Anschließend haben wir alle unterschiedlich exprimierten Proteine ​​der Gene Ontology (GO)-Anreicherung und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathway-Annotation unterzogen. GO- und KEGG-Analysen zeigten, dass die fehlregulierten Proteine ​​mit Steroid-Stoffwechselprozessen oder Cholesterin-Stoffwechselprozessen zusammenhängen und dass die entsprechenden molekularen Funktionen auch eng mit der Aktivität des Steroltransporters, der Lipidtransferaktivität, der Cholesterinbindung und der Cholesterintransferaktivität zusammenhängen (Abb. 3b). . Diese Ergebnisse zeigten, dass die am stärksten fehlregulierten Proteine ​​im Allgemeinen mit dem Cholesterinstoffwechsel zusammenhängen. Weitere Untersuchungen zu Signalwegproteinen des Cholesterinstoffwechsels ergaben, dass sich 29 mit dem Cholesterinstoffwechsel in Zusammenhang stehende Proteine ​​nach der Behandlung mit SOAT1-zielenden Verbindungen signifikant veränderten (Tabelle S2). Die Klassifizierung und Analyse dieser Differenzproteine ​​zeigte, dass die meisten mit der Cholesterinsynthese zusammenhängenden Proteine ​​im Signalweg des Cholesterinstoffwechsels, wie Phosphomevalonatkinase (PMVK), Lanosterin-14-alpha-Demethylase (CYP51A1), 7-Dehydrocholesterinreduktase (DHCR7) und Lanosterin Synthase (LSS) und Squalenmonooxygenase (SQLE) wurden deutlich herunterreguliert. Darüber hinaus wurden auch Cholesterintransport- und Veresterungsproteine, darunter NPC1, SOAT1, Phospholipidtransferprotein (PLTP) und neutrale Cholesterinesterhydrolase 1 (NCEH1), signifikant herunterreguliert. Im Gegensatz dazu sind Proteine, die mit der Cholesterinumwandlung in Zusammenhang stehen, wie Sterol-26-Hydroxylase (CYP27A1), Steroid-17-alpha-Hydroxylase/17,20-Lyase (CYP17A), Mitglied der Aldo-Keto-Reduktase-Familie 1 (D1AKR1D1) und Translokatorprotein (TSPO). ), waren deutlich hochreguliert (Abb. 3c). Cholesterinsynthese, Veresterung, Transport (einschließlich Aufnahme und Ausfluss) und Umwandlung sind die wichtigsten biologischen Prozesse, die die Stabilität des Cholesterinstoffwechsels aufrechterhalten [23]. Zahlreiche frühere klinische und präklinische Studien haben gezeigt, dass eine erfolgreiche Behandlung von Tumoren durch Eingriffe in den Cholesterinstoffwechsel von Tumorzellen und Immunzellen erreicht werden kann [24]. Unsere proteomische Analyse zeigte, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, nicht nur die Produktion von Cholesterinestern blockieren, sondern auch die Synthese und Aufnahme von Cholesterin hemmen und die Umwandlung von Cholesterin in Gallensäuren vorantreiben. Somit stellten SOAT1-Targeting-Verbindungen den Cholesterinstoffwechsel in Tumorzellen systematisch wieder her (Abb. 3d).

Veränderungen der Proteine ​​des Cholesterinstoffwechselwegs nach medikamentöser Behandlung. a Proteomische Daten wurden durch Vulkandiagramme analysiert, wobei die x-Achse den log2 (FC) (Probe/Kontrolle) und die y-Achse den − log10 P-Wert darstellt. Rote Punkte zeigen deutlich unterschiedliche Proteine ​​an, die durch SOAT1-Zielverbindungen reguliert werden; Graue, blaue und grüne Punkte weisen auf bedeutungslose Proteine ​​oder schlechte qualitative Daten hin. Bedeutende Proteine ​​sind durch Kästchen gekennzeichnet. b Die Genontologie (GO) analysiert den biologischen Prozess, die zelluläre Komponente und die molekulare Funktion der fehlregulierten Proteine. P-Werte wurden mit dem Benjamini-Hochberg (BH)-Algorithmus korrigiert und signifikante Aufrufe wurden auf der Grundlage eines BH-angepassten P-Werts < 0,01 durchgeführt. c Die Cluster-Heatmap der fehlregulierten Cholesterinstoffwechselproteine ​​nach der Behandlung mit SOAT1-zielgerichteten Verbindungen. d Biologische Einblicke in die Neuprogrammierung des Cholesterinstoffwechsels nach der Behandlung mit SOAT1-zielgerichteten Verbindungen. Der Veränderungswert jedes Proteins wird als Log-Verhältnis dargestellt (Fachänderung, ausgedrückt als Log2 (Verhältnis der durchschnittlichen Proteinhäufigkeit in den proteomischen Ergebnissen jeder Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe)). Rechteckige Farbbalken zeigen hoch- und herunterregulierte Proteine ​​an

