Vinylcopolymere mit schnellerem hydrolytischem Abbau als aliphatische Polyester und einstellbaren oberen kritischen Lösungstemperaturen

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2873 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Vinylpolymere stehen aufgrund ihrer einfachen Synthese und der Möglichkeit zur Herstellung wohldefinierter, funktioneller Materialien im Mittelpunkt intensiver Forschung. Ihre Nichtabbaubarkeit führt jedoch zu Umweltproblemen und schränkt ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen ein, sodass aliphatische Polyester immer noch als Goldstandard gelten. Die radikalische Ringöffnungspolymerisation cyclischer Ketenacetale gilt als der vielversprechendste Ansatz, um Vinylpolymeren Abbaubarkeit zu verleihen. Allerdings weisen diese Materialien immer noch einen schlechten hydrolytischen Abbau auf und können daher noch nicht mit herkömmlichen Polyestern konkurrieren. Hier zeigen wir, dass ein einfaches Copolymerisationssystem auf Basis von Acrylamid und zyklischen Ketenacetalen zu wohldefinierten und zytokompatiblen Copolymeren mit schnellerem hydrolytischem Abbau als Polylactid und Poly(lactid-co-glycolid) führt. Darüber hinaus können die Copolymere durch Änderung der Natur des zyklischen Ketenacetals entweder wasserlöslich sein oder einstellbare obere kritische Lösungstemperaturen aufweisen, die für eine milde, durch Hyperthermie ausgelöste Arzneimittelfreisetzung relevant sind. Aus diesem System abgeleitete amphiphile Diblockcopolymere können auch durch ein reines Wasser-Nanopräzipitationsverfahren zu abbaubaren, wärmeempfindlichen Nanopartikeln formuliert werden.

Vinylpolymere sind aufgrund ihrer einfachen Synthese und ihrer großen Vielfalt an Architekturen, Zusammensetzungen und Funktionalitäten attraktive Materialien, insbesondere seit dem Aufkommen der reversiblen Desaktivierungsradikalpolymerisation (RDRP)1,2,3. Allerdings sind sie aufgrund ihres Kohlenstoffrückgrats nicht abbaubar, was zu Umweltproblemen führt und ihre Verwendung für biomedizinische Anwendungen stark einschränkt. Daher sind aliphatische Polyester aufgrund ihrer Biokompatibilität und Abbaubarkeit immer noch der Goldstandard, insbesondere für biomedizinische Anwendungen. Allerdings sind die Möglichkeiten, sie einfach zu funktionalisieren und ihre Struktur und Zusammensetzung anzupassen, um fortschrittliche Materialien zu erhalten, eher begrenzt. Daher ist die Kombination der Vorteile beider Polymerfamilien zur Herstellung abbaubarer Materialien der nächsten Generation immer noch ein ungedeckter Bedarf.

In diesem Zusammenhang wurden große Anstrengungen unternommen, abbaubare Vinylpolymere zu synthetisieren4. Einer der wirkungsvollsten Ansätze beruht auf der Einführung von Estergruppen in das Polymerrückgrat durch radikalische Ringöffnungspolymerisation (rROP) von zyklischen Ketenacetalen (CKAs)5,6. Darunter 2-Methylen-1,3-dioxepan (MDO), 5,6-Benzo-2-methylen-1,3-dioxepan (BMDO) oder 2-Methylen-4-phenyl-1,3-dioxolan (MPDL). ) sind bei weitem die am häufigsten verwendeten7,8. Beispielsweise hat die Copolymerisation üblicher Vinylmonomere mit CKAs durch konventionelle radikalische Polymerisation oder RDRP große Aufmerksamkeit erhalten8, um abbaubare Materialien für Anwendungen in der Arzneimittelabgabe9,10,11, marinen Antibiofouling-Technologien12,13,14, Gen-/DNA-Transfektion15 und Gewebe zu entwickeln Ingenieurwesen16 und andere17,18.

Doch trotz vielversprechender Machbarkeitsnachweise bleibt der schlechte hydrolytische Abbau von CKA-haltigen Copolymeren unter physiologischen Bedingungen eine erhebliche Einschränkung. Obwohl ihr hydrolytischer Abbau unter beschleunigten Bedingungen schnell erfolgt, dauert ihr Abbau unter physiologischen Bedingungen normalerweise mehrere Monate bis zu einem Jahr, um eine mindestens 50-prozentige Abnahme der Molmasse zu erreichen, selbst bei Oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat (OEGMA). ) als Hauptvinylmonomer19,20,21, was für einige (biobezogene) Anwendungen problematisch sein kann. Daher können solche Materialien immer noch nicht mit den gängigsten Polyestern wie Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) oder sogar Poly(milchsäure) (PLA) konkurrieren. Ihr enzymatischer Abbau ist ebenfalls sehr begrenzt, da nur Copolymere, die Polycaprolacton (PCL)-ähnliche MDO-Einheiten umfassen, in Gegenwart spezifischer Enzyme (z. B. Lipasen) einen signifikanten Abbau zeigten21, wohingegen der sperrige aromatische Ring und/oder die zu hohe Hydrophobie von BMDO und MPDL behindert den Enzymzugang drastisch20,22. Darüber hinaus wird das CKA für die Entwicklung von Materialien mit fortgeschrittenen physikalisch-chemischen, selbstorganisierenden oder stimuliresponsiven Eigenschaften8 häufig mindestens als drittes Comonomer und für ein einzelnes Ziel verwendet; das verleiht Abbaubarkeit. Dies macht die Synthese komplexer und hat aufgrund der hohen Hydrophobie von CKAs und/oder Nebenreaktionen während der Polymerisation häufig einen nachteiligen Einfluss auf die angestrebten Eigenschaften (z. B. die Löslichkeit wasserlöslicher Copolymere11, die kolloidale Stabilität und die Partikelgrößenverteilung). von Nanopartikeln23, Reizreaktivität von Materialien24,25). Daher wäre es ein wichtiger Fortschritt, dem CKA die Kombination zweier unterschiedlicher Eigenschaften zu ermöglichen.

