Molekulare und In-vivo-Studien eines Glutamats

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4446 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bei der Verdauung von Gluten entstehen toxische Peptide, darunter ein stark immunogenes prolinreiches 33-mer aus Weizen-α-Gliadin, das Zöliakie auslöst. Bei Neprosin aus der Kannenpflanze handelt es sich um eine beschriebene Prolylendopeptidase. Hier produzieren wir rekombinantes Neprosin und seine Mutanten und stellen fest, dass Neprosin in voller Länge ein Zymogen ist, das bei Magen-pH durch die Freisetzung einer All-β-Prodomäne über einen pH-Schaltermechanismus mit einem Lysin-Pfropfen selbstaktiviert wird . Die katalytische Domäne ist ein atypisches 7+8-strängiges β-Sandwich mit einer erweiterten Spalte im aktiven Zentrum, die ein beispielloses Paar katalytischer Glutamate enthält. Neprosin baut sowohl Gliadin als auch das 33-mer in vitro unter Magenbedingungen effizient ab und wird bei pH > 5 reversibel inaktiviert. Darüber hinaus verringert die gleichzeitige Verabreichung von Gliadin und dem Neprosin-Zymogen im Verhältnis 500:1 die Häufigkeit des 33-mers in den Dünndarm von Mäusen um bis zu 90 %. Neprosin begründet somit eine Familie eukaryotischer Glutamat-Endopeptidasen, die die Voraussetzungen für eine therapeutische Glutenase erfüllt.

Zöliakie (CoD) ist eine chronische autoimmune Enteropathie, die Personen mit genetischer und umweltbedingter Sensibilisierung gegenüber Nahrungsgluten betrifft, einer Gruppe von Prolaminspeicherproteinen aus Getreide, die reich an Prolin und Glutamin sind1,2. Zu den Prolaminen, die Kabeljau auslösen, gehören Gliadin und Glutenin in Weizen, Hordein in Gerste und Secalin in Roggen. Bereits etwa 10 mg Gluten in der Nahrung pro Tag können zu Darmschäden führen3, was weniger als 0,1 % der Menge entspricht, die in einer typischen westlichen Ernährung enthalten ist2. Kabeljau ist in allen Altersgruppen eine globale Gesundheitsbelastung mit einer weltweiten serologischen Prävalenz von 1,4 %4, die jedes Jahr um 7,5 % zunimmt5. Die Krankheit wird durch teilweise abgebaute Glutenpeptide verursacht, darunter ein 33 Reste umfassendes Fragment des Weizen-α-Gliadins (33-mer), das immunogen am relevantesten ist2,6. Diese Peptide widerstehen aufgrund ihres hohen Prolingehalts (13 im 33-mer) einer weiteren Spaltung durch Peptidasen der Bürstensaummembran des Magens, der Bauchspeicheldrüse und des Darms. Bei Zöliakie-Betroffenen durchqueren sie das Schleimhautepithel des Dünndarms, wo die Glutaminreste durch Gewebetransglutaminase desamidiert werden. Dies erhöht die Affinität der Peptide für die DQ2.5/DQ2.2- und DQ8-Allele des humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Rezeptors, die für die Entwicklung von CoD2 notwendig sind. Die Rezeptorbindung löst eine schwere proinflammatorische Autoimmunreaktion aus, die durch T-Zellen vermittelt wird und Auswirkungen auf den Darm hat, einschließlich intraepithelialer Lymphozytose, Krypta-Hyperplasie, Atrophie der Dünndarmzotten und Schleimhautentzündung2. Diese führen zu einer chronischen Malabsorption von Nährstoffen, Durchfall, Erbrechen, Blähungen, Bauchschmerzen und Darmlymphomen. Zu den extraintestinalen Manifestationen gehören verzögerte Pubertät, Osteoporose, axonale Neuropathie und Kleinhirnataxie7, die die Lebenserwartung von Zöliakiekranken verringern. Es gibt keine Behandlung für CoD, daher müssen Patienten ein Leben lang eine streng glutenfreie Diät einhalten, die die normale Architektur der Darmzotten wiederherstellt2. Glutenfreie Diäten bieten jedoch keine ausgewogene Ernährung7 und viele Zöliakiekranke leiden trotz Einhaltung solcher Ernährungseinschränkungen unter Darmbeschwerden8,9. Darüber hinaus ist Gluten in den meisten verarbeiteten Lebensmitteln und Medikamenten enthalten, was die Einhaltung der Ernährungsgewohnheiten in westlichen Gesellschaften zu einer Herausforderung macht2. Dies hat zu einer Nachfrage nach wirksamen CoD-Therapien geführt.

Ein vielversprechender Ansatz ist die Entwicklung von Endopeptidasen, die die toxischen Peptide spalten und so als echte Glutenasen für die orale Enzymtherapie fungieren10,11,12, ähnlich wie Laktasetabletten bei Laktoseintoleranz13. Ein solcher Ansatz würde auch Patienten zugute kommen, die unter einer nicht-zöliakiebedingten Glutenunverträglichkeit leiden, deren Prävalenz weltweit bis zu 13 % beträgt, und unter dem Reizdarmsyndrom mit einer Prävalenz von <0,5 %8,14,15. Ein Glutenase-Kandidat muss bestimmte Kriterien für die klinische Anwendung erfüllen. Erstens sollte es während der Verdauung im Magen wirken, bevor der Magenbolus in den Zwölffingerdarm gelangt und die Autoimmunreaktion auslöst, und muss daher im sauren Magenmilieu (pH ~2,5) stabil und aktiv bleiben sowie Magenpepsin widerstehen. Zweitens sollte eine angemessene Dosis Gliadin und das 33-mer in Kombination mit Pepsin unter Magenbedingungen effizient verdauen, was die Verarbeitung großer Mengen an Nahrungsprotein erfordert. Drittens sollte es die Darmstrukturen nicht schädigen oder die Nährstoffaufnahme hemmen und sollte daher idealerweise bei dem leicht sauren postprandialen pH-Wert des Zwölffingerdarms inaktiv sein16.

Das therapeutische Potenzial mehrerer Glutaminyl- und Prolylendopeptidasen (PEPs) wurde bewertet, die verschiedene katalytische Klassen und verschiedene Quellen repräsentieren, darunter Bakterien, Pilze, Insekten und keimendes Getreide7,10,11,12. Dazu gehört ein Serin-PEP aus Aspergillus niger10,17; STAN1, eine Kombination aus A. niger-Aspartat-Aspergillopepsin und Aspergillus oryzae-Serin-Dipeptidyl-Peptidase IV18; Latiglutenase, eine Kombination aus einer Glutamin-spezifischen Cysteinpeptidase aus Gerste und einer modifizierten Serinprolyl-spezifischen Oligopeptidase aus Sphingomonas capsulata19; Serin-Endopeptidasen vom Subtilisin-Typ aus den natürlichen oralen Kolonisatoren Rothia aeria und Rothia mucilaginosa11; und die synthetischen Enzyme KumaMax und Kuma062/TAK-062, die durch die rechnerische Neugestaltung von Kumamolysin, einer Serin-Endopeptidase aus dem Bakterium Alicyclobacillus sendaiensis20, entwickelt wurden. Allerdings erfüllt keiner dieser Kandidaten alle oben genannten Anforderungen. Die aktuellen Spitzenreiter zeigen unter Magen-pH-Bedingungen keine hohe Aktivität und/oder erfordern sehr hohe Dosen oder schützende Modifikationen wie PEGylierung oder Mikroverkapselung. Dementsprechend haben klinische Studien noch keine signifikante klinische Remission bei Zöliakiekranken erzielt und die Fähigkeit dieser Enzyme, eine glutenfreie Ernährung zu ersetzen, nicht nachgewiesen12. Schlimmer noch, viele sogenannte Enzympräparate, die derzeit als CoD-Nahrungsergänzungsmittel rezeptfrei verkauft werden, inaktivieren die giftigen Glutenpeptide nicht und stellen somit eine Gefahr für Zöliakiekranke dar21.

Neprosin ist eine Endopeptidase mit 380 Resten unbekannter Klasse und unbekanntem Mechanismus, die derzeit in der MEROPS-Datenbank (www.ebi.ac.uk/merops22) der Familie U74 zugeordnet wird. Es handelt sich um ein PEP, das in der Verdauungsflüssigkeit der fleischfressenden Pflanze Nepenthes × ventrata entdeckt wurde, die Beutetiere in ihrem Krug fängt23,24,25,26. Das Enzym könnte eine Funktion im Proteinstoffwechsel während der Verdauung und/oder Verteidigung der Beute haben23. In Kombination mit anderen Peptidasen aus der Verdauungsflüssigkeit wurde es als Teil eines potenziellen Glutenase-Präparats identifiziert24. Gereinigtes Neprosin gilt auch als nützliches Reagens für die Proteomik25,26.

Hier etablieren wir ein humanes rekombinantes Produktionssystem, um hohe Ausbeuten an Neprosin zu produzieren. Wir bestimmen seinen Aktivierungsmechanismus in vitro sowie seine thermische Stabilität, sein pH-Profil, seine allgemeinen proteolytischen und peptidolytischen Aktivitäten und seine Anfälligkeit gegenüber einer Reihe von Peptidaseinhibitoren. Wir testen auch die Spaltung von Gliadin und dem 33-mer in vitro, um die Fähigkeit von Neprosin zu bewerten, als Solo-Glutenase zu fungieren. Darüber hinaus bewerten wir die Wirkung von rekombinantem Neprosin auf die Verarbeitung von Gliadin in Mäusen. Abschließend berichten wir über die Kristallstruktur des Neprosin-Zymogens und seiner reifen Form in produktnachahmenden Komplexen. Diese Daten enthüllen den Latenzmechanismus, die Gesamtarchitektur und die Architektur des aktiven Zentrums, den katalytischen Mechanismus und die Peptidaseklasse, die durch eine Kohorte von Mutanten validiert wurden.