Um den Zusammenhang zwischen Cholesterinstoffwechsel und Tumoren weiter zu klären, haben wir Untersuchungen zum Zellfettstoffwechsel durchgeführt. Ähnlich wie in unserem Proteomik-Experiment behandelten wir HepG2-Zellen gleichzeitig 12 Stunden lang mit zwei SOAT1-Targeting-Verbindungen, Nevanimibe und Nilotinib, und 0,1 % DMSO wurde als Kontrolle verwendet (n = 6). Die zuvor beschriebene MTBE-Methode (Methyl-tert-butylether) wurde verwendet, um Lipidmetaboliten aus Tumorzellen zu extrahieren [25]. Diese extrahierten Metaboliten wurden dann zur Analyse an LC-MS/MS übergeben (Abbildung S4a). Die Ergebnisse der Pearson-Korrelationsanalyse wurden in einer Korrelations-Heatmap visualisiert, die die Parallelität der biologischen Duplikation der einzelnen Probendaten darstellte (Abbildung S4b). Insgesamt wurden 1890 Verbindungen aus 19.671 identifizierten MS/MS-Spektren quantifiziert und 662 Metaboliten klassifiziert (Abbildung S4c, voll von Metabolomdaten, dargestellt in separater Zusatzdatei 4). Nach der Korrektur mehrerer Tests durch Festlegen des P-Werts auf 0,01 wurden im Metabolom von Nevanimibe und Nilotinib eine Falscherkennungsrate (FDR) von 0,05 und eine fache Änderung von > 2410 differenziellen Metaboliten (239 herunterreguliert und 171 hochreguliert) nachgewiesen (Abb. 4a und Abb S4d). Um unterschiedliche Veränderungen der Metaboliten im Zusammenhang mit den Cholesterinstoffwechselwegen genauer zu identifizieren, führten wir außerdem eine gezielte Metabolomanalyse unter Verwendung von Metabolitenstandards durch. Als Ergebnis stellten wir fest, dass sich 26 Metaboliten des Cholesterinstoffwechselwegs nach der Verabreichung veränderten (Tabelle S3). Die Heatmap-Clusteranalyse zeigte, dass Hydroxysterin, Gallensäure und Sterolhormonverbindungen deutlich hochreguliert waren, während Vorsterin und Cholesterinester deutlich herunterreguliert waren (Abb. 4b). Insbesondere waren Hydroxysterin, Gallensäuren und Steroidhormon-Metaboliten wie 20-α, 22-β-Dihydroxycholesterin, 24-Hydroxycholesterin, Lithocholsäure und Pregnenolon signifikant erhöht, während Prästerin- und Cholesterinester-Metaboliten wie Lanosterin signifikant erhöht waren , 4,4-Dimethyl-5-α-cholesta-8, 14-Demethyllanosterol, 18:0-Cholesterinester und 20:0-Cholesterinester wurden signifikant reduziert (Abb. 4c). Diese Ergebnisse bestätigten außerdem, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, die Synthese, Veresterung und den Transport von Cholesterin hemmen und die Cholesterinumwandlung fördern können.

Veränderungen der Cholesterinsynthesevorläufer und Stoffwechselderivate nach medikamentöser Behandlung. a Die Metabolomdaten wurden durch Vulkandiagramme analysiert, wobei die x-Achse den log2 (FC) (Probe/Kontrolle) und die y-Achse den − log10 P-Wert darstellt. Rote Punkte zeigen deutlich unterschiedliche Metaboliten an, die durch die auf SOAT1 gerichtete Verbindung reguliert werden. Graue, blaue und grüne Punkte weisen auf bedeutungslose Proteine ​​oder schlechte qualitative Daten hin. b Veränderungen der Cholesterinmetaboliten in hepatozellulären Karzinomzelllinien nach Behandlung mit SOAT1-zielgerichteten Verbindungen. Der Veränderungswert jedes Metaboliten wird als Log-Verhältnis (fache Änderung, ausgedrückt als log2 (Verhältnis der Metabolitenhäufigkeit in jeder Behandlungsproteomik gegenüber der Kontrollgruppe)) dargestellt (P < 0,01). c Repräsentative Metabolitenveränderungen im Signalweg des Cholesterinstoffwechsels nach Behandlung mit SOAT1-zielgerichteten Verbindungen (n = 6). Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SD. Die P-Werte wurden durch den zweiseitigen Log-Rank-Test berechnet

Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass die Programmierung des Cholesterinstoffwechsels mit einem erhöhten Rückfallrisiko und einer höheren Sterblichkeitsrate bei Leberkrebspatienten verbunden ist [26]. Um den Zusammenhang zwischen den Proteinen des Cholesterinstoffwechselwegs, die von den identifizierten SOAT1-Zielverbindungen beeinflusst werden, und dem Überleben von Leberkrebspatienten zu untersuchen, haben wir im Rahmen des Chinese Human Proteome Project (CNHPP) retrospektiv die Proteomdaten klinischer Leberkrebspatienten verglichen und analysiert. (http://liver.cnhpp.ncpsb.org/), Transkriptomdaten von TCGA-Leberkrebspatienten (https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas) und unsere Proteomdaten in dieser Studie generiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die oben genannten Proteine ​​des Cholesterinstoffwechselwegs, die durch Verbindungen reguliert werden, die auf SOAT1 abzielen, im Gegensatz zu den autologen Proteomdaten und Transkriptomdaten von Leberkrebspatienten exprimiert werden, was darauf hindeutet, dass die Regulierung des Cholesterinstoffwechsels bei Leberkrebspatienten nach der Behandlung mit umgekehrt und wiederhergestellt würde Auf SOAT1 gerichtete Medikamente (Abb. 5a). Anschließend analysierten wir die Überlebens-Follow-up-Informationen dieser Patienten (siehe separate Zusatzdatei 5) und stellten fest, dass diese regulatorischen Proteine ​​des Cholesterinstoffwechsels tatsächlich mit dem Überleben von Leberkrebspatienten zusammenhängen. Die hohe Expression von Proteinen, die mit der Cholesterinsynthese und der Cholesterinveresterung in Zusammenhang stehen, ist nicht förderlich für das Überleben von Leberkrebspatienten, während die hohe Expression von Proteinen, die mit der Cholesterinumwandlung in Zusammenhang stehen, dem Überleben von Leberkrebspatienten förderlich ist (Abb. 5b und). Abbildung S5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass auf SOAT1 gerichtete Verbindungen den Cholesterinstoffwechsel wiederherstellen und eine vielversprechende Behandlung zur Verbesserung des Überlebens von Leberkrebspatienten darstellen.