All diese Einschränkungen sind von größter Bedeutung und stellen ernsthafte Hindernisse für die Entwicklung fortschrittlicher Vinylpolymere für biomedizinische Anwendungen dar, wie beispielsweise thermoresponsiver Vinylpolymere, die vielversprechend für potenzielle Anwendungen in der Biotechnik und Nanomedizin sind26. Sie können entweder eine untere kritische Lösungstemperatur oder eine obere kritische Lösungstemperatur (UCST) aufweisen; Letzteres wird als sehr attraktives Merkmal für eine milde, durch Hyperthermie ausgelöste Arzneimittelfreisetzung angesehen. Allerdings haben nicht nur abbaubare, thermoresponsive Vinylpolymere sehr wenig Beachtung gefunden17,22,27,28,29,30,31,32, insbesondere UCST-Polymere33,34, sondern sie alle zeigen einen schlechten hydrolytischen Abbau und die Synthese wohldefinierter, Es wurde nie über UCST-Vinylcopolymere berichtet, die sich in Wasser zersetzen können.

Hier berichten wir über ein Copolymerisationssystem auf Basis von Acrylamid (AAm), das die zuvor erwähnten Einschränkungen im Zusammenhang mit dem rROP von CKAs umgeht. Es ermöglichte die Synthese wohldefinierter und zytokompatibler Vinylcopolymere, die Folgendes aufwiesen: (i) einen schnellen hydrolytischen Abbau in Wasser oder PBS, schneller als der von PLA und sogar PLGA, was auf dem Gebiet der Vinylmaterialien beispiellos ist, und (ii) vollständig Wasserlöslichkeit oder ein abstimmbarer und scharfer UCST unter praktisch relevanten Bedingungen, bei denen der CKA ein integraler Bestandteil des Thermosensitivitätsmechanismus ist, wodurch das System erheblich vereinfacht wird (Abb. 1). Um das große Interesse an diesen Bausteinen für biomedizinische Anwendungen zu demonstrieren, haben wir auch amphiphile PEG-basierte Diblockcopolymere synthetisiert, die aufgrund ihrer UCST durch einen rein wasserbasierten Nanopräzipitationsprozess zu Nanopartikeln (NPs) formuliert wurden. Dadurch wurde auf den Einsatz organischer Lösungsmittel verzichtet, die für die pharmazeutische Entwicklung oft problematisch sind, was im pharmazeutischen Bereich ebenfalls beispiellos ist. Diese Nanopartikel zeigten sowohl UCST- als auch LCST-Übergänge, was zu doppelt wärmeempfindlichen, abbaubaren Nanopartikeln führte.

Synthese wohldefinierter Poly(acrylamid-co-cyclisches Ketenacetal) (P(AAm-co-CKA))-Copolymere durch reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungs-(RAFT)-Copolymerisation zwischen AAm und CKAs, die einen einstellbaren und biologisch relevanten oberen kritischen Wert aufweisen Lösungstemperatur (UCST) und schnellerer hydrolytischer Abbau als Polylactid (PLA) und Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA).

Der Entwurf des Copolymerisationssystems basierte auf einer einfachen Strukturanalogie zu Poly(acrylamid-co-styrol) (P(AAm-co-S))-Copolymeren, von denen bekannt ist, dass sie in wässriger Lösung im Bereich von 50–62 °C eine UCST aufweisen , aufgrund reversibler Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Copolymerketten unterhalb der UCST und mit Wassermolekülen oberhalb35. Diese Copolymere fanden jedoch im Vergleich zu ihren acrylnitrilhaltigen UCST-Gegenstücken wenig Beachtung; nämlich Poly(acrylamid-co-acrylonitril) (P(AAm-co-AN))-Copolymere26,36. Dennoch postulierten wir, dass der Ersatz von Styrol durch aromatische ringhaltige CKA-Einheiten wie MPDL oder BMDO ein direkter Weg zu abbaubaren UCST-Copolymeren sein könnte, bei denen das CKA sowohl Abbaubarkeit verleiht als auch die Thermoreaktivität steuert, idealerweise in einem viel breiteren Temperaturbereich Reichweite. Es wurde auch postuliert, dass dieses Copolymerisationssystem mit RDRP kompatibel wäre, um den Zugang zu wohldefinierten Architekturen zu ermöglichen, und dass diese angesichts der sehr hohen Wasserlöslichkeit von anfälliger für hydrolytischen Abbau seien als alle anderen bisher synthetisierten CKA-haltigen Vinylcopolymere AAm-Einheiten, die eine effiziente Solvatisierung von Estergruppen fördern würden (Abb. 2).

RAFT-vermittelte Copolymerisation zwischen Acrylamid (AAm) und zyklischen Ketenacetalen (CKA), wie 2-Methylen-4-phenyl-1,3-dioxolan (MPDL), 5,6-Benzo-2-methylen-1,3- Dioxepan (BMDO) und 2-Methylen-1,3-dioxepan (MDO).

Um den am besten geeigneten aromatischen Ring enthaltenden CKA zur Verleihung der Abbaubarkeit und zur Steuerung der Wärmeempfindlichkeit zu bestimmen, wurden die ersten Copolymerisationen mit MPDL durchgeführt, da seine offene Radikalstruktur der von Styrol sehr nahe kommt. P(AAm-co-MPDL)-Copolymere (P0–P4, Tabelle 1) wurden durch RAFT-vermittelte Copolymerisation von AAm und variablen anfänglichen Molanteilen von MPDL (fMPDL,0 = 0–0,8) bei 8 M in wasserfreiem Dimethylsulfoxid erhalten (DMSO) für 16 Stunden unter Verwendung von 4-Cyano-4-[(dodecylsulfanylthiocarbonyl)sulfanyl]pentansäure (CDSPA) als Kettenübertragungsmittel (CTA) und Azobisisobutyronitril (AIBN) als Initiator. Es wurden hohe Monomerumsätze erzielt und die Copolymere zeigten Molekulargewichte im Bereich von 8,3–28,3 kg mol−1 mit überwiegend niedrigen Dispersitäten (Đ = 1,2–1,3) (Abb. 3a, c). Mittels 1H-Kernspinresonanz (NMR) wurde gezeigt, dass der Molanteil von MPDL im Copolymer (FMPDL) zwischen 0,038 und 0,108 schwankte, wobei durchschnittlich 46 % offene MPDL-Einheiten auftraten (Abb. 3b). Je mehr MPDL in der Comonomerbeschickung enthalten ist, desto niedriger ist außerdem das Molekulargewicht, wie bereits bei anderen CKA/Vinylmonomerpaaren beobachtet23,37,38.