Frühere Studien zu Neprosin verwendeten hauptsächlich das aus Kannenpflanzenflüssigkeit gereinigte Enzym, da die heterologe Expression in Escherichia coli nur ein teilweise unreines Enzym mit mäßiger Ausbeute produzierte24,25. Da wir diesen Ansatz nicht reproduzieren konnten, haben wir ein System entwickelt, das auf menschlichen Zellen basiert und davon ausgeht, dass eine eukaryotische posttranslationale Verarbeitung erforderlich ist. Dies ergab etwa 10 mg/L reines, gut gefaltetes Protein voller Länge mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag (His6) (41 kDa) oder etwa 8 mg/L mit einem Doppelstreptavidin-Tag (Strep) (43 kDa) ( Abb. 1a, b). Das Protein war ordnungsgemäß gefaltet und blieb mehrere Wochen lang bei 4 °C in einem neutralen Puffer stabil, hatte jedoch keine proteolytische Aktivität, was wir darauf zurückführten, dass es sich bei dem Volllängenprotein um das Pro-Neprosin-Zymogen handelte. Tatsächlich durchlief es im Laufe der Zeit bei Inkubation in einem stark sauren Puffer problemlos eine autolytische Reifung an der Bindung P128–S129 (Restnummerierung von Neprosin hochgestellt; UniProt-ID C0HLV2), was die katalytische Neprosindomäne (CD) und die herausgeschnittene Prodomäne (PD) ergab ) (Abb. 1e). Letzteres wurde schließlich abgebaut und sowohl Pro-Neprosin als auch Neprosin wanderten bei der Überprüfung durch kalibrierte Größenausschlusschromatographie (SEC) als Monomere (Abb. 1d).

a Reinigung von Wildtyp (WT) Pro-Neprosin durch His6- oder (b) Strep-Tag-Affinitätschromatographie. Die Durchfluss- (FT), Wasch- (W) und Elutionsfraktionen (E1–E3) wurden durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung zusammen mit Molekularmassenmarkern (Spur M) analysiert. Die Panels sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. c Pro-Neprosin-Mutanten (K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q und E297A) nach His6-Tag-Affinitätsreinigung im Vergleich zu den WT-Formen von (a) und (b). Abbildung repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. d Größenausschlusschromatographieprofile von Pro-Neprosin mit His6-Tag (magenta), Neprosin mit Strep-Tag (grün) und Neprosin mit His6-Tag (blau), getrennt auf einer Superdex 75 10/300 GL-Säule. Jede Kurve ist mit dem Elutionsvolumen in ml beschriftet, das in allen Fällen Monomere darstellt. e Autolytische Reifung von Pro-Neprosin über die Zeit bei 37 °C in einem sauren Puffer. Abbildung repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. f Aktivierung von Pro-Neprosin-Varianten (Z-Spuren) durch saure Autolyse (A-Spuren) oder in trans durch Zugabe von Strep-markiertem Neprosin (S-Spuren). Die Mutante K118A (dritte Tafel) wurde nach Affinitätsreinigung als voraktiviertes Protein erhalten und zeigte getrennte PD- und reife Proteinbanden (Spur Z), die durch Inkubation in einem sauren Puffer vollständig aktiviert wurden (Spur A). Abbildung repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Für die einzelnen Abschnitte dieser Abbildung werden relevante Quelldaten, sofern angemessen, als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Differentialscanning-Fluorimetrie unter Verwendung des Thermofluor-Ansatzes27 ergab eine mittlere Übergangstemperatur (Tm) von 68 °C für das reife Enzym (Abb. 2a), was für eine Peptidase, die in einem Umgebungstemperaturbereich arbeitet, bemerkenswert ist und eher an hyperthermophile Enzyme erinnert28 . Darüber hinaus war die Tm des Zymogens um 9 °C höher (Abb. 2a), was darauf hindeutet, dass die PD die Stabilität und möglicherweise die korrekte Faltung des Volllängenproteins fördert, wie für andere Zymogene berichtet29. Dies wurde dadurch gestützt, dass wir nicht in der Lage waren, reifes Neprosin (ohne PD) mit demselben Expressionssystem zu exprimieren. Schließlich zeigten Thermofluorstudien in Gegenwart eines Reduktionsmittels einen sich entfaltenden Prozess mit zwei Übergängen, von denen der erste bei 42–44 °C stattfand (Abb. 2b). Dies deutete auf die Existenz von Disulfidbindungen hin, die das Protein stabilisieren, wie weiter unten ausführlicher erläutert wird.

a Differentialscanning-Fluorimetrie, die doppelte Kurven der temperaturabhängigen Fluoreszenzschwankung während der thermischen Denaturierung von Neprosin (dunkelrot) und Pro-Neprosin (grün) zeigt. Die mittleren Übergangstemperaturen (Tm) sind die durchschnittlichen Wendepunkte der beiden jeweiligen Kurven. b Wie (a) und veranschaulicht die Wirkung von TCEP als Reduktionsmittel bei 5 mM (rot) und 10 mM (grün) im Vergleich zu unbehandeltem Pro-Neprosin (blau). c Die pH-abhängige Aktivität von Pepsin (rot), Trypsin (grün) und Neprosin (blau) auf einem fluoreszierenden BSA-Substrat. Für Neprosin sind die Daten Mittelwerte ± SD (n = 3 unabhängige Experimente). Die Werte für Trypsin und Pepsin wurden einmal gemessen. d, e Kinetik der Neprosin-vermittelten Spaltung der fluorogenen Peptide (d) FS6 (100 nM Neprosin) und (e) FS6-QPQL (25 nM Neprosin). Die Einschübe zeigen die entsprechenden Vmax-, kcat-, KM- und kcat/KM-Werte. f Peptidolytische Aktivität von Wildtyp (WT) Neprosin und Mutanten auf dem fluorogenen FS6-QPQL-Peptid. Statistische Signifikanz bestimmt durch zweiseitigen Student-t-Test (*p < 0,1; **p < 0,05; ***p < 0,001). Für die sieben Balken mit *** betrugen die p-Werte von links nach rechts 0,0052, 0,0050, 0,0036, 0,0036, 0,0029, 0,0033 und 0,0034. g Logo, das die Substratpräferenz von Neprosin basierend auf einer erneuten Analyse der hinterlegten Daten darstellt25. h Wirkung der Testmoleküle oder -mischungen (1) 1,10-Phenathrolin, (2) AEBSF, (3) Phosphoramidon, (4) Marimastat, (5) cOmplete, (6) BGP, (7) Captopril, (8) DAN, (9) BEOPC, (10) AMP, (11) Pepstatin A und (12) EPNP im Vergleich zur WT-Kontrolle (C). Nur die letzten beiden Verbindungen erzielen eine signifikante Hemmung. Statistische Signifikanz bestimmt durch zweiseitigen Student-t-Test (*p < 0,1; **p < 0,05; ***p < 0,001). Für die beiden Balken mit ** und * betrugen die p-Werte 0,0215 bzw. 0,0698. i Diagramm der Hemmwirkung von Pepstatin A (links) und EPNP (rechts), das die Testerkonzentrationen mit den abgeleiteten IC50-Werten zeigt. Für die Panels d–f, h und i sind die Daten Mittelwerte ± SD (n = 3 unabhängige Experimente) und relevante Quelldaten werden, sofern angemessen, als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir untersuchten den Einfluss des pH-Werts auf die Spaltung von fluoreszierendem Rinderserumalbumin (BSA) durch Neprosin und verwendeten zum Vergleich Magenpepsin, eine Aspartatpeptidase, und Pankreastrypsin, eine Serinpeptidase (Abb. 2c). Das pH-Optimum von Neprosin lag bei 3, nahe dem von Magenpepsin (pH < 2). Im Gegensatz dazu lag das pH-Optimum von Trypsin bei 8, einem Wert, bei dem sowohl Neprosin als auch Pepsin völlig inaktiv waren. Pepsin wurde bei neutralem pH-Wert irreversibel gehemmt, wie bereits berichtet30, wohingegen Neprosin durch Umschalten zwischen pH 2,5 und 9,0 reversibel aktiviert und inaktiviert wurde. Darüber hinaus blieb Neprosin durch Einfrieren oder Gefriertrocknung bei pH 7,5 zur Lagerung unbeeinträchtigt und erlangte somit nach dem Auftauen bzw. Resuspendieren in einem sauren Puffer seine volle Aktivität zurück. Schließlich war Neprosin bei saurem pH-Wert unempfindlich gegenüber der Spaltung durch Pepsin. Dieses Aktivitäts-, Effizienz-, Stabilitäts- und Robustheitsprofil stimmte daher mit einem Verdauungsenzym überein, das über längere Zeiträume unter unterschiedlichen Bedingungen arbeiten muss, genau der natürlichen Umgebung in den Kannen fleischfressender Pflanzen31.

Um weitere Einblicke in die Substratspezifität von Neprosin zu gewinnen und unsere Spaltungstests zu leiten, analysierten wir veröffentlichte Proteomikdaten erneut, die hauptsächlich auf gereinigtem Material basierten und das Enzym als echtes PEP25 identifiziert hatten. Wir fanden 3001 eindeutige Spaltungsstellen, die sich über P6–P6′ erstreckten (Substrat- und Subsite-Nomenklatur für das aktive Zentrum basierend auf 32, 33), von denen 1863 (62 %) einen Prolinrest in P1 aufwiesen (Abb. 2g). Prolin war bei P2 und P3′ ebenfalls um das Doppelte seiner natürlichen Häufigkeit angereichert, war jedoch bei P1′ und P2′ stark benachteiligt. Glutamat und Methionin wurden bei P2′ um das Dreifache angereichert, Alanin wurde in P6–P6′ problemlos akzeptiert und Glycin wurde bei P1–P3′ deutlich benachteiligt. Diese Daten zeigten eine starke Präferenz für Substrate mit Prolin an P1 und dass bestimmte Positionen innerhalb von P6–P6′ für bestimmte Aminosäuren ungeeignet waren (Abb. 2g).

Wir untersuchten die Fähigkeit von Neprosin, Gliadin in Gegenwart und Abwesenheit von Pepsin durch SDS-PAGE und Turbidimetrie im Vergleich zu Pepsin allein zu verdauen (Abb. 3a, b). Beide Enzyme bauten Gliadin getrennt bei Konzentrationen unter ~5 μM, dem physiologischen Schwellenwert von Pepsin34, effizient ab, optimale Ergebnisse wurden jedoch erzielt, wenn beide Enzyme kombiniert wurden. Bemerkenswerterweise war die optimale Konzentration von Neprosin der von Magenpepsin ähnlich und um Größenordnungen niedriger als die, die für aktuelle Glutenase-Kandidaten erforderlich ist. Zymographie zeigte, dass Neprosin Gliadin und Gelatine, ebenfalls ein Nahrungsprotein, mit ähnlicher Effizienz abbaute (Abb. 3d, e).

eine SDS-PAGE-Analyse von Gliadin, das steigenden Konzentrationen von Pepsin (links), Neprosin (Mitte) oder Neprosin plus Pepsin (rechts) ausgesetzt wurde. Abbildung repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. b Kurven, die die Gliadinspaltung wie in (a) über die Zeit darstellen, gemessen durch Turbidimetrie. c Massenspektren des 33-mer-Peptids (3912 Da) von oben nach unten; das 33-mer-Peptid nach Inkubation mit 0,5 μM Neprosin für 0 Minuten, 20 Minuten und über Nacht; Neprosin allein; und das 33-mer-Peptid nach Inkubation über Nacht mit 10 μM Pepsin, wodurch das Peptid intakt bleibt. d Gliadin-Zymogramm, das die Aktivität von Neprosin (linke Spur) und das reife Enzym, das aus der Selbstaktivierung von Pro-Neprosin resultiert (rechte Spur), darstellt. e Wie (d), jedoch mit Gelatine-Zymographie. f Sequenz des 33-mers und Ausmaß der sechs überlappenden HLA-DQ2.5-bindenden Epitope, hervorgehoben durch rote Doppelpfeile7. Glutamine, die einer Desamidierung durch Transglutaminase unterliegen, sind in violetten Kreisen dargestellt11. Das Peptid entspricht dem Segment L76–F108 von α-Gliadin (UniProt ID P18573). g Die Spaltung des 33-mer-Peptids durch Neprosin verläuft im Laufe der Zeit nach zwei Wegen (oben und unten). Für die einzelnen Abschnitte dieser Abbildung werden relevante Quelldaten, sofern angemessen, als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir die Spaltung des 33-mers, das drei durch Transglutaminase desamidierte Glutaminreste und sechs überlappende immunogene HLA-DQ2.5-T-Zell-Epitope6,11,35 umfasst, mittels Massenspektrometrie (Abb. 3f). Wir fanden heraus, dass Peptid bei 250 μM nach 20 Minuten bei pH 3 durch 0,5 μM Neprosin, einem Verhältnis von 500:1, effizient abgebaut wurde (Abb. 3c). Selbst nach Inkubation über Nacht wurden keine autolytischen Spaltprodukte nachgewiesen, was die Stabilität des reifen Enzyms unter sauren Bedingungen bestätigte. Im Gegensatz dazu konnte Pepsin das Peptid selbst nach Inkubation über Nacht bei einer 20-fach höheren Konzentration als Neprosin nicht spalten, was die Resistenz des 33-mer gegen Verdauungspeptidasen bestätigte. Die Analyse der durch Neprosin erzeugten Peptidspaltungsfragmente ergab zwei Endprodukte: Q–L–P–Y–P–Q–P (843 Da) und L–Q–L–Q–P–F–P–Q–P ( 1068 Da). Durch die Überwachung der Reaktion über die Zeit (Abb. 3g) stellten wir fest, dass die Spaltung nur unmittelbar stromabwärts von fünf spezifischen Prolinresten unter den 13 im 33-mer vorhandenen erfolgte, vorzugsweise bei P-Q-P*Q-L-P und immer mit P-Q-P an den P1-P3-Unterstellen, was die einfache Spezifität für Prolin an P1 qualifiziert, die aus der wahllosen Proteomik abgeleitet wurde, und im Einklang mit der Benachteiligung großer hydrophober Reste (Leucin, Phenylalanin und Tyrosin) in P2 steht, wie oben diskutiert25. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass das 33-mer an mehreren Stellen mit dem Q-P*Q-L-Motiv abgebaut wird. Bemerkenswerterweise finden sich in BSA auch zwei P-Q-Dipeptide sowie fünf gleichermaßen bevorzugte P-E-Stellen (siehe oben), was erklärt, warum Albumin bei niedrigem pH-Wert ein geeignetes Substrat für Neprosin ist.