Assoziationsanalyse der Arzneimittelproteomik und klinischer Daten von Leberkrebspatienten. a Vergleichende Analyse des Arzneimittelproteoms und des Proteoms des klinischen Leberkrebspatienten sowie der Transkriptomdaten des Leberkrebspatienten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA). b Die Beziehung zwischen medikamentenregulierten Cholesterin-Dysregulationsproteinen und dem Überleben von Leberkrebspatienten

Eine frühere Studie zeigte, dass die Hemmung der Cholesterinveresterung in T-Zellen durch genetische Ablation oder pharmakologische Hemmung von SOAT1 die CD8+-T-Zell-Antitumorreaktion bei Mäusen signifikant verbesserte [10, 11]. Der Anstieg des Cholesterinspiegels in der Plasmamembran von CD8+-T-Zellen führt zur Akkumulation von T-Zell-Rezeptoren und einer verstärkten Signalübertragung sowie einer effektiveren Bildung von Immunsynapsen [27]. Um die Beziehung zwischen SOAT1-Inhibitoren und Immunzellpopulationen und deren Auswirkungen auf Tumore besser zu verstehen, verwendeten wir mehrfarbige Durchflusszytometrie, um Veränderungen in Immunzellpopulationen nach Verabreichung von SOAT1-zielenden Verbindungen in einem murinen Hepa1-6-Zell-Xenotransplantatmodell zu erkennen. Wir transplantierten Hepa1-6-Zellen in immunkompetente Mäuse (C57BL/6 J), um ein neues Tumor-Xenotransplantat-Analysemodell zu erstellen. Nach einer 4-wöchigen Behandlung mit Nilotinib und dem positiven Kontrollmedikament Sorafenib in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag (n = 6) wurden die Tumoren geerntet und die Veränderungen der Immunzellpopulation analysiert. Wie in Abb. 6a und S6a gezeigt, hatten die gegen SOAT1 gerichteten Verbindungen in Tumor-Xenotransplantat-Modellmäusen mit Immunität eine signifikante Tumorsuppressorwirkung. Selbst zwei Wochen nach der Verabreichung war die Größe des Tumors zurückgegangen. Unmittelbar danach entfernen wir diese Tumore und führen eine mehrfarbige Durchflusszytometrieanalyse gemäß der zuvor beschriebenen Methode durch [28, 29]. Zur Markierung der verschiedenen Typen wurden CD45-APC/cy7, CD11b-APC, CD19b-FITC, CD3-BV510, F4/80-PE, Ly6G-Alexa fluor 700, CD8-PerPC/cy5.5 und CD49-BV421 verwendet Zellen. Den experimentellen Ergebnissen zufolge veränderte sich die Verteilung der Tumorzellpopulationen bei Mäusen nach der Verabreichung deutlich (Abb. 6b). Insbesondere war nach der medikamentösen Behandlung der Prozentsatz der mit CD3+ + CD8+ markierten Zellen und der mit CD11b+ + Ly6G+ markierten Zellen in der Gesamtzahl der mit CD45 markierten Leukozytenzellen signifikant erhöht, während der Prozentsatz der mit CD3+ + CD49+ markierten Zellen und der mit CD11+ + F4/80+ markierten Zellen signifikant anstieg relativ reduziert (Abb. 6c, d). Insbesondere stieg im Vergleich zu einem früheren Bericht [10] nicht nur der Anteil der CD3+ + CD8+ markierten T-Zellen, sondern auch der CD11b+ + Ly6G+ markierten Neutrophilen in Tumorgeweben von Mäusen, die mit Nilotinib und Sorafenib behandelt wurden, signifikant an (Abb. 6e, f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die von uns identifizierten SOAT1-Targeting-Verbindungen auch in der Lage sind, die Antitumorwirkung von Immunzellen zu verstärken.

Überprüfung der In-vitro- und In-vivo-Aktivität der identifizierten Verbindungen. a Tumorwachstumskurve von Tumor-Xenotransplantaten in C57BL/6 J-Mäusen, die an den angegebenen Tagen mit Nilotinib (20 mg/kg/Tag), Sorafenib (20 mg/kg/Tag) und Kontrollen behandelt wurden (n = 6 Mäuse pro Gruppe). Der Kreis, das Dreieck und das Kästchen geben das durchschnittliche Tumorvolumen (± SEM) an, und die P-Werte wurden durch den zweiseitigen Log-Rank-Test berechnet. b Gating basierend auf Zelltypen, die mit verschiedenen Durchflusszytometrie-Antikörpern markiert sind. SSC-A bedeutet Zellgranularität, CD45-markierte Leukozyten, CD3+ und CD8+ markierte zytotoxische T-Zellen, CD3+ und CD49+ markierte NK-Zellen, CD11b+ und F4/80+ markierte Makrophagen, CD11b+ und Ly6G+ markierte Neutrophile. c, d Zytokinproduktion von stimulierten Tumor-Xenotransplantat-Maus-CD8+-, CD49+-, F4/80+- und Ly6G+-Zellen, vorbehandelt mit Nilotinib, Sorafenib oder DMSO (n = 6). e, f Mittlerer SD-Relativmengenprozentsatz von CD3+ + CD8+-, CD3+ + CD49+-, CD11b+ + F4/80+- und CD11b+ + Ly6G+-Zellen, vorbehandelt mit Nilotinib, Sorafenib oder DMSO (n = 6). Die P-Werte wurden durch den zweiseitigen Log-Rank-Test berechnet