ein kinetisches Umwandlungs-Zeit-Diagramm der RAFT-Copolymerisation von AAm mit MPDL (Tabelle 1, P0–P4) in wasserfreiem DMSO, initiiert durch AIBN bei 70 °C. Umwandlung = AAm-Umwandlung, bestimmt durch 1H-NMR; b 1H-NMR-Spektrum (300 MHz, DMSO-d6) im 0–9 ppm-Bereich der P(AAm-co-MPDL)-Copolymere P0–P4 (Tabelle 1); c Entwicklung der SEC-Chromatogramme der P(AAm-co-MPDL)-Copolymere P0–P4 als Funktion von FMPDL; d Variation der Lösungsdurchlässigkeit gegenüber der Temperatur der Lösung der P(AAm-co-MPDL)-Copolymere P2–P4 in Wasser bei 10 mg mL−1 (1 °C min−1, durchgezogene und gepunktete Linien für Kühlung bzw. Erwärmung) ; e Entwicklung der SEC-Chromatogramme zu einem anderen Zeitpunkt während des hydrolytischen Abbaus unter beschleunigten Bedingungen (5 Gew.-% KOH) des P(AAm-co-MPDL)-Copolymers P4.

Die Löslichkeit der verschiedenen Copolymere in Wasser (10 mg mL−1) wurde dann durch Transmissionsmessungen zwischen 5 und 50 °C getestet (Abb. 3d). Während PAAm (P0) und P(AAm-co-MPDL) mit FMPDL = 0,038 (P1) unabhängig von der Temperatur vollständig wasserlöslich waren, zeigten die Copolymere mit höheren MPDL-Mengen (P2–P4) einen scharfen Übergang vom UCST-Typ beim Abkühlen. Darüber hinaus ermöglichte die Variation des FMPDL von 0,043 bis 0,108 eine Feinabstimmung der Thermoempfindlichkeit, wie der Anstieg des Trübungspunkts (Tcp) von 15 auf 38 °C zeigt (ergänzende Abbildung 1). P(AAm-co-MPDL)-Copolymere, P2 und P3 ergaben beim Abkühlen eine UCST, beim Erhitzen jedoch nicht, da sich stabile Aggregate bildeten. Für das Copolymer mit dem höchsten MPDL-Gehalt (P4) wurde jedoch ein reversibler Übergang beobachtet, der jedes Mal den gleichen Trübungspunkt nahe der Körpertemperatur (Tcp = 38 °C) ergab. Der Abbau von P(AAm-co-MPDL)-Copolymeren wurde dann unter beschleunigten Bedingungen durchgeführt (d. h. 5 Gew.-% wässriges Kaliumhydroxid (KOH), um das Vorhandensein offener Estergruppen zu prüfen. Während P(AAm-co-MPDL)-Copolymer P1 zeigte nach dem Abbau aufgrund der zu geringen Menge an offenen MPDL-Einheiten ein nahezu konstantes Mn, die P(AAm-co-MPDL)-Copolymere P2–P4 führten zu einer Abnahme des Mn um bis zu −31 %, wie durch Größenausschlusschromatographie (SEC) gezeigt wurde. (Abb. 3e und ergänzende Abb. 2). Obwohl signifikant, schien dieser Abbau jedoch geringer als erwartet gemäß den theoretischen Mn-Nach-Abbau-Werten (Mn, deg. theo., Tabelle 1). Dies kann nicht nur durch die begrenzte erklärt werden Die Menge an MPDL, die in das Copolymer eingefügt wird, ist auf die Neigung von CKAs zurückzuführen, mit den meisten Acrylmonomeren kaum zu copolymerisieren, aber auch auf den erheblichen Anteil an ringbehaltenen MPDL-Einheiten.

Um die Schlüsselrolle des aromatischen Rings des CKA bei der Etablierung des UCST und damit die Relevanz der Strukturanalogie zwischen P(AAm-co-MPDL)- und P(AAm-co-S)-Copolymeren zu bestätigen, haben wir ähnliche Copolymere mit MDO synthetisiert als CKA (Tabelle 1, P5 – P8, ergänzende Abbildungen 3 und 4). Vergleichbare makromolekulare Eigenschaften wurden trotz zunehmender Dispersitäten bei Erhöhung des anfänglichen MDO-Molanteils erhalten (Mn, exp = 14–53,4 kg mol−1, Đ = 1,7–4,4, ergänzende Abbildung 5). Die Copolymere wurden unter beschleunigten Bedingungen erfolgreich abgebaut, wobei der Mn-Gehalt um bis zu 88 % abnahm (ergänzende Abbildung 6). Allerdings zeigte keines der P(AAm-co-MDO)-Copolymere trotz eines breiten Spektrums getesteter Zusammensetzungen (FMDO = 0,095–0,44) eine UCST. Alle Copolymere waren im Temperaturbereich von 0–100 ° C tatsächlich wasserlöslich, mit Ausnahme des mit dem höchsten MDO-Gehalt (P8), das in Wasser unlöslich war (ergänzende Abbildung 7). Es ist zu beachten, dass thermoresponsive P(AAm-co-MDO)-Copolymere immer noch erhalten werden können, allerdings durch einen radikalischen Polymerisationsprozess, der schlecht definierte Strukturen mit PMDO-Zweigen erzeugt, die für die Thermosensitivität verantwortlich waren, aber eine vollständige Wasserlöslichkeit verhinderten die Copolymere, deren Abbau nicht nachgewiesen wurde33.