Schließlich testeten wir die Spaltung einer Kohorte fluorogener Peptide. Wir fanden heraus, dass das Peptid FS6, das eine P-L-Bindung (Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2) enthält und ein Substrat von Matrixmetalloproteinasen und Adamalysinen36 ist, mit mäßiger Effizienz gespalten wurde kinetische Analyse (kcat/KM = 765 M−1s−1; Abb. 2d). Im Gegensatz dazu wurde die Peptidvariante FS6-QPQL, die so umgestaltet wurde, dass sie die Neprosin-Spaltstelle des 33-mers (Mca–Q–P–Q–L–Dpa–A–R–NH2) enthält, hauptsächlich 30-fach effizienter gespalten aufgrund des kcat-Anstiegs (kcat/KM = 23.880 M−1s−1; Abb. 2e). Dementsprechend kann Neprosin als ein PEP mit einer eingeschränkteren Spezifität als P-X definiert werden, das das 33-mer unter magenähnlichen Bedingungen effizient abbaut.

Angesichts der unbekannten katalytischen Klasse des Enzyms testeten wir als nächstes eine Reihe von Peptidaseinhibitoren auf ihre Fähigkeit, die FS6-QPQL-Spaltung durch Neprosin zu blockieren (Abb. 2h). Wir folgten auch einem kürzlich angewandten Ansatz, um Inhibitoren der Pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase37 zu finden, deren Produkt Prolin ist, und testeten eine Reihe von prolinhaltigen/imitierenden Verbindungen. Wir fanden heraus, dass nur Pepstatin A und 2-[(4-Nitrophenoxy)methyl]oxiran (EPNP) Neprosin schwach, aber signifikant hemmten (Abb. 2h), mit Werten der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von 140 bzw. 480 μM ( Abb. 2i). Angesichts der Tatsache, dass Pepstatin und EPNP-ähnliche Epoxide Inhibitoren von Aspartat-Endopeptidasen vom Pepsin-Typ sind38,39, die keine Sequenzähnlichkeit mit Neprosin aufweisen, deutete dies auf einen unerwarteten Peptidasetyp und Katalysemechanismus für Neprosin hin.

Um die Aktivität von Neprosin in vivo zu untersuchen, wurde Mäusen 5 Minuten nach der Verabreichung des Zymogens in einem sehr geringen Massenverhältnis (1:500 w/w) oder des Vehikels ein Bolus Gliadin verabreicht. Nach 2,5 Stunden haben wir den Inhalt von drei oberen Abschnitten des Gastrointestinaltrakts geerntet und die Konzentration des 33-mers durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay gemessen (Abb. 4). Das Peptid war in allen Segmenten der behandelten Tiere wesentlich weniger häufig (61–91 %) und insgesamt um 71 %. Das inaktive Zymogen wird daher beim Erreichen des Magens aktiviert und hilft effizient beim Abbau von Gliadin (und insbesondere des 33-mers) in vivo, während es gleichzeitig resistent gegen physiologische Verdauungsenzyme bleibt. Dies geschieht in viel geringeren Konzentrationen als bei Glutenasenkandidaten und ohne Schutzstrategien wie PEGylierung oder Mikroverkapselung. Diese Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie überein, in der berichtet wurde, dass sensibilisierte NOD/DQ8-Mäuse einen signifikanten Rückgang der Entzündungsmarker zeigten, wenn sie mit Gliadin gefüttert wurden, das mit Pepsin und Nepenthes-Krugflüssigkeit vorverdaut wurde, die unter anderem Neprosin und Nepenthesin enthielt24.

Menge an 33-mer (μg) im Gesamtinhalt des Magens (S), des proximalen Dünndarms (pSI) und des distalen Dünndarms (dSI) von Mäusen, die vor einem Bolus Neprosin-Zymogen (N) oder Vehikel (V) erhielten Gliadin. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM (n = 8 Tiere pro Gruppe). Die statistische Signifikanz wurde durch einen einseitigen F-Test (*p < 0,05, N vs. B) bestimmt. Die p-Werte betrugen 0,048 (S), 0,049 (pSI), 0,026 (dSI) und 0,021 (Gesamt). Relevante Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir kristallisierten Pro-Neprosin in einer orthorhombischen Raumgruppe (Abb. 5a und Ergänzungstabelle 1) und stellten fest, dass das Polypeptid an der physiologischen Reifungsstelle (P128 – S129) gespalten wurde. Die Kristalle enthielten daher den zymogenen Komplex des gespaltenen PD und des CD (Abb. 5a). Wir haben die Struktur durch anomale Beugung bei einer Wellenlänge gelöst und dabei Daten bei der Lutetium-LIII-Absorptionskantenwellenlänge von einem in Lu-Xo440 getränkten Kristall gesammelt (Abb. 5b). Dieses Einweichen führte im Vergleich zu nativen Kristallen zu erheblichen Abweichungen in einer der Kristallzellachsen, während gleichzeitig eine gute Beugung der Röntgenstrahlen erhalten blieb (Ergänzungstabelle 1). Das endgültige verfeinerte Modell des Derivatkomplexes wurde verwendet, um die native Pro-Neprosin-Struktur durch molekularen Ersatz zu lösen. Darüber hinaus erzeugte reifes Neprosin zwei verschiedene monokline Kristallformen, I und II (Abb. 5a und Ergänzungstabelle 1), deren Strukturen ebenfalls durch molekularen Ersatz gelöst wurden.

a Orthorhombische Kristalle von Pro-Neprosin (linkes Bild) enthielten einen Komplex aus der gespaltenen PD (p) und dem CD (e) (Bild Mitte links). Reife Enzymkristalle waren monoklin (Mitte rechts, Kristallform I; rechtes Feld, Kristallform II). Das Experiment des mittleren linken Panels wurde einmal durchgeführt. b Die Struktur von Pro-Neprosin wurde mithilfe eines Lutetium-Derivats gelöst. An einer Stelle (linkes Bild) war das Lu3+-Kation (grüne Kugel) durch zwei Carboxylat-Sauerstoffatome plus fünf Stickstoffatome aus dem organischen Gerüst und die Carboxylat-Sauerstoffatome des Proteinrests E89 in Abständen von 2,40–2,65 Å nona-koordiniert. Endgültige Fourier-Karte vom Typ (2mFobs-DFcalc) der Ableitung, konturiert bei 1,3 σ (rechtes Feld). c Banddiagramm von Pro-Neprosin in frontaler (linkes Bild) und seitlicher (rechtes Bild) Perspektive. Die PD ist goldfarben mit magentafarbenen Helices. Das ausgereifte Enzym wird im Lachs nachgewiesen. Ungeordnete/gespaltene Segmente werden durch graue gestrichelte Linien angezeigt. Die beiden Glykosylierungsstellen bei N145 und N152, die sieben Cysteine ​​A60 und die beiden katalytischen Glutamate (E188 und E297) werden anhand ihrer Seitenketten dargestellt und markiert. Die endgültige Fourier-Karte um die beiden Glykanketten ist bei 0,6 σ abgebildet. d Topologie von Pro-Neprosin mit Strängen als Pfeile (beschriftet mit β1–β22) und den beiden kurzen Helices (α1 und α2) als magentafarbene Stäbchen. Die terminalen Reste jedes Sekundärstrukturelements sind angegeben. Das PD hat gelbe Stränge und magentafarbene Helices, die vordere Schicht der reifen Enzymeinheit ist orange und die hintere Schicht ist braun. Die sieben Cysteine ​​sind weiterhin grün dargestellt, die Glykane sind als grüne Rauten dargestellt. Die katalytischen Glutamate sind als Referenz markiert. e Die obere Reihe zeigt die Vorderansicht von Pro-Neprosin wie in (c) (links) und die Rückansicht (rechts), wobei beide die PD als gelbes Band und die Coulomb-Oberfläche der CD (rot, –10 kcal/mol) darstellen ·e; blau, +10 kcal/mol·e) berechnet mit Chimera85. Der berechnete pI der reifen Enzymkomponente beträgt 4,3. Die untere Reihe zeigt dasselbe, außer dass hier die PD als Coulomb-Oberfläche (pI = 9,5) und die CD als Lachsband dargestellt ist.

Pro-Neprosin ist ein kompaktes längliches Molekül von ~55 × ~45 × ~40 Å (Abb. 5c). Die N-terminale PD (R25–P128) ist in der endgültigen Fourier-Karte ab A29 definiert und weist einen globulären Teil (A29–G112) auf, gefolgt von einem Linker (L113–P128) zur nachgeschalteten CD (S129–Q380). Das Segment (N122–N131), das die gespaltene Reifungsstelle umfasst, ist flexibel. Die PD verfügt über ein antiparalleles dreisträngiges β-Faltblatt, in dem der zentrale Strang durch die Einfügung des am weitesten links liegenden Strangs halbiert wird (Abb. 5c, d). Die beiden rechten Stränge sind durch ein langes Segment an der Oberseite verbunden, das zwei kurze α-Helices, eine Disulfidbindung (C52–C98) und ein ungeordnetes Segment mit zehn Resten (Y77–N86) an der Rückseite des Moleküls umfasst. Letzteres resultiert wahrscheinlich aus der hervorstehenden Glykankette, die in einem hinteren Strang der CD an N152 gebunden ist (Abb. 5c). Ein zweites Glykan ist über eine Crossover-Schleife oben auf der CD an N145 gebunden. Hinter dem letzten Strang der PD durchläuft die Kette eine 90°-Drehung und tritt in den PD/CD-Linker ein, der in ausgedehnter Konformation entlang der Vorderseite der CD verläuft.