Frühere Studien haben berichtet, dass Cholesterin und seine Metaboliten eine wichtige Rolle bei Krebs spielen [30, 31]. Aktuelle präklinische Studien haben gezeigt, dass die Blockierung der Cholesterinsynthese und -aufnahme eine hemmende Wirkung auf die Tumorbildung und das Tumorwachstum hat [32]. In dieser Studie haben wir eine Hochdurchsatz-Screening-Technologie basierend auf Zielprotein-Ligand-Wechselwirkungen durch die Integration von virtuellem Screening und Affinitäts-Screening-Technologie etabliert. Drei Verbindungen, Nilotinib, ABT-737 und Evacetrapib, zeigten eine optimale Bindung mit SOAT1. Nilotinib zeigte insbesondere eine hohe Affinität zum SOAT1-Protein und hemmte die Tumoraktivität sowohl in vitro als auch in vivo deutlich, was sein klinisches Potenzial bei der Behandlung von Leberkrebs unterstreicht. Proteom- und Stoffwechselstudien zeigten, dass Verbindungen, die auf das SOAT1-Protein abzielen, nicht nur direkt die Umwandlung von Cholesterin in Cholesterinester blockieren, indem sie die Aktivität des SOAT1-Proteins hemmen, sondern auch den Cholesterinstoffwechsel neu programmieren. Genauer gesagt wird die Cholesterinsynthese gehemmt, der Transport (einschließlich Aufnahme und Ausfluss) blockiert und die Umwandlung aktiviert (Derivatisierung für Gallensäure, Hydroxycholesterin und Sterolhormone). Verschiedene Studien haben bestätigt, dass Veränderungen dieser Substanzen eine hemmende Wirkung auf Tumorzellen haben, einschließlich einer Verbesserung der Immunmikroumgebung, wie T-Zellen und Neutrophile (Abb. 7). Es wurde auch berichtet, dass die Veränderungen in diesen Proteinen des Cholesterinstoffwechsel-Signalwegs tatsächlich mit dem Überleben von Leberkrebspatienten zusammenhängen. Im Allgemeinen haben wir nicht nur eine Hochdurchsatz-Screening-Technologie basierend auf dem SOAT1-Protein etabliert und zunächst zwei vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von Leberkrebs erhalten, sondern auch systematisch gezeigt, dass auf SOAT1 abzielende Verbindungen den Cholesterinstoffwechsel umprogrammieren, um hepatozelluläres Karzinom zu heilen.

Antitumormechanismus von SOAT1-Targeting-Verbindungen. Verbindungen, die auf das SOAT1-Protein abzielen, programmieren den Cholesterinstoffwechsel des Tumors neu, indem sie insbesondere die Produktion von Cholesterinester blockieren, die Cholesterinsynthese und den Cholesterintransport hemmen und die Umwandlung aktivieren. Diese Verbindungen stärken gleichzeitig auch die Immunzellen, um das Tumorwachstum zu hemmen

Das Screening von Antitumormedikamenten, die auf die Programmierung des Cholesterinstoffwechsels abzielen, ist ein beliebtes Forschungsgebiet, und einige Zielmedikamente werden derzeit in die klinische oder präklinische Forschung gefördert [3, 4]. Mehrere Medikamente, wie HMGCR, MVK, LDLR und FDPS, haben in der Medikamentenentwicklung erhebliche Fortschritte gemacht, die meisten Medikamente befinden sich jedoch noch in der klinischen oder präklinischen Forschungsphase [33, 34]. Daher ist die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele, die zu wirksamen und verträglichen neuartigen Medikamenten für Patienten mit fortgeschrittenem hepatozellulärem Karzinom entwickelt werden können, eine langfristige, kontinuierliche Arbeit [35, 36]. In dieser Studie haben wir ein zielbasiertes Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening auf Basis des SOAT1-Proteins etabliert, das virtuelles Screening und integrierte Affinitätsscreening-Technologie nutzt. Durch die Anwendung dieser Strategie ist es uns nicht nur gelungen, SOAT1-Proteinliganden aus Zehntausenden von Verbindungen zu identifizieren (Abb. 1). Wir haben Nilotinib als auf SOAT1 zielende Verbindungen identifiziert und durch verschiedene Experimente weiter gezeigt, dass diese Verbindungen eine hohe Affinität zum SOAT1-Protein aufweisen und die Tumoraktivität in vitro und in vivo signifikant hemmen (Abb. 2). Unsere Forschung hat nicht nur eine schnelle und effiziente Zielprotein-Ligand-Screening-Technologie etabliert, sondern auch wirksame Medikamentenkandidaten für die gezielte Therapie des hepatozellulären Karzinoms erhalten. Diese Studie lieferte neue Erkenntnisse für die präzise Behandlung des hepatozellulären Karzinoms.

Die metabolische Neuprogrammierung von Tumorzellen gilt als eines der zehn Merkmale von Tumoren, und es wurde gezeigt, dass die metabolische Neuprogrammierung von Cholesterinzellen in Tumorzellen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielt (37). Der zugrunde liegende Mechanismus der Neuprogrammierung des Cholesterinstoffwechsels in Tumorzellen und Medikamente, die auf die Neuprogrammierung des Cholesterinstoffwechsels in Tumoren abzielen, sind jedoch noch unbekannt [26, 38]. In dieser Studie verwendeten wir Proteomik und integrierte Metabolomikanalyse, um die Auswirkungen von SOAT1-Targeting-Verbindungen auf die Signalwege des Cholesterinstoffwechsels in Tumorzellen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, nicht nur die Cholesterinveresterung direkt hemmten, sondern auch die Cholesterinsynthese und den Cholesterintransport hemmten und die Cholesterinumwandlung förderten (Abb. 3 und 4). Darüber hinaus zeigte eine kombinierte Analyse mit den Omics klinischer Patienten, dass die Aktivierung oder Hemmung spezifischer Cholesterinproteine ​​eng mit dem Überleben von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom zusammenhängt und dass auf SOAT1 abzielende Medikamente das Überleben der Patienten positiv verbessern würden (Abb. 5). Diese Ergebnisse zeigten systematisch den internen Zusammenhang zwischen der Programmierung des Cholesterinstoffwechsels und Tumoren; Insbesondere reduzieren SOAT1-gerichtete Medikamente die Synthese, Veresterung und den Transport von Cholesterin in Tumorzellen. Es hat sich gezeigt, dass die Verbesserung der Cholesterinumwandlung in Tumorzellen das Wachstum von Tumorzellen hemmt.

Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Cholesterinesterase-Inhibitoren auch die Antitumorwirkung menschlicher chimärer Antigenrezeptor-modifizierter T-Zellen verstärken können [39]. Diese Studien weisen darauf hin, dass der Cholesterinstoffwechsel auch eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Antitumorfunktion der Immunzellen spielt. In dieser Studie führten wir einen mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Immunoassay in einem immunkompetenten Maus-CDX-Modell durch und stellten fest, dass die relative Menge an CD8+-T-Zellen und Neutrophilen bei Mäusen mit Tumoren nach der Behandlung mit zwei SOAT1-Targeting-Verbindungen signifikant erhöht war. Darüber hinaus wurde nach der Behandlung mit zwei SOAT1-zielenden Verbindungen nicht nur das Tumorwachstum bei Mäusen gehemmt, sondern auch die Tumorgröße verringerte sich nach zweiwöchiger Dosierung (Abb. 6). Diese Studien bestätigten, dass der Cholesterinstoffwechsel eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Antitumorfunktionen von Immunzellen spielen könnte.

Zusammenfassend haben wir Nilotinib untersucht, einen hochaffinen Liganden, der auf das potenzielle Antitumorziel SOAT1 abzielt. Im Vergleich zu bekannten Inhibitoren weist es eine höhere Affinität zu SOAT1 und eine bessere Hemmwirkung auf. Noch wichtiger ist, dass Nilotinib als derzeit klinisch eingesetztes Medikament eine bessere Antitumorwirkung entfalten kann, indem es gleichzeitig auf Tumorzellen und die Immunmikroumgebung abzielt, indem es den intrazellulären Cholesterinstoffwechsel von Tumorzellen neu programmiert und CD8+-T-Zellen und Neutrophile verstärkt. Es wird erwartet, dass es zur gezielten Therapie und kombinierten Immuntherapie bei Patienten mit hepatozellulärem SOAT1-Karzinom eingesetzt wird.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Von Zellen abgeleitetes Xenotransplantat

Dulbeccos modifizierte Eagle's-Medien

Elektrospray-Ionisation

Fetales Kälberserum

Gen-Ontologie

3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase

Halbmaximale Hemmkonzentration

Gleichgewichtsdissoziationskonstante

Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome

Flüssigchromatographie-Massenspektrometer

Leber-X-Rezeptor

Methyl-tert-butylether

NPC intrazellulärer Cholesterintransporter 1

Propidiumiodid

Sterol-O-Acyltransferase 1

Goossens P, Rodriguez-Vita J, Etzerodt A, Masse M, Rastoin O, Gouirand V, Ulas T, Papantonopoulou O, Van Eck M, Auphan-Anezin N, et al. Der Cholesterinausfluss in der Membran treibt die tumorassoziierte Neuprogrammierung von Makrophagen und das Fortschreiten des Tumors voran. Zellmetabolismus 2019;29(6):1376–89 (e1374).

Artikel CAS Google Scholar

Riscal R, Skuli N, Simon MC. Sogar Krebszellen achten auf ihren Cholesterinspiegel! Mol Zelle. 2019;76(2):220–31.

Artikel CAS Google Scholar

Huang B, Song BL, Xu C. Cholesterinstoffwechsel bei Krebs: Mechanismen und therapeutische Möglichkeiten. Nat Metab. 2020;2(2):132–41.

Artikel Google Scholar

Zhang H, Zhao W, Li X, He Y. Cholesterinstoffwechsel als potenzielles therapeutisches Ziel und prognostischer Biomarker für die Krebsimmuntherapie. Onco zielt auf Ther. 2021;14:3803–12.

Artikel Google Scholar

Yarmolinsky J, Bull CJ, Vincent EE, Robinson J, Walther A, Smith GD, Lewis SJ, Relton CL, Martin RM. Zusammenhang zwischen genetisch bedingter Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und epithelialem Eierstockkrebs. JAMA. 2020;323(7):646–55.

Artikel CAS Google Scholar

Leiter SA, Shi WQ, Yang EJ, Nacev BA, Hong SY, Pasunooti KK, Li RJ, Shim JS, Liu JO. Das gleichzeitige Targeting von NPC1 und VDAC1 durch Itraconazol führt zu einer synergistischen Hemmung der mTOR-Signalübertragung und Angiogenese. ACS Chem Biol. 2017;12(1):174–82.

Artikel CAS Google Scholar

Wan W, Hou Y, Wang K, Cheng Y, Pu X, Ye X. Die LXR-623-induzierte lange nichtkodierende RNA LINC01125 unterdrückt die Proliferation von Brustkrebszellen über den PTEN/AKT/p53-Signalweg. Zelltod-Dis. 2019;10(3):248.

Artikel Google Scholar

Jiang Y, Sun A, Zhao Y, Ying W, Sun H, Yang X, Xing B, Sun W, Ren L, Hu B, et al. Proteomik identifiziert neue therapeutische Ziele bei hepatozellulärem Karzinom im Frühstadium. Natur. 2019;567(7747):257–61.

Artikel CAS Google Scholar

Yue S, Li J, Lee SY, Lee HJ, Shao T, Song B, Cheng L, Masterson TA, Liu X, Ratliff TL, et al. Die durch PTEN-Verlust und PI3K/AKT-Aktivierung induzierte Anreicherung von Cholesterinester liegt der Aggressivität von menschlichem Prostatakrebs zugrunde. Zellmetabolismus 2014;19(3):393–406.