Diese Ergebnisse bestätigten unsere Hypothese, da sie zeigten, dass eine einfache RAFT-vermittelte Copolymerisation zwischen AAm und einem aromatischen Ring enthaltenden CKA wie MPDL aufgrund der Anwesenheit von Wasserstoffbrückendonoren die unkomplizierte Synthese wohldefinierter, abbaubarer UCST-Vinylcopolymere ermöglichte ( NH-Gruppe des primären Amids in AAm-Einheiten) und Akzeptoren (Zentrum der Phenylringe in MPDL-Einheiten)39.

AAm wurde dann mit BMDO als einem zweiten aromatischen Ring enthaltenden CKA unter ähnlichen Bedingungen copolymerisiert, um (i) die Machbarkeit von wohldefinierten, abbaubaren und UCST-P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren zu beurteilen und (ii) die zu bestimmen Bestimmung des besten Copolymerisationssystems vor weiteren physikalisch-chemischen und biobezogenen Untersuchungen. Abgesehen von möglichen Unterschieden hinsichtlich der CKA-Insertion und der Menge an ringgeöffneten Einheiten zwischen MPDL und BMDO vermuteten wir auch, dass der Positionsunterschied des aromatischen Rings zwischen diesen beiden Monomeren die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und damit die Thermoempfindlichkeit beeinflussen könnte.

P(AAm-co-BMDO)-Copolymere (P9–P17, Tabelle 2) wurden bei 0,8 M in wasserfreiem DMSO erhalten, da Copolymerisationen zwischen 2 und 8 M in <1 h zu hochviskose Lösungen und größere Anteile an geschlossenem BMDO ergaben (Ergänzung). Tabelle 1 und ergänzende Abbildungen 8 und 9). Durch Variation von fBMDO,0 von 0 bis 0,55 lagen die Monomerumsätze nach 16 Stunden im Bereich von 96–67 %, und je mehr BMDO im Einsatzmaterial enthalten war, desto geringer war der Umsatz (Abb. 4a). Die Molekulargewichte der Copolymere lagen zwischen 18,6 und 6,1 kg mol−1 mit eher geringen Dispersitäten (Đ = 1,2–1,5) (Abb. 4c). Eine vollständige Copolymerisationskinetik wurde auch für P13 durchgeführt, indem in regelmäßigen Abständen Proben entnommen wurden, um das lineare Wachstum des Copolymers mit der Umwandlung sicherzustellen (ergänzende Abbildung 10). Bemerkenswerterweise wurde durch 1H-NMR gezeigt, dass nicht nur höhere Gehalte an BMDO im Vergleich zu MPDL bei ähnlichen Zufuhrverhältnissen eingeführt werden konnten (z. B. führten fBMDO,0 = 0,50 und fMPDL,0 = 0,80 zu relativ ähnlichen FCKA-Werten von 0,102 und 0,108). ), aber der durchschnittliche Prozentsatz an ringgeöffneten BMDO-Einheiten war viel höher als bei MPDL (89 vs. 46 %), was auf eine größere Anfälligkeit für Hydrolyse schließen lässt (Abb. 4b). Angesichts dieses großen Vorteils haben wir uns daher entschieden, das AAm/BMDO-Copolymerisationssystem für die weitere Bewertung auszuwählen. Die Reaktivitätsverhältnisse von AAm/BMDO wurden unter Verwendung der nichtlinearen Methode der kleinsten Quadrate (ergänzende Abbildung 11) zu rAAm = 13,02 und rBMDO = 0,23 bestimmt. Diese Werte ähneln denen, die für die Copolymerisation von BMDO mit N-Isopropylacrylamid (NIPAAm) berichtet wurden (rNIPAAm = 7,31 und rBMDO = 0,11 bei 120 °C)42.

ein kinetisches Umwandlungs-Zeit-Diagramm der RAFT-Polymerisation von AAm mit BMDO in wasserfreiem DMSO, initiiert durch AIBN bei 70 °C. Umwandlung = AAm-Umwandlung, bestimmt durch 1H-NMR; b 1H-NMR-Spektrum (300 MHz, DMSO-d6) im Bereich von 0–9 ppm der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P9–P17 (Tabelle 2); c Entwicklung der SEC-Chromatogramme der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P9–P17 als Funktion von FBMDO; d Variation der Lösungsdurchlässigkeit gegenüber der Temperatur der Lösung der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P13–P17 in Wasser bei 10 mg mL−1 (1 °C min−1, durchgezogene und gepunktete Linien für Kühlung bzw. Erwärmung) ; e Variation des Intensitätsmitteldurchmessers (Dz) von DLS über der Temperatur der Lösung der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P13–P17 in Wasser (10 mg mL−1) beim Abkühlen (1 °C min−1); f-Entwicklung von Tcp, gemessen durch UV beim Erhitzen als Funktion von FBMDO für die Copolymere P13–P17 (die gestrichelte blaue Linie ist eine lineare Regression, die nur zur visuellen Orientierung dient).