Untypisch für Peptidasen, bei denen es sich im Allgemeinen um α/β-Proteine ​​handelt41, handelt es sich bei der CD um ein antiparalleles β-Sandwich mit einer siebensträngigen, stark gekräuselten Vorderschicht und einer achtsträngigen Rückschicht, die ein Gerüst für erstere bildet (Abb. 5c, d). Beide Schichten sind durch neun Kreuzungsschleifen miteinander verbunden, darunter die lange Haarnadel β12β13 und zwei weitere Disulfidbindungen (C219–C224 und C358–C379) auf beiden Seiten des Sandwichs (Abb. 5d). Alle diese Elemente tragen zu einer kompakten und robusten Struktur bei, was die bemerkenswerte pH-Stabilität von Neprosin und seine Fähigkeit, der Pepsinverdauung zu widerstehen, erklärt. Im Gegensatz dazu sind die Disulfidbindungen nicht tief in der Struktur vergraben, was ihre Empfindlichkeit gegenüber Reduktionsmitteln erklärt. Die Struktur der reifen Neprosin-Kristallform I (Ergänzungstabelle 1) erwies sich mit einer Kernquadratabweichung (RMSD) von 0,62 Å als praktisch identisch mit dem äquivalenten Teil des Zymogens. Der einzige signifikante Unterschied wurde bei N232–Y233 festgestellt, das im Zymogen nach außen gefaltet ist, um I103 am Anfang des äußersten rechten Strangs der PD aufzunehmen. Kristallform II wiederum war praktisch nicht von Kristallform I (Kern-RMSD = 0,66 Å) zu unterscheiden, mit Ausnahme der Spitze der Schleife Lβ21β22, die einen Abstand von 3,8 Å hatte, und der C-terminalen Markierung, die aufgrund des Kristalls neu ausgerichtet war Verpackung. Somit wird die reife Enzymkomponente im Wesentlichen im Zymogen vorgeformt, wie es bei den meisten Peptidasen der Fall ist, mit der bemerkenswerten Ausnahme der Serinpeptidasen vom Chymotrypsin-Typ42,43,44.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Spalte im aktiven Zentrum durch den PD-Linker (Abb. 6a) abgegrenzt wird, wie er in anderen Zymogenen 42, 44 zu finden ist. Darüber hinaus verlief in den Strukturen der reifen Neprosin-Kristallformen I und II das C-terminale Segment, das ein Alanin-Isoleucin-Alanin-Tripeptid gefolgt vom His6-Tag umfasste, entlang der Oberfläche eines Symmetriepartners und ahmte so einen Produktkomplex nach . Beide Kristallformen waren monoklin, hatten jedoch unterschiedliche Zellkonstanten (Ergänzungstabelle 1), was zu einer variablen Kristallpackung führte. Dennoch dringt die C-terminale Markierung in beiden kristallographischen Anordnungen auf ähnliche Weise in den Spalt ein, ist jedoch um drei Positionen verschoben, sodass H404–H409 aus Kristallform I A401–H406 aus Kristallform II überlappt (Abb. 6b, c). . Dementsprechend würde Neprosin einen erweiterten Spalt im aktiven Zentrum besitzen, der die konkave Seite des Blatts durchquert und um ~ 55 ° schräg zur Richtung der β-Stränge des vorderen Blatts verläuft (Abb. 6a – c).

eine Nahaufnahme von Abb. 5c, die das letzte Segment (L113–P121) der PD zeigt, das in der endgültigen Fourier-Karte als Stabmodell mit gelben Kohlenstoffatomen und schwarzen Restnummern definiert ist, die über die Spalte des aktiven Zentrums verlaufen. Die wahrscheinlichen P1- und P1′–P3′-Reste sind markiert. Darüber hinaus sind ausgewählte Reste des aktiven Zentrums anhand ihrer Seitenketten mit Kohlenstoffatomen in Hellbraun und einer hellblauen Nummerierung dargestellt. Zwei möglicherweise für die Katalyse relevante Lösungsmittelreste sind als grüne Kugeln dargestellt. Der Einschub zeigt eine leicht gedrehte Nahaufnahme, um die Wechselwirkung (magentafarbene Linien) von K118 mit E188, Q173 und einem Lösungsmittelmolekül hervorzuheben. b Wie (a), Darstellung des Produktkomplexes von reifem Neprosin (Kristallform I), mit dem C-terminalen Schwanz eines Symmetriepartners, der A403 und die His6-Tag-Reste (H404–H409) umfasst, als Stabmodell mit Kohlenstoffen in Cyan mit Substrat-Unterstandorten P6–P1. Ein möglicherweise für die Katalyse relevantes Lösungsmittelmolekül (grüne Kugel) verbindet E297 und E188 (magentafarbene Stäbchen). c Gleich wie (b) für Kristallform II. Der C-terminale Schwanz eines Symmetriepartners, der A401 und einen Teil des His6-Tags (H404–H408) umfasst, ist als Stabmodell mit Kohlenstoffen in Pflaume dargestellt und deckt wahrscheinlich die Unterstandorte P6–P1′ ab. Ein möglicherweise für die Katalyse relevantes Lösungsmittelmolekül (grüne Kugel) verbindet E297 und E188 (magentafarbene Stäbchen). Ein zweites Lösungsmittelmolekül (gelber Pfeil) besetzt wahrscheinlich die Position des spaltbaren Carbonylsauerstoffs im Michaelis-Komplex. Die Polypeptidketten beider Kristallformen überlappen bei Überlagerung der jeweiligen CDs für die Tag-Reste H404–H409 (Kristallform I) und A401–H406 (Kristallform II). d Modell des wahrscheinlichen Michaelis-Komplexes zwischen einem Substrat, das die Reste P–Q–P*Q–L–P (grüne Kohlenstoffe) an den Positionen P3–P3′ umfasst, und dem aktiven Zentrum von Neprosin. Ausgewählte Reste werden hinsichtlich ihrer Seitenkette (Pflaumenkohlenstoffe) angezeigt und beschriftet. Das katalytische Lösungsmittel ist als blaugrüne Kugel dargestellt. e Vorgeschlagener chemischer Mechanismus der Substratspaltung durch Neprosin.

Auf der Suche nach möglichen katalytischen Resten ließen wir uns von den funktionsanalogen Asparaginpeptidasen vom Pepsin-Typ inspirieren, die trotz ihrer unterschiedlichen Architektur ebenfalls hauptsächlich β-Proteine ​​sind und bei stark saurem pH-Wert von 45 arbeiten. Darüber hinaus ist von den einzigen (schwachen) Neprosin-Inhibitoren, die wir finden konnten, bekannt, dass sie Aspartatpeptidasen hemmen (siehe oben). Diese Enzyme nutzen zur Katalyse ein Paar Asparaginreste, die durch ein Lösungsmittelmolekül verbrückt sind46. Tatsächlich fanden wir ein auffälliges Paar Glutamatreste (E188 und E297), das durch ein Lösungsmittelmolekül verbrückt wurde, das die gebundenen Peptide in den Produktkomplexen abschnürte (Abb. 6b, c). In der Kristallform II würde ein klar aufgelöstes zweites Lösungsmittelmolekül den spaltbaren Carbonylsauerstoff eines Substrats ersetzen (Abb. 6c). Das Glutamatpaar war in der Zymogenstruktur ähnlich angeordnet, wenn auch etwas weiter voneinander entfernt (Abb. 6a). Wir haben daher E188Q-, E188A-, E297Q- und E297A-Punktmutanten von His6-markiertem Pro-Neprosin zum Testen hergestellt (Abb. 1c). Diese Varianten wurden bei Inkubation bei saurem pH-Wert nicht automatisch aktiviert (Abb. 1f), daher wurde die Aktivierung in trans durch Verwendung katalytischer Mengen von reifem Strep-markiertem Wildtyp-Neprosin ausgelöst. Schließlich erhielten wir gut gefaltete und intakte reife Varianten der E188Q- und E297Q-Mutanten, jedoch nicht E297A oder E188A (Abb. 1f), und diese waren tatsächlich katalytisch inaktiv (Abb. 2f). E188 und E297 könnten daher als katalytische Dyade wirken, was zeigt, dass Neprosin eine Glutamatpeptidase ist, eine katalytische Klasse, die (im Gegensatz zu den Aspartatpeptidasen) nur sehr wenig untersucht wurde47. Dies steht im Einklang mit sehr aktuellen Vorhersagen, die auf bioinformatischen Studien basieren, aber nicht experimentell validiert wurden48. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die reifen Neprosinstrukturen vorgelagerte Produktkomplexe imitieren, die gemeinsam die Unterstellen S6 bis S1′ besetzen (Abb. 6b, c), wobei die beiden katalytischen Glutamate plus das verbrückende Lösungsmittelmolekül zur Reaktion bereit sind. Da sich der PD-Linker über weitere Reste auf der rechten Seite der Spalte im Zymogen erstreckt (Abb. 6a), würden diese Positionen bis zu P3′ entsprechen. Zusammen mit dem zusätzlichen Platz in der Spalte jenseits von S3′ würde Neprosin daher eine erweiterte Spalte aufweisen, die sich wahrscheinlich über bis zu 11 Unterstellen (S6–S5′) erstreckt, was die Notwendigkeit erweiterter Peptide über die spaltbare Bindung hinaus erklärt (siehe oben).

In Abwesenheit eines Substratkomplexes konstruierten wir ein Modell für den Michaelis-Komplex von Neprosin mit dem P-Q-P*Q-L-P-Peptid basierend auf den Zymogen- und Produktkomplex-nachahmenden Strukturen (Abb. 6d). Dieses Modell zeigte weitere Reste in der Nähe der katalytischen Glutamate mit potenziellen Bindungs- oder katalytischen Funktionen. Wir mutierten daher die Reste H134, Y136, Q173, W175 und Y214 (Abb. 6a – d), indem wir sie durch Alanin ersetzten, und reinigten die entsprechenden Proteine ​​(Abb. 1c). Alle Mutanten erforderten eine Aktivierung in trans, wie oben erläutert (Abb. 1f). Die Aktivität von H134A, Y136A und Y214A war etwa 80 % niedriger als die des Wildtyp-Enzyms, wohingegen die Mutanten Q173A und W175A völlig inaktiv waren (Abb. 2f). Wir kommen zu dem Schluss, dass H134, Y136 und Y214 relevant, aber nicht kritisch für die Katalyse sind und möglicherweise eine untergeordnete Rolle im katalytischen Mechanismus spielen, wohingegen Q173 und W175 essentiell sind (siehe unten).

Das PD heftet sich seitlich an die linke Seite des reifen Enzyms, sodass sein zentrales β-Faltblatt um etwa 90° von der Ebene des Vorderblatts weg gedreht ist. Die Interdomänenoberfläche weist bei der Grenzflächenbildung einen solvatisierungsfreien Energiegewinn (ΔiG) von –25,8 kcal/mol49 auf, was auf eine sehr starke Wechselwirkung hinweist. Darüber hinaus verbirgt der Komplex 2176 Å2, was den angegebenen Durchschnittswert von 1910 Å2 für Protein-Protein-Komplexe übersteigt50. Der PD (theoretischer pI = 9,5; Abb. 5e, unten) ist halbmondförmig und umschließt den CD (pI = 4,3; Abb. 5e, oben) unter elektrostatischer Komplementierung eng, was zur Aktivitätsunterdrückung und Zymogenstabilität beiträgt (pI = 5,9). ) bei neutralen oder leicht sauren pH-Werten. Darüber hinaus erklärt die enge zymogene Wechselwirkung die bemerkenswerte Stabilität von Pro-Neprosin in thermischen Verschiebungstests (siehe oben). Abschließend wurde die Bedeutung der PD weiter bewertet, indem die Punktmutante A60R getestet wurde, die die Schnittstelle destabilisieren soll (Abb. 5c, linkes Feld). Diese Mutation verhinderte die Isolierung eines gefalteten Proteins.