Artikel CAS Google Scholar

Ma X, Bi E, Lu Y, Su P, Huang C, Liu L, Wang Q, Yang M, Kalady MF, Qian J, et al. Cholesterin induziert eine Erschöpfung der CD8(+)-T-Zellen in der Tumormikroumgebung. Zellmetabolismus 2019;30(1):143–56 (e145).

Artikel CAS Google Scholar

Yang W, Bai Y, Xiong Y, Zhang J, Chen S, Zheng X, Meng X, Li L, Wang J, Xu C, et al. Verstärkung der Antitumorreaktion von CD8(+)-T-Zellen durch Modulation des Cholesterinstoffwechsels. Natur. 2016;531(7596):651–5.

Artikel CAS Google Scholar

Long T, Sun Y, Hassan A, Qi X, Li X. Struktur von Nevanimibe-gebundenem tetramerem menschlichem ACAT1. Natur. 2020;581(7808):339–43.

Artikel CAS Google Scholar

Guan C, Niu Y, Chen SC, Kang Y, Wu JX, Nishi K, Chang CCY, Chang TY, Luo T, Chen L. Strukturelle Einblicke in den Hemmmechanismus der menschlichen Sterol-O-Acyltransferase 1 durch einen kompetitiven Inhibitor. Nat Commun. 2020;11(1):2478.

Artikel CAS Google Scholar

Santos-Martins D, Forli S, Ramos MJ, Olson AJ. AutoDock4(Zn): ein verbessertes AutoDock-Kraftfeld für das Andocken kleiner Moleküle an Zink-Metalloproteine. J Chem Inf-Modell. 2014;54(8):2371–9.

Artikel CAS Google Scholar

Homer RW, Swanson J, Jilek RJ, Hurst T, Clark RD. SYBYL-Liniennotation (SLN): eine einzelne Notation zur Darstellung chemischer Strukturen, Abfragen, Reaktionen und virtueller Bibliotheken. J Chem Inf-Modell. 2008;48(12):2294–307.

Artikel CAS Google Scholar

Halgren TA, Murphy RB, Friesner RA, Beard HS, Frye LL, Pollard WT, Banks JL. Glide: ein neuer Ansatz für schnelles, präzises Andocken und Scoring. 2. Anreicherungsfaktoren beim Datenbank-Screening. J Med Chem. 2004;47(7):1750–9.

Artikel CAS Google Scholar

Schiffrin B, Radford SE, Brockwell DJ, Calabrese AN. PyXlinkViewer: ein flexibles Tool zur Visualisierung von Protein-chemischen Vernetzungsdaten innerhalb des molekularen Grafiksystems PyMOL. Proteinwissenschaft. 2020;29(8):1851–7.

Artikel CAS Google Scholar

Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, Amin N, Schwikowski B, Ideker T. Cytoscape: eine Softwareumgebung für integrierte Modelle biomolekularer Interaktionsnetzwerke. Genomres. 2003;13(11):2498–504.

Artikel CAS Google Scholar

Chen T, Ma J, Liu Y, Chen Z, Xiao N, Lu Y, Fu Y, Yang C, Li M, Wu S, et al. iProX im Jahr 2021: Verbindung des Proteomik-Datenaustauschs mit Big Data. Nukleinsäuren Res. 2022;50(D1):D1522–7.

Artikel CAS Google Scholar

Haug K, Cochrane K, Nainala VC, Williams M, Chang J, Jayaseelan KV, O'Donovan C. MetaboLights: eine Ressource, die sich als Reaktion auf die Bedürfnisse ihrer wissenschaftlichen Gemeinschaft weiterentwickelt. Nukleinsäuren Res. 2020;48(D1):D440–4.

CAS PubMed Google Scholar

Forschungsnetzwerk für den Krebsgenomatlas. Elektronische Adresse wbe, Cancer Genome Atlas Research N: Umfassende und integrative genomische Charakterisierung von hepatozellulärem Karzinom. Zelle. 2017;169(7):1327–41 (e1323).

Artikel Google Scholar

Sharpe LJ, Cook EC, Zelcer N, Brown AJ. Die Höhen und Tiefen der Cholesterinhomöostase. Trends Biochemie Sci. 2014;39(11):527–35.

Artikel CAS Google Scholar

Luo J, Yang H, Song BL. Mechanismen und Regulierung der Cholesterinhomöostase. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(4):225–45.

Artikel CAS Google Scholar

Broadfield LA, Pane AA, Talebi A, Swinnen JV, Fendt SM. Lipidstoffwechsel bei Krebs: Neue Perspektiven und neue Mechanismen. Entwicklerzelle. 2021;56(10):1363–93.

Artikel CAS Google Scholar

Bogl T, Mlynek F, Himmelsbach M, Buchberger W. Vergleich von einphasigen und zweiphasigen Extraktionsmethoden für die Lipidomik von Schweinegewebe unter Verwendung eines schnellen und zuverlässigen Arbeitsablaufs für vorläufige Annotationen. Talanta. 2022;236:122849.

Artikel Google Scholar

Snaebjornsson MT, Janaki-Raman S, Schulze A. Die Räder der Krebsmaschine schmieren: Die Rolle des Lipidstoffwechsels bei Krebs. Zellmetabolismus 2020;31(1):62–76.

Artikel CAS Google Scholar

Zhao L, Liu Y, Zhao F, Jin Y, Feng J, Geng R, Sun J, Kang L, Yu L, Wei Y. Die Hemmung des Cholesterinveresterungsenzyms erhöht die Wirksamkeit menschlicher chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen gegen Pankreaskarzinom. Mol Ther Onkolytika. 2020;16:262–71.