Wie erwartet zeigten P(AAm-co-BMDO)-Copolymere sowohl beim Abkühlen als auch beim Erhitzen scharfe UCST-Übergänge, sofern sie genügend BMDO enthielten (Abb. 4d). Tatsächlich waren PAAm (P9) und P(AAm-co-BMDO) mit FBMDO = 0,017–0,068 (P10–P12) im Temperaturbereich von 0–100 °C vollständig in Wasser löslich, wohingegen die Copolymere P13–P17 einen Anstieg von ergaben Tcp von 25 auf 52 °C mit FBMDO (Ergänzende Abbildung 12). Wichtig ist, dass dadurch ein für biomedizinische Anwendungen geeignetes UCST-Sortiment erhalten werden konnte, da sowohl die Raum- als auch die Körpertemperatur einfach durch die Anpassung des BMDO-Gehalts im Copolymer abgedeckt werden konnten. Darüber hinaus ermöglichte die Verwendung von BMDO anstelle von MPDL die Erzielung einer vollständig reversiblen UCST mit minimaler Hysterese zwischen Abkühlen und Erhitzen für alle wärmeempfindlichen Copolymere (Abb. 4d). Es ermöglichte auch einen eher linearen Anstieg von Tcp mit FBMDO und die Abdeckung eines viel breiteren Tcp-Bereichs für einen engeren Bereich des CKA-Gehalts (ΔTcp = 27 °C für ΔFBMDO = 0,035 vs. ΔTcp = 23 °C für ΔFMPDL = 0,065). (Abb. 4f). Der letzte Punkt zeigt, dass die Feinabstimmung des Tcp nicht auf Kosten starker Schwankungen in der Copolymerzusammensetzung und der erwarteten Verschlechterung geht. Zum Vergleich zeigten nicht abbaubare P(AAm-co-S)-Vinylcopolymere ein UCST-Verhalten über einen viel engeren Temperatur- und Copolymerzusammensetzungsbereich (ΔTcp = 12 °C für ΔFS = 0,02)35.

Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um die Änderungen des Intensitätsdurchschnittsdurchmessers (Dz) der wärmeempfindlichen Copolymere in Wasser beim Abkühlen und Erhitzen zu überwachen, und lieferte Tcp-Werte, die hervorragend mit denen aus Transmissionsmessungen übereinstimmten (Abb. 4e und ergänzende Abb . 13). Oberhalb der UCST waren die Copolymere vollständig löslich und zeichneten sich durch einen durchschnittlichen Dz-Wert von etwa 10 nm aus, wohingegen beim Abkühlen der durchschnittliche Dz-Wert abrupt auf etwa 2–5 µm anstieg, was die Bildung von Aggregaten belegt. Die Bildung solcher Aggregate wurde auch durch optische Mikroskopie überwacht (ergänzende Abbildung 14).

Um weitere Einblicke in das UCST-Verhalten dieses Copolymerisationssystems zu erhalten, wurde auch die Abhängigkeit des Trübungspunkts vom Molekulargewicht für einen festen fBMDO,0-Wert und von der Copolymerkonzentration untersucht. Zusätzliche Copolymerisationen mit fBMDO,0 = 0,4 wurden zunächst durchgeführt, indem durchschnittliche Polymerisationsgrade, DPn, th, von 400 und 600 (P18 bzw. P19, Ergänzungstabelle 2) angestrebt wurden, um mit P13 (DPn, th = 200) verglichen zu werden. Je höher DPn, th, desto höher das Molekulargewicht (Mn, exp = 7,6–10,2 kg mol−1, Đ = 1,4–1,8), aber desto niedriger sind der Umsatz und der BMDO-Gehalt (Abb. 5a und ergänzende Abb. 15). . Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den ungünstigen Reaktivitätsverhältnissen, die zu Gradienten-Copolymeren führen, was zu einer allmählichen Anreicherung von CKA entlang der Copolymerkette führt. Wenn also die Konvertierung geringer ist, ist auch der BMDO-Gehalt geringer. Dies hat direkte Auswirkungen auf die UCST der Copolymere, da das Tcp aufgrund längerer AAm-Sequenzen, die Polymer-Wasser-Wechselwirkungen fördern, zu niedrigeren Temperaturen verschoben wurde (von ~23 auf ~12 °C, gemessen durch Transmission und DLS) (Abb . 5b und c).

a Entwicklung der SEC-Chromatogramme von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren mit dem angestrebten durchschnittlichen Polymerisationsgrad (DPn, th); b Variation der Lösungsdurchlässigkeit gegenüber der Temperatur der Lösung der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P13 und P18–P19 in Wasser bei 10 mg mL−1 beim Abkühlen (1 °C min−1); c Variation des Intensitätsdurchschnittsdurchmessers (Dz) von DLS über der Temperatur der P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P13 und P18–P19 in Lösung in Wasser (10 mg mL−1) beim Abkühlen (1 °C min−1). ) während des Temperaturwechsels; d Variation der Lösungsdurchlässigkeit gegenüber der Temperatur von P(AAm-co-BMDO) P13 bei unterschiedlichen Konzentrationen in Wasser, d. h. 1, 2,5, 5 und 10 mg mL−1 beim Abkühlen (1 °C min−1).

Anschließend wurde die Abhängigkeit des UCST von der Copolymerkonzentration untersucht, indem der Tcp wässriger Lösungen von P(AAm-co-BMDO) P13 bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 1 bis 10 mg mL−1 gemessen wurde (Abb. 5d). Ähnlich wie bei nicht abbaubaren AAm-basierten UCST-Copolymeren35,43,44 nahm der Tcp mit der Copolymerverdünnung allmählich ab (von 25 °C bei 10 mg mL−1 auf 20 °C bei 2,5 mg mL−1), bis das Copolymer verloren ging sein UCST bei 1 mg mL−1. Bei niedriger Copolymerkonzentration waren die intra- und intermolekularen hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Copolymer und Copolymer im Vergleich zu hydrophilen Wechselwirkungen zwischen Copolymer und Wasser weniger begünstigt, was zu niedrigeren Tcp-Werten führte.

Insgesamt bot die gezielte Ausrichtung auf unterschiedliche DPn bei einem festen fBMDO,0-Wert und die Variation der Copolymerkonzentration unabhängig voneinander auch die Möglichkeit, die thermische Reaktion von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren anzupassen.

Der Abbau von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren wurde dann unter drei verschiedenen Bedingungen bewertet: (i) hydrolytischer Abbau unter beschleunigten Bedingungen (5 Gew.-% KOH, RT); (ii) hydrolytischer Abbau unter physiologischen Bedingungen (PBS, pH 7,4, 37 °C) und (iii) enzymatischer Abbau unter Verwendung von Lipasen (Candida antartica, PBS, pH 7,4, 37 °C) (Ergänzungstabelle 3).