Nach der Sekretion in die saure Verdauungsflüssigkeit führt die Protonierung negativ geladener Reste zur Abstoßung positiver Nettoladungen, so dass das Zymogen unter Freisetzung der vorgebildeten reifen Einheit und der Spalte im aktiven Zentrum auseinanderfällt. Die S1-Position der Spalte wird von K118 vom PD-Linker in der Zymogenstruktur besetzt, die bei pH 7,5 erhalten wurde. Dieser Rest bildet eine starke Salzbrücke mit dem katalytischen E188 und eine Wasserstoffbrücke mit Q173Nε2, was wichtig ist (siehe oben und Abb. 6a, Einschub). Wir produzierten und testeten daher die Mutante K118A, die effizient überexprimiert wurde, jedoch eine teilweise autolytische Reifung in einem neutralen Puffer durchlief, Bedingungen, unter denen das Wildtyp-Enzym und andere Mutanten intakt blieben (Abb. 1c). Die anschließende Inkubation bei pH 2,5 vervollständigte den Aktivierungsprozess (Abb. 1f). Wie erwartet war die Aktivität des reifen Mutanten ähnlich der des Wildtyp-Enzyms (Abb. 2f).

Basierend auf dem oben Gesagten schlagen wir vor, dass das K118–E188-Paar über einen Latenzpfropfen verfügt, der durch Befolgen eines pH-Schaltmechanismus geschwächt werden kann, sobald das Zymogen eine saure Umgebung erreicht, sodass der PD-Linker zur Reifungsspaltung herausgezogen wird. Dies erinnert an die verdauungsfördernden Aspartatpeptidasen Pepsin und Gastricsin, die einen Lysinrest aufweisen, der funktionell zu K11843,51 äquivalent ist, und an die lysosomale Peptidase Legumain52. Der pH-Schaltermechanismus und die Tatsache, dass die spaltbare P1′-P1-Peptidbindung von der Y214-Seitenkette umgeben ist, sodass sie nicht gespalten werden kann (Abb. 6a), erklären, warum der Zymogen-Linker in die Richtung binden kann ein Substrat bei neutralem pH-Wert in die Spalte, ohne gespalten zu werden. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Zymogenen, einschließlich verdauungsfördernder Aspartatpeptidasen, bei denen Prosegmente auf nicht-substratähnliche Weise mit den reifen Enzymresten interagieren, um eine vorzeitige Aktivierung zu verhindern42,43,44. Da schließlich die Position der spaltbaren Bindung im Spalt von K118–Q119 besetzt ist, die Reifung jedoch bei P128–S129 erfolgt, erfolgt die Aktivierung wahrscheinlich in trans durch ein zweites Enzymmolekül, sobald der PD-Linker aus dem Spalt freigesetzt wird.

Basierend auf den vorangegangenen Ergebnissen würde der katalytische Spaltungsmechanismus von Neprosin wie folgt ablaufen. Das Lösungsmittel, das die Carboxylate E188 und E297 in den Produktkomplexen überbrückt, würde das katalytische Wasser im Grundzustand darstellen (Abb. 6e, Schritt I). Das Wasser liegt näher an E297, was darauf hindeutet, dass E188 möglicherweise protoniert ist, wie für eines der beiden katalytischen Aspartate in sauren Peptidasen vom Pepsin-Typ berichtet46. E297 wird durch Wasserstoffbrückenbindungen mit H134Nε2 und Y136Oη an Ort und Stelle gehalten, während E188 durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Y214Oη, T186Oγ und Q173Nε1 an Ort und Stelle gehalten wird. Während der Reaktion würde das Substrat in erweiterter Konformation an die Spalte des aktiven Zentrums binden (Abb. 6e, Schritt II), wobei die S3-, S1- und S3′-Unterstellen der Spalte durch Y194, Q192 und F169 geformt werden; Y208, Y206, L171, E188 und Q173; und Y136, W175 bzw. E293, die sich ideal für die Unterbringung von Prolinen eignen (Abb. 6d). Die Hauptkette des Substrats würde durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen seinen Carbonylen und Y220Oη in P3, H134Nε2 in P2 (ermöglicht durch eine 180°-Rotation um χ2 durch Substratbindung) und Y136Oη in P1′ fixiert (Abb. 6d). Durch die Einfügung des Substrats würde sich das katalytische Lösungsmittel weiter in Richtung E297 verschieben, das als allgemeine Base fungieren und ihm ein Proton entziehen würde, um seine Nukleophilie zu erhöhen. Das protonierte E188-Carboxylat wiederum würde den spaltbaren Carbonylsauerstoff binden (Abb. 6d, e). Danach würde das polarisierte Lösungsmittel einen nukleophilen Angriff auf die Si-Fläche des spaltbaren Carbonylkohlenstoffs durchführen, was zu einem tetraedrischen Edelstein-Diolat-Reaktionszwischenprodukt führen würde (Abb. 6e, Schritt III). Letzteres würde durch die unverzichtbaren W175Nε1 und Q173Nε1 in der entscheidenden Rolle eines Oxyanionlochs stabilisiert53. Das Zwischenprodukt würde sich dann durch Aufbrechen der spaltbaren CN-Bindung auflösen. In diesem Stadium würde E297 als allgemeine Säure wirken und den neuen α-Aminostickstoff protonieren (Abb. 6e, Schritt IV). Schließlich würden die beiden Spaltprodukte den Spalt verlassen und das Enzym wäre für eine neue Runde der Katalyse bereit.

Peptidasen wurden ursprünglich fünf mechanistischen Klassen zugeordnet: den Serin-, Cystein-, Threonin-, Aspartat- und metallabhängigen Peptidasen54. Im Jahr 2004 wurde die grundlegende Glutamatpeptidase strukturell charakterisiert, nämlich die Scytalidocarboxylpeptidase B (SCP-B) aus dem Dematiaceenpilz Scytalidium lignicolum55,56,57. Seitdem wurde nur die eng verwandte Aspergilloglutamat-Peptidase (~50 % identisch mit SCP-B) strukturell analysiert58,59 und sieben weitere wurden funktionell bewertet, hauptsächlich aus Pilzen60,61,62,63,64, aber eine aus einem Bakterium65 . Sie werden in der MEROPS-Datenbank der Familie G1 zugeordnet und werden informell als Pepstatin-unempfindliche Pilz-Carboxylpeptidase-Gruppe66 oder Eqolysine55 bezeichnet. Es handelt sich um thermophile und Pepstatin-unempfindliche Enzyme, die unter sauren Bedingungen funktionieren65 und über ein katalytisches Glutamat verfügen, das als lösungsmittelpolarisierende allgemeine Base fungiert, die in SCP-B E190 ist (siehe UniProt ID P15369 für die tiefgestellte Restnummerierung entsprechend der vollständigen Länge). Protein, und subtrahieren Sie 54 für die häufig verwendete Nummerierung reifer Enzyme55,56). Das Glutamat wird durch ein Glutamin (Q107 in SCP-B) unterstützt, daher der Familienname Eqolysine55. Diese Reste sind innerhalb der Familie unveränderlich und werden von sehr ähnlichen Resten flankiert66,67.

Archetypisches SCP-B ist ein 7+7 antiparalleles β-Sandwich, das insgesamt Ähnlichkeit mit dem Neprosin CD aufweist (Abb. 7a). Die Überlagerung von Neprosin und der gebundenen reifen Form von SCP-B (Protein Data Bank [PDB] ID 2IFR56), dessen zymogene Struktur unbekannt ist, ergab 140 ausgerichtete Reste mit einem ziemlich großen Kern-RMSD von 3,0 Å und einer Sequenzidentität von nur 11 %. . Es gibt bemerkenswerte Unterschiede in den Verbindungsschleifen und im aktiven Zentrum, z. B. eine große Disulfid-verknüpfte hervorstehende β-Haarnadel, die in das Pilzenzym eingefügt wird und dem β-Strang folgt, der β16 in Neprosin entspricht (Abb. 7a). Innerhalb des aktiven Zentrums ist der einzige konservierte Rest das katalytische Glutamat (E297 in Neprosin und E190 in SCP-B) sowie die Position des katalytischen Assistenten (E188 in Neprosin und Q107 in SCP-B), was zu Variablen führt Spalten im aktiven Zentrum mit unterschiedlichen Substratbahnen und Oberflächenprofilen (Abb. 7b, c). Darüber hinaus sind die Kreuzmutanten Q107E von SCP-B und E188Q von Neprosin, die die katalytische Dyade des jeweils anderen nachahmen, völlig inaktiv, wie oben diskutiert und in68 berichtet. Dies erklärt die unterschiedlichen Substratspezifitäten, die in SCP-B zur Spaltung von F-F-, L-Y- und F-Y-Bindungen in Insulin führen, nicht jedoch von Prolin-flankierenden Bindungen68.

a Überlagerung der Cα-Spuren von Neprosin (Lachs) und SCP-B (hellblau) in Stereo, wobei die jeweiligen katalytischen Reste als Stäbchen dargestellt und markiert sind (➀, E297/E190 von Neprosin/SCP-B; ➁, E188/ Q107 von Neprosin/SCP-B). Beachten Sie die einzigartige Klappe von SCP-B, die die Spalte im aktiven Zentrum abdeckt (roter Pfeil). Der N-Terminus und der C-Terminus sind angegeben. b Nahaufnahme der Spalte im aktiven Zentrum von Neprosin, dargestellt für seine Connolly-Oberfläche in der Ausrichtung von (a). Die beiden katalytischen Reste sind dargestellt (grüne Flecken). c Das Gleiche wie (b) für SCP-B.

Aktuelle Glutenasen erfüllen nur begrenzt die strengen Kriterien für eine effiziente orale Enzymtherapie gegen CoD. Hier zeigten unsere In-vitro- und In-vivo-Studien, dass rekombinantes Neprosin ein robustes Pepsin-resistentes Enzym ist, das Gliadin und sein 33-mer unter laborsimulierten Magenbedingungen und im Mäusemagen sehr effizient abbaut. Niedrige Dosen des Enzyms ergänzen daher das Magenpepsin während der Verdauung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Q-P*Q-L-Motiv des 33-mer leicht gespalten werden kann, wodurch alle sechs überlappenden immunogenen Epitope entfernt werden, indem Peptide erzeugt werden, die zu klein sind, um die Teilung von Gliadin-spezifischen T-Zellen zu stimulieren69. Die Spaltungseffizienz von Neprosin in vitro unter simulierten Magenbedingungen ist um Größenordnungen höher als die anderer Glutenasen18,20,24,70,71,72. Das Zymogen wird bei neutralem pH-Wert hergestellt, bei dem es stabil bleibt und für Transport und Lagerung lyophilisierbar ist. Erst nach der Aufnahme im Magen wird es aktiviert und spaltet giftige Bestandteile des Glutens. Sobald der Magenbolus in den leicht sauren postprandialen pH-Wert des Zwölffingerdarms gelangt, wird er wieder inaktiv. Neprosin ist daher ein vielversprechender Kandidat für die weitere therapeutische Entwicklung gegen glutenempfindliche Erkrankungen.