Artikel CAS Google Scholar

Flores-Montero J, Kalina T, Corral-Mateos A, Sanoja-Flores L, Perez-Andres M, Martin-Ayuso M, Sedek L, Rejlova K, Mayado A, Fernandez P, et al. Fluorochrom-Auswahl für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie. J Immunol-Methoden. 2019;475:112618.

Artikel CAS Google Scholar

Almeida AS, Fein MR, Egeblad M. Mehrfarben-Durchflusszytometrie zur umfassenden Analyse des Tumorimmuninfiltrats in einem Mausmodell von Brustkrebs. Bioprotokoll. 2021;11(11):e4012.

Artikel CAS Google Scholar

Sica A, Bleve A, Garassino MC. Membrancholesterin reguliert die Makrophagenplastizität bei Krebs. Zellmetabolismus 2019;29(6):1238–40.

Artikel CAS Google Scholar

Bovenga F, Sabba C, Moschetta A. Entkopplung des Kernrezeptors LXR und des Cholesterinstoffwechsels bei Krebs. Zellmetabolismus 2015;21(4):517–26.

Artikel CAS Google Scholar

Waku T, Hagiwara T, Tamura N, Atsumi Y, Urano Y, Suzuki M, Iwami T, Sato K, Yamamoto M, Noguchi N, et al. NRF3 reguliert die Genexpression im SREBP2-abhängigen Mevalonat-Weg hoch und hemmt die Cholesterinaufnahme und Lipogenese. iScience. 2021;24(10):1

Artikel CAS Google Scholar

Xu H, Zhou S, Tang Q, Xia H, Bi F. Cholesterinstoffwechsel: Neue Funktionen und Therapieansätze bei Krebs. Biochim Biophys Acta Rev Krebs. 2020;1874(1):188394.

Artikel CAS Google Scholar

Gabitova L, Gorin A, Astsaturov I. Molekulare Signalwege: Sterole und Rezeptorsignale bei Krebs. Clin Cancer Res. 2014;20(1):28–34.

Artikel CAS Google Scholar

Qian H, Wu X, Du X, Yao X, Zhao Zelle. 2020;182(1):98–111 (e118).

Artikel CAS Google Scholar

Ikonomopoulou MP, Lopez-Mancheno Y, Novelle MG, Martinez-Una M, Gangoda L, Pal M, Costa-Machado LF, Fernandez-Marcos PJ, Ramm GA, Fernandez-Rojo MA. LXR stimuliert einen Stoffwechselwechsel und zeigt die Cholesterinhomöostase als Statin-Ziel bei der Gesichtstumorerkrankung des Tasmanischen Teufels auf. Cell Rep. 2021;34(11):108851.

Artikel CAS Google Scholar

Hanahan D, Weinberg RA. Kennzeichen von Krebs: die nächste Generation. Zelle. 2011;144(5):646–74.

Artikel CAS Google Scholar

Chan LK, Ho DW, Kam CS, Chiu EY, Lo IL, Yau DT, Cheung ET, Tang CN, Tang VW, Lee TK, et al. RSK2-inaktivierende Mutationen verstärken die MAPK-Signalübertragung und unterstützen den Cholesterinstoffwechsel bei hepatozellulärem Karzinom. J Hepatol. 2021;74(2):360–71.

Artikel CAS Google Scholar

Li M, Yang Y, Wei J, Cun X, Lu Z, Qiu Y, Zhang Z, He Q. Verbesserte Chemoimmuntherapie gegen Melanome durch Hemmung der Cholesterinveresterung in CD8(+) T-Zellen. Nanomedizin. 2018;14(8):2541–50.

Artikel CAS Google Scholar

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Die Autoren danken dem National Center for Protein Sciences (Peking) für die technische Unterstützung bei unserer Proteom- und Metabolomanalyse.

Diese Forschung wurde vom National Key R&D Program of China (Nr. 2020YFE0202200 und 2021YFA1301603), dem Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5–063), der China Postdoctoral Science Foundation (2021MD703973) und The National Natural unterstützt Science Foundation of China (32088101 und 82102804) und Open Project Program des State Key Laboratory of Proteomics (SKLP-K201903).

State Key Laboratory of Proteomics, National Center for Protein Sciences (Peking), Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Lifeomics, Peking, 102206, China

Zhihua Wang, Mengxin Zhang, Kaikun Xu, Xinshuai Zhang, Yi Xie, Yiming Zhang, Cheng Chang, Aihua Sun und Fuchu He

Forschungseinheit für Proteomik Dirven Cancer Precision Medicine, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Peking, 102206, China

Zhihua Wang, Aihua Sun und Fuchu He

Shandong First Medical University, das erste angegliederte Krankenhaus der Shandong First Medical University, Jinan, 250014, China

Miaomiao Wang & Xiaolu Li

Abteilung für Pharmakologie und Pharmazeutische Wissenschaften, Medizinische Fakultät, Tsinghua-Universität, Peking, 100083, China

Yi Xie

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FC.H, AH.S, XL.L und ZH.W. hat die Studie entworfen. ZH.W. führte Experimente durch und erfasste und analysierte Daten. MM.W, MX.Z, HM.K und YM.Z halfen bei Zell- und Tierversuchen. KK.X, YX und XS.Z halfen bei der bioinformatischen Analyse. ZH.W, CC, AH.S und FC.H analysierten und interpretierten die Daten. FC.H, AH.S und XL.L haben zur Fertigstellung der Überarbeitung und Einreichung des Artikels beigetragen. Alle Autoren stimmten dem Inhalt des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Xiaolu Li, Aihua Sun oder Fuchu He.

Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des National Center for Protein Sciences (Peking) genehmigt, Ethische Prüfnummer: IACUC-20210914-32MT.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Zusatzdatei 1.