Aufgrund ihrer höheren Anteile in ringgeöffnetem BMDO als in ihren MPDL-haltigen Gegenstücken bei ähnlichen Zusammensetzungen war der Abbau von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren unter beschleunigten Bedingungen viel ausgeprägter, wie die signifikanten Verschiebungen der SEC-Spuren in Richtung zeigten niedrigeres Mn auch für Copolymere mit niedrigem BMDO-Gehalt (Tabelle 2 und ergänzende Abbildungen 16 und 17). Tatsächlich führten 1,7 Mol-% BMDO bereits zu einer 45-prozentigen Abnahme von Mn (P10), und bei höheren FBMDO-Werten wurden sehr starke Verschlechterungen bis zu einer 90-prozentigen Abnahme von Mn beobachtet, mit einer recht guten Übereinstimmung mit den vorhergesagten Werten. 1H-NMR zeigte das nahezu vollständige Verschwinden der Peakeigenschaften des Protons h bei 4,9–5,2 ppm in der Alpha-Position zur Estergruppe von BMDO und bestätigte damit die Abspaltung der Estergruppen (ergänzende Abbildung 18).

Bemerkenswerterweise zeigten alle P(AAm-co-BMDO)-Copolymere unter physiologischen Bedingungen einen extrem schnellen hydrolytischen Abbau, unabhängig davon, ob sie vollständig wasserlöslich (P10–P12) oder wärmeempfindlich mit einem UCST unter (P13) oder über 37 °C (P17) waren ). Die nur durch den BMDO-Gehalt bedingte Abnahme des Mn lag bereits nach 24 Stunden im Bereich von 21–58 % und nach 7 Tagen im Bereich von 43–67 % (Abb. 6a, b). Die Homogenität der Abbauprodukte wurde auch durch die homogenen Verschiebungen der SEC-Chromatogramme und die konstante Dispersität der Abbauprodukte im Zeitverlauf nachgewiesen, mit Ausnahme von P8, das die höchste Menge an MDO aufweist (FMDO = 0,44) (ergänzende Abbildung 19). Diese Abbaukinetik war nicht nur viel schneller als die aller bisher berichteten CKA-haltigen Vinylcopolymere (siehe ergänzende Abbildung 20 zum Vergleich mit der Literatur), sondern sie war auch schneller als die von herkömmlichen aliphatischen Polyestern wie PLA und sogar PLGA unten die gleichen Bedingungen (Abb. 6b und ergänzende Abb. 21), was für Vinylcopolymere beispiellos ist. Wenn man bedenkt, dass andere CKA-haltige hydrophile Copolymere (z. B. P(OEGMA-co-MPDL), P(GMA-co-BMDO))19,20 unter physiologischen Bedingungen einen viel langsameren hydrolytischen Abbau zeigen als die AAm-Gegenstücke, unterstreicht dies das Entscheidende Rolle von AAm beim sehr schnellen hydrolytischen Abbau von P(AAm-co-CKA)-Copolymeren. Dies ist wahrscheinlich auf die sehr hohe Hydrophilie der AAm-Einheiten zurückzuführen, die zu einer optimalen Wasseraufnahme und einer effizienten Solvatisierung der Estergruppen führt. Diese Ergebnisse stellen eine wichtige Errungenschaft dar, da es erstmals ein Copolymerisationssystem ermöglichte, den sehr langsamen hydrolytischen Abbau von CKA-haltigen Vinylcopolymeren unter physiologischen Bedingungen zu umgehen und den hydrolytischen Abbau herkömmlicher aliphatischer Polyester zu übertreffen. Interessant ist auch, dass der Abbau auch in entionisiertem Wasser (pH ~ 5,5) erfolgreich durchgeführt wurde und nach nur 3 Tagen zu einer Mn-Abnahme von fast 40 % für P17 führte (Ergänzende Abbildung 22). Diese schnelle Abbaukinetik wurde auch durch UV-Messungen während fünf aufeinanderfolgenden Kühl- und Heizzyklen der P(AAm-co-BMDO)-Copolymer-P13-Lösung in Wasser beobachtet, die über einen Zeitraum von 7 Stunden durchgeführt wurden (ergänzende Abbildung 23). Der gemessene Trübungspunkt wurde vom ersten bis zum fünften Zyklus deutlich beeinflusst, was durch einen Abfall von ~1–2 °C nach jedem Zyklus belegt wurde, wahrscheinlich aufgrund des fortschreitenden Abbaus des Copolymers. Interessanterweise ist eine solche Abstimmung des UCST-Übergangs während des Abbaus ein interessantes zusätzliches Merkmal, das bei Vinylcopolymeren mit Disulfid-30- oder Thioester-34-Bindungen gezeigt wurde, jedoch noch nie zuvor bei CKA-basierten Polymeren.

a Entwicklung der SEC-Chromatogramme zu verschiedenen Zeitpunkten während des hydrolytischen Abbaus in PBS (pH 7,4, 37 °C) von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren (Tabelle 2, P9–P13 und P17) als Funktion von FBMDO: (1) P9 (FBMDO = 0, kein Tcp); (2) P10 (FBMDO = 0,017, kein Tcp); (3) P11 (FBMDO = 0,027, kein Tcp); (4) P12 (FBMDO = 0,068, kein Tcp); (5) P13 (FBMDO = 0,093, Tcp = 25 °C) und (6) P17 (FBMDO = 0,128, Tcp = 52 °C). b Entwicklung der zahlenmittleren Molmasse Mn mit der Zeit während des hydrolytischen Abbaus unter physiologischen Bedingungen (PBS, pH 7,4, T = 37 °C) von: (1) PAAm (P9), P(AAm-co-BMDO) Copolymere P10–P13 und P17 und (2) PLA und PLGA; c Entwicklung des Mn mit der Zeit während des enzymatischen Abbaus mit Lipasen (Candida antartica, PBS, pH 7,4, T = 37 °C) von: (1) PAAm (P9), P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren P13 und P17 und (2) PLA und PLGA.