Strukturelle und funktionelle Studien, die durch Mutanten und Aktivitätstests gestützt wurden, identifizierten Neprosin als Pepstatin-empfindliches PEP und die einzige Glutamat-Endopeptidase, die in höheren Eukaryoten vorkommt. Es enthält ein bisher unbeschriebenes Paar katalytischer Glutamate, die den Aspartaten der ansonsten nicht verwandten sauren Endopeptidasen vom Pepsin-Typ analog sind. Neprosin wird als Zymogen produziert und ausgeschieden, das nur in seiner stark sauren natürlichen Umgebung, der Verdauungsflüssigkeit der Kannenpflanze, aktiviert wird. Die Reifung folgt einem pH-Schaltmechanismus, der einen Lysin-vermittelten Latenzpfropfen freisetzt.

Schließlich ist Neprosin Pepstatin-empfindlich, teilt aber seine Gesamtfaltung mit den Pepstatin-resistenten Glutamatpeptidasen der Eqolysin-Familie, die eine Glutamat-Glutamin-Dyade besitzen und durch den Archetyp SCP-B repräsentiert werden. Es gibt jedoch Unterschiede in der Größe von PD und CD, der Umgebung des aktiven Zentrums, dem Substratbindungsmodus und der Spezifität sowie dem chemischen Mechanismus der Katalyse. Während Eqolysine auf Pilze und Bakterien beschränkt sind67,73, kommen potenzielle Neprosin-Orthologe mit einer Sequenzidentität von ~35–40 % häufig in Pflanzen vor (und sind auf diese beschränkt), einschließlich glutenhaltiger Nutzpflanzen. Dies deutet darauf hin, dass die Neprosin-Familie möglicherweise von einem SCP-B-Vorfahren durch horizontalen Gentransfer von einem Bakterium oder Pilz auf eine Pflanze stammt, wie zuvor für andere Proteine ​​beschrieben74. Dem Transfer hätte eine divergente Evolution innerhalb des Pflanzenreichs gefolgt, um einen der katalytischen Reste und die Schleifen, die das zentrale β-Sandwich schmücken, so zu modifizieren, dass sie sich an neue Substrate anpassen. In Analogie zu den Eqolysinen könnten die Mitglieder der Neprosin-Familie Eelysine genannt werden.

Ein synthetisches Gen, das für Wildtyp-Neprosin aus Nepenthes × ventrata kodiert und zu 91 % mit dem Orthologen aus Nepenthes alata (UniProt ID A0A1L7NZU4) identisch ist, wurde von GenScript in den Vektor pET-28a(+) eingefügt, um den Vektor pET-28a(+) zu erzeugen )-proNEP (für Plasmide und Primer siehe Ergänzungstabelle 2). Die kodierende Sequenz wurde auf den Vektor pCMV übertragen, um den Vektor pS6-proNEP zu erzeugen. Dies verlieh Ampicillin-Resistenz und fügte einen C-terminalen Hexahistidin-Tag (His6) hinzu. Das kodierte Protein wird hier als Pro-Neprosin beschrieben. Das gleiche Plasmid wurde durch annealtes Oligonukleotidklonieren modifiziert, um (a) den His6-Tag durch einen Zwillings-Strep-Tag (pS6-proNEP-Strep) für die Expression von Pro-Neprosin-Strep zu ersetzen und (b) den PD (pS6) zu entfernen -NEP) für die Expression des Neprosin-CD (S129–Q380) plus des C-terminalen His6-Tags. Das QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) oder die inverse PCR-basierte ortsgerichtete Mutagenese wurden verwendet, um Varianten von pS6-proNEP mit den Punktmutationen A60R, K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q zu erzeugen und E297A. Plasmide wurden mit dem GeneJET Plasmid MaxiPrep Kit (Thermo Fisher Scientific) gereinigt und Konstrukte durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Proteine, die von den Plasmiden pS6-proNEP, pS6-proNEP-Strep und pS6-NEP sowie den 11-Punkt-Mutanten kodiert werden, wurden auf Überexpression in menschlichen Expi293F-Zellen (ThermoFisher Scientific) untersucht, die in einem Multitron-Zellschüttler-Inkubator (Infors HT) gezüchtet wurden. bei 37 °C. Die Zellen wurden mit Plasmid-DNA transfiziert und nach mehreren Tagen zur Proteinreinigung geerntet. Das zellkonditionierte Medium wurde durch Zentrifugation geklärt und mit Imidazol ergänzt, mit Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Harz (Invitrogen) inkubiert, einer Batch-Affinitätschromatographie-Reinigung (AC) unterzogen und ausgiebig mit Puffer, der 20 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Proteine ​​wurden mit dem gleichen Puffer, der 300 mM Imidazol enthielt, eluiert. Für Pro-Neprosin-Strep wurde das Ni-NTA-Harz durch Strep-Tactin XT Superflow-Suspensionsharz (IBA Life Sciences) ersetzt und die Proteine ​​wurden in Puffer mit 50 mM d-Biotin (VWR Life Science) eluiert. Fraktionen, die das Protein enthielten, wurden gepoolt und vor der Größenausschlusschromatographie (SEC) in einer Superdex 75 10/300 GL-Säule (GE Healthcare) konzentriert, die an ein ÄKTA Purifier-Flüssigkeitschromatographiesystem (GE Healthcare) angeschlossen war.

Die Proteine ​​wurden durch Ultrazentrifugation in Vivaspin-Filtergeräten (Sartorius Stedim Biotech) konzentriert. Ungefähre Proteinkonzentrationen wurden durch Messung der Absorption bei 280 nm (A280) mit einem BioDrop-DUO Micro Volume (Biochrom) und Anwendung der entsprechenden theoretischen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Darüber hinaus wurde die Proteinreinheit durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und anschließende Färbung mit Coomassie (Thermo Fisher Scientific) bewertet. Die Proteinidentität wurde durch Peptid-Massen-Fingerprinting und N-terminale Edman-Sequenzierung am Protein Chemistry Service bzw. der Proteomics Facility des Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid, Spanien) bestimmt. Schließlich wurde reifes Wildtyp-Neprosin lyophilisiert, bei –20 °C gelagert und durch Auflösen in Milli-Q-Wasser rekonstituiert.

Für Aktivitätstests wurde das gefilterte konditionierte Medium aus Wildtyp-Neprosin und den Punktmutanten mit 3 mM reduziertem Glutathion und 0,3 mM oxidiertem Glutathion ergänzt, der pH-Wert wurde mit 20 mM Tris·HCl auf pH 8,0 eingestellt und die Mischung wurde mit cOmplete inkubiert His-Tag-Reinigungsharz (Roche). Das Harz wurde in einer offenen Säule gesammelt und das gebundene Protein wurde mit 10 mM Tris·HCl, pH 7,0, 300 mM Natriumchlorid gewaschen und dann mit 100 mM Glycin, pH 2,5, 300 mM Natriumchlorid eluiert.

Wildtyp- und mutierte reife Formen von Neprosin oder Neprosin-Strep wurden durch Autolyse erhalten. Von Ni-NTA- oder Strep-Tactin-Säulen eluierte Proteinproben wurden gegen Puffer dialysiert, zweifach mit 100 mM Glycin pH 2,5 verdünnt und bis zu 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden zu bestimmten Zeitpunkten (0 Min., 10 Min., 20 Min., 30 Min., 1 h, 2 h und über Nacht) durch Kochen von Aliquots in reduzierendem/denaturierendem SDS-Probenpuffer und anschließender SDS-PAGE gestoppt. Reifes Neprosin wurde in einer PD10-Säule gegen 20 mM Tris·HCl, pH 7,5, 250 mM Natriumchlorid gepuffert, gefolgt von SEC in einer Superdex 75 10/300 GL-Säule mit dem gleichen Puffer. Die Proteinreinheit und -identität wurden wie oben angegeben bewertet.

Um reife Neprosin-Punktmutanten aus Zymogenen zu erhalten, die nicht automatisch aktivieren, wurden die gereinigten Proproteine ​​(H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q und E297A) mit aktiviertem Neprosin-Strep bei einem Gewicht von 20:1 inkubiert Verhältnis über Nacht bei 37 °C. Pro-Neprosin-Strep wurde zuvor zur Aktivierung gegen 100 mM Glycin, pH 3,0, 150 mM Natriumchlorid gepuffert. Gespaltene Proben wurden gepuffert und durch umgekehrte Affinitätschromatographie gereinigt, konzentriert und durch SEC gereinigt.

Pro-Neprosin und reifes Neprosin wurden durch Differentialscanning-Fluorimetrie unter Verwendung eines iCycler iQ Echtzeit-PCR-Nachweissystems (Bio-Rad) analysiert. Die Proben wurden mit 0,5 mg/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 oder 10 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) als Reduktionsmittel hergestellt und mit 5× SYPRO Orange Protein Stain (Thermo Fisher Scientific) ergänzt. Die Temperatur des mittleren Übergangs (Tm) wurde als Durchschnitt von Doppelmessungen des Mittelpunktswerts der Stabilitätskurve bestimmt.

Wir inkubierten 10 μM des fluoreszierenden Proteinsubstrats DQ Red BSA (Thermo Fisher Scientific) mit 0,15 μM Neprosin in 100 μL Puffer bei pH 2–8. Die Fluoreszenz wurde mit einem Infinite M2000 Mikroplatten-Fluorimeter (Tecan) bei 37 °C überwacht. Zum Vergleich haben wir 0,5 μM Rinder-Trypsin (Sigma-Aldrich) und Schweine-Pepsin (Fluka) getestet. Jeder Assay wurde dreifach durchgeführt.

Die kinetischen Parameter der Spaltung des FS6-QPQL-Peptids (Mca–Q–P–Q–L–Dpa–A–R–NH2; GenScript) durch Wildtyp-Neprosin (25 nM Endenzymkonzentration) sowie die des FS6 Peptid (Mca–K–P–L–G–L–Dpa–A–R–NH2; Sigma-Aldrich) durch Neprosin bei einer Endenzymkonzentration von 100 nM wurden in Reaktionen mit 100 mM Glycin, pH 3,0 und Substratkonzentrationen von 1 bestimmt –75 μM (FS6-QPQL) oder 2,5–75 μM (FS6) bei 37 °C. Das Fluoreszenzsignal, das die Spaltungsproduktbildung darstellt, wurde über die Zeit für jede Substratkonzentration aufgezeichnet und die Anfangsrate (v0) wurde aus der Steigung des linearen Teils der Kurve abgeleitet. Unter Verwendung verschiedener Substratkonzentrationen und eines Überschusses an Peptidase haben wir das nach dem vollständigen Substratumsatz erzeugte Fluoreszenzsignal gemessen und die entsprechenden Fluoreszenzeinheiten pro Picomol gespaltenes Substrat berechnet. Diese Werte wurden gegen die Substratkonzentration aufgetragen und durch nichtlineare Regression unter Verwendung von GraphPad75 und SigmaPlot76 an die hyperbolische Michaelis-Menten-Gleichung (v = Vmax·[S]/{KM+[S]}) angepasst, um die maximale Geschwindigkeit (Vmax), die Michaelis, zu bestimmen Substrataffinitätskonstante (KM), die Umsatzrate (kcat = Vmax/[Etotal]) und die katalytische Effizienz (kcat/KM) der Spaltungsreaktion. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die peptidolytische Aktivität von Wildtyp-Neprosin wurde mit der der Mutanten K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188Q, Y214A und E297Q (140 ng) unter Verwendung von 10 μM des fluorogenen FS6-QPQL-Peptids in 100 mM Glycin, pH 3,0, verglichen , 150 mM Natriumchlorid bei 37 °C, Schütteln in einem Synergy H1-Mikroplattenlesegerät (BioTek). Um eine identische Probenbehandlung sicherzustellen, wurden alle Proteinvarianten mit Neprosin-Strep aktiviert, das dann wie oben angegeben durch umgekehrte Affinitätschromatographie entfernt wurde. Die Proteinkonzentration wurde anhand der Oberfläche der A280-SEC-Kurven geschätzt und basierend auf den ε280-Werten korrigiert. Als Aktivitätsendpunkte wurden Fluoreszenzwerte nach 30 Minuten verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Unterschiede wurden mit GraphPad auf statistische Signifikanz analysiert.