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Schematische Darstellung des virtuellen Screenings basierend auf SOAT1 sowie der Expression und Reinigung des SOAT1-Proteins. (a) Der Gesamtablauf des virtuellen Screenings basierend auf dem SOAT1-Protein. (b, c, d) SOAT1-Proteinexpressionsvektor-Plasmidkonstruktion und Analyse der Restriktionsenzymverdauung. (e) Größenausschlusschromatographie (SEC)-Reinigung des SOAT1-Proteins. (f) SDS-PAGE-Analyse des SOAT1-Proteins. Die Ergebnisse zeigten, dass sich alle gereinigten SOAT1-Proteine ​​in einem stabilen Dimerzustand mit einer Reinheit von mehr als 95 % befanden. Abbildung S2. Validierung der biologischen Aktivität von Verbindungen, die auf das SOAT1-Protein abzielen. (a) Ein Transwell-Assay zeigte, dass die Zellzahl nach Verabreichung verschiedener SOAT1-Targeting-Verbindungen abnahm (ursprüngliche Vergrößerung 100x). (b) Verbindungen, die auf SOAT1 abzielen, hemmten die Proliferation von Leberkrebszelllinien signifikant. (c) PI-Färbung wurde verwendet, um die Wirkung der Liganden auf den Zellzyklus zu untersuchen: G0/G1-Phase (blauer Peak), S-Phase (gelber Peak) und G2-Phase (grüner Peak). In der G0/G1-Phase akkumulierte Zellen (n = 3). (d) Körpergewicht von nicht aus Zellen stammenden Xenotransplantatmodellen, die an den angegebenen Tagen mit Sorafenib (20 mg/kg/Tag) oder Nilotinib (20 mg/kg/Tag) behandelt wurden (n = 6 Mäuse pro Gruppe). Der Mittelwert (± SD) des Körpergewichts ist aufgetragen. Abbildung S3. Proteomische Probenvorbereitung und Datenanalyse. (a) Arbeitsablauf der Proteomprobenvorbereitung und Datenerfassung. (b) Streudiagramme und Pearson-Korrelationskoeffizienten für die wiederholte Proteomprofilierung von zwei auf SOAT1 gerichteten Verbindungen (Nevanimibe und Nilotinib). Die x- und y-Achsen stellen die Proteinintensitäten in jedem paarweisen Vergleich dar. Bemerkenswert ist, dass wiederholte Experimente mit denselben Proben eine gute Reproduzierbarkeit und ein hohes Maß an Korrelation aufweisen (Durchschnitt > 0,9; Bereich 0,85–1). (c) Abdeckung identifizierter und quantifizierter Proteine. Insgesamt wurden 3.960 Proteine ​​aus 7.307 identifizierten Proteinen quantifiziert. (d) UpSet-Venn-Diagramm jedes paarweisen Vergleichs. 226 differenzielle Proteine ​​(180 herunterregulierte und 48 hochregulierte) waren gleichzeitig im Proteom von Nevanimibe und Nilotinib fehlreguliert (n = 3, p < 0,01). Abbildung S4. Metabolom-Probenvorbereitung und Datenanalyse. (a) Arbeitsablauf der Metabolomprobenvorbereitung und Datenerfassung. (b) Streudiagramme und Pearson-Korrelationskoeffizienten für die wiederholte Metabolomprofilierung von zwei auf SOAT1 gerichteten Verbindungen (Nevanimibe und Nilotinib). Die x- und y-Achsen stellen die Metabolomintensitäten in jedem paarweisen Vergleich dar. Bemerkenswert ist, dass wiederholte Experimente mit denselben Proben eine gute Reproduzierbarkeit und ein hohes Maß an Korrelation aufweisen (Durchschnitt > 0,9; Bereich 0,85–1). (c) Abdeckung der erkannten Massenspektralpeaks sowie quantitativer und qualitativer Massenspektren. Insgesamt wurden 1890 Verbindungen aus 19.671 identifizierten MS/MS-Spektren quantifiziert und 662 Metaboliten klassifiziert. (d) UpSet-Venn-Diagramm jedes paarweisen Vergleichs. Im Metabolom von Nevanimibe und Nilotinib wurden 410 Differenzialmetaboliten (239 herunterregulierte und 171 hochregulierte) nachgewiesen (n=6, p<0,01). Abbildung S5. Der Zusammenhang zwischen medikamentenregulierten Cholesterin-Dysregulationsproteinen und dem Überleben von Leberkrebspatienten. Abbildung S6. Schematische Darstellung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Analyse. (a) Schematische Darstellung eines Xenotransplantatmodells, das aus Hepa1-6-Zellen stammt, die in C57BL/6-Mäuse transplantiert wurden. (b) Mehrfarbige Durchflusszytometrie-Analyse von aus Zellen stammenden Xenotransplantatmodellen. (c) Histogramm-Overlays zeigen Änderungen in den Expressionsprofilen zwischen den Proben. Die Tabelle zeigt die Gruppen und Zellzahlen. (d) Fluoreszenzkorrelationsanalyse-Heatmap jeder Farbe. Die mit jedem fluoreszierenden Antikörper markierten Zellen sind deutlich zu unterscheiden, was darauf hinweist, dass das Analysesystem robust ist. Tabelle S1. Vier Software-Molecar-Docking-Screenings ergaben 62 potenzielle Verbindungen. Tabelle S2. 29 Proteine ​​des Signalwegs des Cholesterinstoffwechsels veränderten sich nach der Verabreichung. Tabelle S3. Durch das Targeting wurden 26 Metaboliten des Cholesterinstoffwechsel-Signalwegs identifiziert, die sich nach der Verabreichung veränderten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, Z., Wang, M., Zhang, M. et al. Hochaffine SOAT1-Liganden veränderten das Cholesterinstoffwechselprogramm, um das Tumorwachstum zu hemmen. BMC Med 20, 292 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02436-8

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Eingegangen: 07. März 2022

Angenommen: 13. Juni 2022

Veröffentlicht: 09. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02436-8

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