Interessanterweise zeigten P(AAm-co-MDO)-Copolymere trotz ihrer fehlenden Wärmeempfindlichkeit auch unter physiologischen Bedingungen einen schnellen hydrolytischen Abbau, unabhängig davon, ob sie wasserlöslich (P6) oder wasserunlöslich (P8) waren (Ergänzende Abbildungen 24 und 25). . Ihre Abbaukinetik ähnelte der von P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren mit einer Abnahme des Mn im Bereich von 65–75 % nach 7 Tagen. Diese Ergebnisse erweiterten daher den Anwendungsbereich des AAm/CKA-Copolymerisationssystems, da je nach Art des CKA und seines Gehalts wohldefinierte wasserlösliche, unlösliche oder UCST-Copolymere mit schnellem hydrolytischem Abbau unter physiologischen Bedingungen/Wasser entstehen lässt sich leicht synthetisieren.

PAAm, P(AAm-co-BMDO)-Copolymere P13 und P17 sowie P(AAm-co-MDO)-Copolymere P6 und P8 wurden ebenfalls einem enzymatischen Abbau in PBS bei 37 °C in Gegenwart von Lipasen aus Candida antartica, a, unterzogen Unterklasse der Esterasen. Während das Mn von PAAm über die Zeit konstant blieb, ähnelte die Abbaukinetik von P13 und P17 eher der unter physiologischen Bedingungen und erreichte nach 7 Tagen ~60 % (Abb. 6c und ergänzende Abb. 26). Wir vermuteten jedoch, dass es angesichts des schnellen hydrolytischen Abbaus dieser Copolymere in PBS schwierig war, den Beitrag der Enzyme zu bestimmen, und dass die Abnahme von Mn in Abb. 6c hauptsächlich den Beitrag des hydrolytischen Abbaus widerspiegelte. Bei MDO-haltigen Copolymeren wurde P8 enzymatisch schneller abgebaut als hydrolytisch (insbesondere innerhalb der ersten drei Tage), was wahrscheinlich auf den hohen MDO-Gehalt zurückzuführen ist, während für P6 der gegenteilige Trend zu beobachten war (Ergänzende Abbildungen 27 und 28).

In der Erkenntnis, dass es wichtig ist, die Sicherheit entwickelter Materialien vor jeder biopharmazeutischen Verwendung zu bewerten, wurde eine kleine Bibliothek wasserlöslicher oder UCST-, BMDO-haltiger Copolymere mit variablem BMDO-Gehalt (P9–P14 und P17, FBMDO = 0–0,128, Tabelle 2) und Mn (P13 und P18–P19, Mn, exp = 7,6–10,2 kg mol−1, Ergänzungstabelle 2) wurden an drei repräsentativen gesunden Zelllinien getestet, um mögliche zytotoxische Wirkungen auf der Grundlage von Zelllebensfähigkeitstests und Zellmorphologie zu untersuchen Beobachtungen (Abb. 7 und ergänzende Abbildungen 29–32). Die getesteten Zelllinien waren: (i) Mausfibroblasten (NIH/3T3), eine der am häufigsten verwendeten Fibroblastenzelllinien; (ii) Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC), die hochempfindlich sind und schnell auf äußere Reize reagieren, und (iii) Mausmakrophagen (J774.A1), typische Monozytenzellen, die eine wichtige Rolle bei der Phagozytose spielen45,46.

a Zelllebensfähigkeit (MTT-Assay) nach Inkubation von: (1) NIH/3T3-Zellen; (2) HUVEC-Zellen; und (3) J774.A1-Zellen mit P(AAm-co-BMDO)-Copolymeren als Funktion des BMDO-Gehalts (P9–P14 und P17, Tabelle 2) bei 0,01 und 0,1 mg mL−1. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Absorption behandelter Zellen (n = 3 für jede Bedingung, Fehlerbalken stellen Mittelwert ± SD dar) im Vergleich zu den Werten ausgedrückt, die von unbehandelten Kontrollzellen erhalten wurden; b optische Bilder von NIH/3T3-Zellen (erste Spalte, a–h), HUVEC-Zellen (zweite Spalte, I–P) und J774.A1-Zellen (dritte Spalte, Q–X), aufgenommen durch optische Mikroskopie nach 72-stündiger Behandlung mit P(AAm-co-BMDO)-Copolymere (0,1 mg mL−1): Zeile 1: unbehandelte Zellen; Zeile 2: P9; Zeile 3: P10; Zeile 4: P11; Zeile 5: P12; Zeile 6: P13; Zeile 7: P14; Zeile 8: P17. Maßstabsbalken = 100 μm.

Insgesamt zeigten alle getesteten Copolymere im MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay bei den drei Zelllinien bei 0,01 und 0,1 mg eine hohe Zelllebensfähigkeit (75–100 %). mL−1 (Abb. 7a und ergänzende Abb. 29). Außerdem wurde kein klarer Trend beobachtet, da weder das Vorhandensein oder Fehlen eines UCST-Übergangs noch der BMDO-Gehalt oder der DPn-Bereich die getesteten Zellen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu haben schienen. Darüber hinaus hatte auch die Variation der Übergangstemperatur über einen weiten Wertebereich (Tcp = 12–52 °C) keinen Einfluss auf die Zytotoxizität. Erwähnenswert ist auch, dass die 72-stündige Inkubationszeit mit Zellen (um mindestens zwei Zellverdopplungszeiten für die Durchführung relevanter MTT-Assays zu ermöglichen) in Kombination mit dem schnellen hydrolytischen Abbau der Copolymere darauf hindeutet, dass weder die Ausgangscopolymere noch ihre Abbauprodukte vorhanden waren giftig für die Zellen. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung, da er einen wichtigen Hinweis auf die endgültige Biokompatibilität der Copolymere darstellt.

Beobachtungen der Zellmorphologie nach einer 72-stündigen Inkubation mit den verschiedenen Copolymeren bestätigten die Ergebnisse zur Lebensfähigkeit der Zellen, da im Vergleich zu unbehandelten Zellen oder mit unmodifiziertem PAAm behandelten Zellen keine Hinweise auf toxische Wirkungen festgestellt wurden (Abb. 7b und ergänzende Abb. 30–32). Tatsächlich wurde kein Unterschied in Größe, Form, Zelldichte oder Zellproliferation beobachtet, unabhängig vom Copolymer, seiner Konzentration oder der getesteten Zelllinie.