Weizengliadin (Sigma-Aldrich) wurde in 100 mM Glycin pH 2,5 und variablen Konzentrationen an Pepsin (0,05–10 μM) aus Schweinemagenschleimhaut (Fluka), Neprosin (0,05–2 μM) oder Mischungen aus 0,5 μM Pepsin und 0,05 μM hergestellt –2 μM Neprosin wurden verwendet, um 10 mg/ml Gliadin-Aufschlämmungen zu verdauen. Die Reaktionen wurden durch Turbidimetrie in 96-Well-Platten (Corning) bei 37 °C in einem Mikroplatten-Spektrophotometer (BioTek) überwacht. Die Reaktionen wurden vor der Analyse mittels SDS-PAGE durch Kochen in SDS-Probenpuffer gelöscht. Der Gliadinabbau durch Neprosin wurde auch durch Zymographie unter Verwendung von SDS-PAGE-Gelen analysiert, die entweder Weizengliadin oder Teleostean-Gelatine (Sigma-Aldrich), das als Kontrolle verwendet wurde, in einer Konzentration von 0,1 mg/ml enthielten. Es wurde auch Pro-Neprosin getestet, das während des Tests zur reifen Form aktiviert wurde. Die Proteine ​​wurden durch Waschen der Zymogramme mit 2,5 % Triton X-100 in 100 mM Glycin, pH 2,5, 200 mM Natriumchlorid renaturiert. Nach weiteren Wäschen mit dem gleichen Puffer plus 0,02 % Brij-35 wurden die Zymogramme über Nacht im gleichen Puffer inkubiert, kurz mit Wasser gespült und mit Coomassie gefärbt.

Die Spaltung des 33-mer-Peptids von Weizen-α-Gliadin (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF, 3911 Da) wurde mit einem AutoFLEX III MALDI-TOF-Massenspektrometer überwacht. Das Peptid (von GenScript) wurde in Wasser auf eine Konzentration von ~20 mg/ml gelöst und bei –20 °C gelagert. Die Spaltungsreaktion wurde mit ~1 mg/ml (~250 μM) Substrat in 100 mM Glycin, pH 3,0, bei 37 °C durch Zugabe von 0,5 μM Neprosin oder 10 μM Pepsin durchgeführt. Die Reaktionen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt (0 Min., 10 Min., 20 Min., 45 Min., 1 h und über Nacht) und die Proben wurden dann 1:10 mit Wasser verdünnt und mit einem gleichen Volumen der 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Matrix gemischt bei 10 mg/ml in einer Lösung, die 30 % Acetonitril und 70 % 0,1 % Trifluoressigsäure enthält, und auf eine geschliffene Stahlplatte (Bruker) getupft. Massenspektren wurden im positiven Reflektronmodus bei einer Gesamtbeschleunigungsspannung von 21 kV aufgenommen.

Wir haben die Spaltungsspezifitätsdaten von endogenem Neprosin oder rekombinantem Material aus Escherichia coli, hinterlegt bei Chorus (Projekt-ID 126225), erneut analysiert. LC-MS/MS-Rohdateien wurden in das MGF-Format konvertiert und die Daten wurden mit TANDEM, Comet und MS-GF+ verarbeitet, wie in SearchGUI77 implementiert. Die Ergebnisse wurden mit PeptideShaker78 mit einer Falscherkennungsrate von 1 % ausgewertet. Die Daten wurden in UniProt (März 2020) unspezifisch nach Treffern gegen das menschliche Proteom durchsucht, wobei eine Massentoleranz von 20 ppm für MS1 und MS2, feste Cystein-Carbamidomethylierung und variable Methioninoxidation verwendet wurden. Für die parentale Peptidmasse wurden bis zu 50 fehlende Spaltungen oder maximal 5500 Da toleriert.

Auf der Suche nach Neprosin-Inhibitoren haben wir den Breitband-cOmplete-Inhibitor-Cocktail (Roche) getestet; die Metallopeptidase-Inhibitoren 1,10-Phenathrolin, Phosphoramidon, Marimastat und Captopril (alle von Sigma-Aldrich); der Serinpeptidase-Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid (AEBSF; Sigma-Aldrich); die Aspartat-Peptidase-Inhibitoren Pepstatin A (Sigma-Aldrich), Methyl-2-[(2-diazoacetyl)amino]hexanoat (DAN; Chemical Abstracts Service (CAS) 7013-09-4; Bachem 4010441) und ENPN (CAS 5255- 75-4; Apollo Scientific OR26560); sowie die prolinhaltigen/imitierenden Verbindungen 2-Acetyl-1-methylpirrol (AMP; CAS 932-16-1; Sigma-Aldrich 160865); (S)-tert-Butyl-2-(3-ethoxy-3-oxopropanoyl)pyrrolidin-1-carboxylat (BEOPC; CAS 109180-95-2; Fluorochem 387901); und N-Boc-Glycylprolin (BGP; CAS 14296-92-5; Bachem 4003703). Die Hemmung der Spaltung des FS6-QPQL-Peptids wurde durch Vorinkubieren von 100 nM Neprosin in 100 mM Glycin, pH 3,0, mit 100 μM jeder Testerverbindung für > 1 Stunde bei 37 °C untersucht. Anschließend fügten wir 10 μM des Substrats hinzu und die Restaktivität wurde 4 Stunden lang als Anstieg der Fluoreszenz überwacht. Unterschiede wurden mit GraphPad auf statistische Signifikanz analysiert. Die Positivkontrolle in Abwesenheit von Inhibitoren (100 % Aktivität) enthielt die gleiche Endkonzentration an Dimethylsulfoxid, die zur Solubilisierung der Inhibitoren verwendet wurde. Darüber hinaus wurden die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) für Pepstatin A und ENPN bestimmt, indem die Aktivität von 50 nM Neprosin in Gegenwart von 10 μM Substrat und Inhibitorkonzentrationen von 5–500 μM bzw. 5–5000 μM gemessen wurde , um die Hemmungskurven zu erhalten. Diese Kurven wurden durch nichtlineare Regression mit GraphPad analysiert.

Experimentelle Verfahren mit Mäusen folgten den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den ARRIVE-Richtlinien. Die Protokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Barcelona (CEEA-UB/Ref. 186/20-P2) und der katalanischen Regierung (PAMN/Ref. 11485) genehmigt, die der Richtlinie 2010/63/EU folgten der Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden. Die Stichprobengröße wurde anhand des Programms des Appraising Project Office der Universität Miguel Hernández in Elx (Alacant, Spanien) geschätzt. Wir verwendeten 5 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (n = 16), die von Janvier gekauft und in der Tierhaltung der Fakultät für Pharmazie und Lebensmittelwissenschaften der Universität Barcelona in einer kontrollierten Umgebung (20–24 °C) gehalten wurden Die Tiere wurden in Käfigen mit großen Souralit 1035-Faserpartikeln als Einstreu (Bobadeb) und Seidenpapier (Gomà) gehalten -Camps) und Kletterstrukturen aus Pappe zur Käfiggestaltung. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und RM3(P)-SQC-Diät (Special Diet Services).

Nach einer Woche zur Akklimatisierung wurden zwei Gruppen von Mäusen zufällig ausgewählt, die jeweils aus vier Männern und vier Frauen bestanden (n = 8 pro Gruppe) und mit Neprosin (N) oder Vehikel (V) markiert waren. Um die physiologische Transitzeit zu berücksichtigen, wurden die Tiere nicht nüchtern gehalten und Futter und Wasser wurden erst 1 Stunde vor der oralen Sondenernährung entfernt. Mäuse der Gruppe N erhielten 50 μl Pro-Neprosin in Vehikel (0,2 mg/ml in 20 μM Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, 150 μM Natriumchlorid), wohingegen Mäuse der Gruppe V nur 50 μl Vehikel erhielten. Nach 5 Minuten wurden alle Mäuse mit kleinvolumigen Hamilton-Spritzen und angepassten oralen Sonden mit 50 μl Gliadin-Aufschlämmung gefüttert, die 5 mg Weizengliadin (Sigma-Aldrich) bei 100 mg/ml in 10 %iger Ethanollösung enthielt. Das Enzym:Gliadin-Verhältnis (1:500) wurde auf der Grundlage unserer In-vitro-Ergebnisse berechnet, die gezeigt hatten, dass Neprosin Gliadin im Verhältnis 1:500–1000 bei 37 °C über einen Zeitraum von 90 Minuten verdaut. Da der Magen-Darm-Trakt bei Mäusen dazu führt, dass ein Bolus nach 1–3 Stunden den Dünndarm erreicht und ein Teil des Inhalts bereits in den Dickdarm gelangt79, wählten wir 2,5 Stunden als optimalen Endpunkt, um den Abbau von Gliadin im oberen Gastrointestinaltrakt zu beurteilen. Anschließend wurden die Tiere durch Genickbruch eingeschläfert und der Inhalt des Magens, des proximalen Dünndarms und des distalen Dünndarms entnommen, gewogen und bei –20 °C eingefroren.

Die Proben wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) mit einer Konzentration von 200 mg/ml suspendiert, mit einem Kimble Pellet Pester Cordless Motor (DWK Life Sciences) homogenisiert und zunächst 40 Minuten lang mit Puffer bei 50 °C und dann mit extrahiert 80 % Ethanol bei 20–25 °C für 1 Stunde. Die Mischungen wurden zentrifugiert (2000 × g, 10 min, 4 °C) und die wässrige Schicht zwischen der Partikel- und Fettschicht wurde entfernt. Der 33-mer-Gehalt in jedem verdünnten Extrakt wurde mit dem AgraQuant Gluten G12 ELISA-Testkit (Romer Labs) analysiert, das gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Nachweisgrenze von 2 ppm aufweist. Der G12-Antikörper erkennt das 33-mer, aber keine anderen Gliadin-Abbaufragmente80. Die Endmengen wurden unter Berücksichtigung des Probengewichts normalisiert und die Ergebnisse als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Für die statistische Analyse wurde das Statistical Package for Social Sciences (SPSS v22.0; IBM) verwendet. Die Daten zeigten Homogenität der Varianz (Levene-Test) und folgten einer Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test), daher haben wir die herkömmliche einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) angewendet.

Wir haben die Kristallisationsbedingungen auf der gemeinsamen IBMB/IRB Automated Crystallography Platform mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen untersucht. Optimale Pro-Neprosin-Kristalle (~20 mg/ml in 20 mM Tris·HCl pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid) wurden bei 20 °C mit 0,1 M Natriumacetat pH 4,0, 22 % Polyethylenglykol (PEG) 6000, 10 % erhalten. Isopropanol als Reservoirlösung. Kristalle wurden mithilfe von Kryo-Schleifen (Molecular Dimensions) geerntet, schnell durch einen Kryo-Puffer geleitet, der aus einer Reservoirlösung plus 15 % (v/v) Glycerin bestand, und zur Datenerfassung in flüssigem Stickstoff flash-vitrifiziert. Ein Lutetium-Derivat von Pro-Neprosin wurde erhalten, indem native Kristalle 5 Minuten lang in Kryopuffer, ergänzt mit 100 mM des Lu-Xo4-Kristallophors (Polyvalan)40, eingeweicht und ohne erneutes Einweichen blitzverglast wurden. Röntgenbeugungsdaten wurden von nativen Kristallen bei 100 K auf einem Pilatus 6M-F-Pixeldetektor an der Strahllinie I04-1 der Diamond Light Source (Harwell, UK) gesammelt. Lutetium-Derivatdaten wurden auf einem Pilatus 6M-Detektor an der Strahllinie XALOC des ALBA-Synchrotrons (Cerdanyola, Katalonien, Spanien) aufgezeichnet, der mit der Generic Data Acquisition (GDA)-Software betrieben wurde.

Der reife Neprosin-Produktkomplex (Kristallform I) wurde bei einer Proteinkonzentration von ~16 mg/ml in 20 mM Tris·HCl, pH 7,5, 250 mM Natriumchlorid bei 4 °C unter Verwendung von 10 % PEG 1000, 10 % PEG 8000 erhalten als Reservoirlösung. Die Kristalle wurden vor der Flash-Verglasung in flüssigem Stickstoff mit der gleichen Reservoirlösung plus 15 % (v/v) Glycerin kryogeschützt. Röntgenbeugungsdaten bei 100 K wurden an der Strahllinie ID30B des ESRF-Synchrotrons (Grenoble, Frankreich) mit einem Pilatus 6M-Detektor gesammelt. Der reife Neprosin-Produktkomplex in Kristallform II wurde bei der gleichen Proteinkonzentration, jedoch in 0,1 M Glycin, pH 3,0, 150 mM Natriumchlorid bei 20 °C unter Verwendung von 0,1 M tribasischem Natriumcitrat, pH 5,6, 0,5 M Ammoniumsulfat, 1 M Lithium, erhalten Sulfat als Reservoirlösung. Die Kristalle wurden mit einer Lösung, die 20 % (v/v) Glycerin enthielt, kryogeschützt. Beugungsdaten wurden an der Strahllinie XALOC auf einem Pilatus 6M-Detektor gesammelt.

Beugungsdaten wurden mit Xds81 und Xscale verarbeitet und mit Xdsconv für die Programmsuiten Phenix82 und Ccp483 in das MTZ-Format umgewandelt. Alle Kristalle enthielten ein Monomer in der asymmetrischen Kristalleinheit und Ergänzungstabelle 1 enthält wichtige Statistiken zur Datenerfassung und -verarbeitung.

Die Struktur von Pro-Neprosin wurde durch anomale Beugung bei einer Wellenlänge unter Verwendung von Daten gelöst, die von einem Lutetium-Derivatkristall bei der Wellenlänge des LIII-Absorptionspeaks (1,34 Å) gesammelt wurden, indem das Autosol-Protokoll des Phenix-Pakets angewendet wurde. Die resultierende Fourier-Karte wurde dann einer weiteren Dichtemodifikation mit wARP/ARP84 unterzogen. Ein Ausgangsmodell für Lu-Xo4 wurde durch Energieminimierung erhalten, die auf die Koordinaten der metallchelatbildenden Einheit der Verbindung angewendet wurde, wie sie in ihrem Komplex mit Tb3+ (Proteindatenbank [PDB] ID 6FRO, Restname 7MT) unter Verwendung von Chimera85 zu finden ist. Die resultierenden Koordinaten im PDB-Format wurden für den Modellbau mit einem Lu3+-Ion kombiniert. Danach wechselten sich mehrere Runden manueller Modellbildung in Coot86 mit kristallographischer Verfeinerung unter Verwendung des Refine-Protokolls von Phenix und des BUSTER87-Programms ab. Das endgültige Modell umfasste die Pro-Neprosin-Reste A29–Q380 mit Ausnahme von S76–Y85 und N122–N131 sowie drei zusätzliche C-terminale Reste aus dem Reinigungstag (A401–I402–A403); zwei Lu-Xo4-Einheiten bei etwa halber Belegung; zwei N-verknüpfte Glykanketten mit insgesamt fünf Zuckerresten, die jeweils an N145 und N152 gebunden sind; zwei Acetatmoleküle; und 180 Lösungsmittelmoleküle.

Die Struktur von nativem Pro-Neprosin wurde durch molekularen Austausch mithilfe der kristallografischen Software Phaser in Ccp4 und den Proteinkoordinaten der Kristallstruktur des Lutetiumderivats gelöst. Der anschließende Modellaufbau und die Verfeinerung erfolgten wie oben beschrieben. Das endgültige Modell umfasste die Reste A29–Q380 mit Ausnahme von Y77–Y85 und N122–N131 sowie zwei zusätzliche C-terminale Reste aus dem Reinigungstag (A401–I402), zwei N-verknüpfte Glykanketten mit insgesamt vier Zuckerresten sowie acht Acetatreste. ein Isopropanol, vier Glycerin und 257 Lösungsmittelmoleküle.

Die Struktur eines Produktkomplexes von nativem, reifem Neprosin in Kristallform I wurde ebenfalls durch molekularen Ersatz unter Verwendung der Koordinaten des Fragments T132–I402 von nativem Pro-Neprosin gelöst. Der anschließende Modellaufbau und die Verfeinerung erfolgten wie oben beschrieben. Das endgültige Modell umfasste die Reste T132–Q380 plus den gesamten C-terminalen Tag (A401–I402–A403+H404–H409), zwei N-verknüpfte Glykanketten mit insgesamt sieben Zuckerresten sowie ein Triethylenglykol und 171 Lösungsmittelmoleküle. Die Struktur eines Produktkomplexes von nativem, reifem Neprosin in Kristallform II wurde ebenfalls durch molekularen Austausch unter Verwendung von Fragment T132–Q380 des Kristallform-I-Komplexes gelöst. Das endgültige Modell umfasste die Reste T132–Q380 plus den C-terminalen Tag außer H409 (A401–I402–A403+H404–H408) sowie zwei N-verknüpfte Glykanketten mit insgesamt vier Zuckerresten plus einem Nickelkation, drei Sulfatanionen, ein Tetraglycin und ein Glycin sowie 250 Lösungsmittelmoleküle. Das Nickelion, vermutlich aus dem zur Reinigung verwendeten Ni-NTA-Harz, wurde vorläufig auf der Grundlage kurzer Ligandenabstände zu zwei Histidinresten (~1,8 Å) zugeordnet, die näher an denen lagen, die für tetraedrisch koordinierte Nickelionen berichtet wurden (durchschnittlich 1,88 Å). ) als diejenigen des häufiger vorkommenden Lithiums (2,03 Å) aus der Reservoirlösung88. Basierend auf der Fähigkeit dieser Aminosäure, unter bestimmten Bedingungen zu oligomerisieren, wurde vorläufig ein Tetraglycin in einem geeigneten Dichtebereich platziert89. Ergänzende Tabelle 1 enthält wesentliche Statistiken zu den endgültigen verfeinerten Modellen, die mithilfe des wwPDB Validation Service unter https://validate-rcsb-1.wwpdb.org/validservice validiert und bei der PDB unter www.pdb.org (Zugriffscodes) hinterlegt wurden 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB und 7ZVC).

Strukturelle Überlagerungen und strukturbasierte Sequenzausrichtungen wurden mit dem SSM-Programm in Coot berechnet. Die Figuren wurden mit Chimera hergestellt. Strukturbasierte Ähnlichkeitssuchen wurden mit Dali90 durchgeführt. Proteinschnittstellen wurden mit PDBePISA unter www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa berechnet. Die interagierende Oberfläche eines Komplexes wurde als die Hälfte der Summe der vergrabenen Oberflächenbereiche beider Moleküle definiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten und Reagenzien sind bei den Autoren auf begründete Anfrage und Unterzeichnung von Geheimhaltungs- und Materialübertragungsvereinbarungen zur gemeinnützigen Nutzung durch akademische Gruppen frei erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Atomkoordinaten sind in der Proteindatenbank unter den Codes 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB und 7ZVC verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Laura Company, Roman Bonet, Xandra Kreplin und Joan Pous von der gemeinsamen IBMB/IRB Automated Crystallography Platform und dem Protein Purification Service für ihre Unterstützung bei der Reinigung und Kristallisation. Das Plasmid pCMV wurde freundlicherweise von Jan J. Enghild, Universität Århus, Dänemark, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken außerdem den ESRF-, DIAMOND- und ALBA-Synchrotronen für die Strahlzeit und dem jeweiligen Strahllinienpersonal für die Unterstützung bei der Beugungsdatenerfassung. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse von öffentlichen und privaten Einrichtungen in Spanien und Katalonien unterstützt (Zuschuss-/Stipendienreferenzen PID2019-107725RG-I00 an FXG-R., ARB, UE und TG; BES-2016-076877 an SRM, BES-2015- 074583 an LAM, Beatriu de Pinós 2018BP00163 an UE, 2017SGR3 und Fundació La Marató de TV3 201815 an FXG-R., UE, ARB und TG). Die Autoren danken Richard M. Twyman für die Bearbeitung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes.

Proteolyselabor; Abteilung für Strukturbiologie, Molekularbiologisches Institut von Barcelona (CSIC), Barcelona Science Park; c/Baldiri Reixac, 15-21, 08028, Barcelona, ​​Katalonien, Spanien

Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes, Arturo Rodríguez-Banqueri, Laura Garzon-Flores, Tibisay Guevara, Ulrich Eckhard & F. Xavier Gomis-Rüth

Abteilung für Physiologie; Abteilung für Biochemie und Physiologie; Fakultät für Pharmazie und Lebensmittelwissenschaften, Universität Barcelona, ​​Av. Joan XXIII, 27-31, 08028, Barcelona, ​​Katalonien, Spanien

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángels Franch und Francisco J. Pérez-Cano

Forschungsinstitut für Ernährung und Lebensmittelsicherheit (INSA-UB), Universität Barcelona, ​​​​Av. Prat de la Riba, 171, 08921, Santa Coloma de Gramenet, Katalonien, Spanien

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángels Franch und Francisco J. Pérez-Cano

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FXGR konzipierte und betreute das Projekt; LdAM, TG, LG-F. und SRM produzierte und reinigte Proteine, generierte Mutanten und führte In-vitro-Studien durch; LdAM-, ARB- und TG-kristallisierte Proteine; ARB und UE sammelten Beugungsdaten; UE führte Experimente durch, analysierte Daten und beaufsichtigte Arbeiter; FXGR löste und verfeinerte Kristallstrukturen; FJPC, MG, MJRL und À.F. führte Tierversuche durch und FXGR verfasste das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren.

Korrespondenz mit F. Xavier Gomis-Rüth.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Hans Brandstetter und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

del Amo-Maestro, L., Mendes, SR, Rodriguez-Banqueri, A. et al. Molekulare und In-vivo-Studien einer Prolyl-Endopeptidase der Glutamat-Klasse zur Zöliakie-Therapie. Nat Commun 13, 4446 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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Eingegangen: 16. Mai 2022

Angenommen: 21. Juli 2022

Veröffentlicht: 01. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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