Diese Zytotoxizitätsstudie legt daher nahe, dass PAAm, das durch die Einführung von BMDO-Einheiten in sein Rückgrat chemisch modifiziert wurde, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Morphologie von drei repräsentativen gesunden Zelllinien nicht beeinträchtigte.

Um die Vielseitigkeit dieses Copolymerisationssystems zu veranschaulichen, wurde das P(AAm-co-BMDO)-Copolymer P13 zunächst erfolgreich mit AAm durch RAFT-Polymerisation bei 70 °C für 2 Stunden kettenverlängert, um ein P(AAm-co-BMDO)-b- zu erzeugen. PAAm-Diblockcopolymer (Mn, exp = 18,2 kg mol−1, Đ = 1,6). Trotz einer leichten Verbreiterung der Dispersität wurde eine allmähliche Verschiebung der SEC-Spuren hin zu höheren Molekulargewichten gezeigt. Sein P(AAm-co-BMDO)-Opferblock wurde dann unter hydrolytischen Bedingungen teilweise abgebaut, um ein Copolymer mit niedrigerem Mn-Gehalt (Mn, exp = 16,1 kg mol−1, Đ = 1,5) zu ergeben, wie durch SEC gezeigt (ergänzende Abbildung 33).

Die makromolekulare Technik wurde dann weiter auf die Synthese von amphiphilen P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA-Diblockcopolymeren zur Anwendung bei der Formulierung abbaubarer, PEGylierter UCST-Nanopartikel zur Arzneimittelabgabe ausgeweitet. Um den effizientesten Syntheseweg zu bestimmen, wurden solche Copolymere durch RAFT in wasserfreiem DMSO bei 70 °C hergestellt, entweder durch: (i) Kettenverlängerung eines POEGMA-Makro-RAFT-Mittels (Mn, exp = 7400 g mol−1, Đ = 1,1) durch eine 50:50-Mischung aus AAm und BMDO (P20) oder (ii) Kettenverlängerung eines P(AAm-co-BMDO)-Makro-RAFT-Agenten (Mn, exp = 4800 g mol−1, Đ = 1,5, FBMDO = 0,069) durch OEGMA (P21) (Ergänzungstabelle 4 und Abb. 8a). In beiden Fällen wurden die gewünschten Diblockcopolymere mit FBMDO ~0,06 und >86 % offenem BMDO erhalten, wie durch 1H-NMR und SEC beurteilt, zusammen mit einer besseren Kontrolle (Đ = 1,3 vs. 1,9), wenn man von einem P(AAm-Co-) ausgeht. BMDO) Makro-RAFT-Agent (P21) (Ergänzende Abbildungen 34 und 35). Wie durch Transmissionsmessungen beobachtet (Ergänzungstabelle 4), behielten beide Copolymere ihre UCST-Eigenschaften erfolgreich bei, wobei sich die Tcp-Werte im Vergleich zu einem ähnlichen P(AAm) leicht zu niedrigeren Werten nahe der Umgebungstemperatur (Tcp ~ 17–20 °C) verschoben -co-BMDO)-Copolymer (P14). Dies ist wahrscheinlich auf den Einfluss des wasserlöslichen POEGMA-Blocks zurückzuführen, wie er bereits bei anderen Systemen beobachtet wurde44. Interessanterweise verlieh das Vorhandensein des POEGMA-Blocks dem Copolymer auch einen LCST-Übergang bei ~73 °C (Abb. 8b), und die drei verschiedenen Löslichkeitszustände können bei Temperaturschwankungen reversibel erreicht werden (Zusatzfilm 1).

a Synthese von amphiphilen POEGMA-bP(AAm-co-BMDO) (P20) und P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA (P21)-Diblockcopolymeren über RAFT-Polymerisation bei 70 °C in wasserfreiem DMSO unter Verwendung von POEGMA oder P( AAm-co-BMDO) jeweils als Makro-CTA; b Variation der Lösungsdurchlässigkeit gegenüber der Temperatur und zugehörige Bilder der Lösung der doppelt thermoresponsiven P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA-Diblockcopolymere P20–P21 in Wasser bei 10 mg mL−1 (1 °C min−1, durchgezogene und gepunktete Linien für Kühlen bzw. Heizen); c schematische Darstellung der Morphologie der doppelt thermoresponsiven P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA-Diblockcopolymer-Nanopartikel bei Temperaturwechsel; d Entwicklung des zahlenmittleren Durchmessers (Dn) der doppelt thermoresponsiven P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA-Diblockcopolymer-Nanopartikel P20 (1) und P21 (2) bei 1,67 mg mL−1 bei T = 40 ° C, 5 °C und 85 °C. e Repräsentatives TEM-Bild mit negativer Färbung der Nanopartikel P20 (siehe ergänzende Abbildungen 39 und 40 für andere TEM-Bilder bzw. Partikelgrößenverteilung). Dieses Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Unter Ausnutzung der UCST-Funktion der Diblockcopolymere wurde ihre Formulierung zu wohldefinierten, abbaubaren Nanopartikeln durch einen organischen, lösungsmittelfreien Nanopräzipitationsprozess ausschließlich aus Wasser in Gegenwart von 0,1 Gew.-% Pluronic als Tensid erreicht. Es bestand aus der Zugabe einer wässrigen Lösung von P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA-Copolymer, hergestellt bei 25 °C (T > UCST), zu einer wässrigen Lösung bei 5 °C (T < UCST) unter Rühren (ergänzende Abbildung). 36). Dieses Nanopräzipitationsverfahren kann daher vollständig in Wasser durchgeführt werden, was im Vergleich zur klassischen Nanopräzipitationstechnik, die die Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (z. B. Aceton, Tetrahydrofuran (THF) usw.) erfordert, das häufig entfernt werden muss, sehr vorteilhaft ist unvollständig. DLS-Messungen ergaben, dass in beiden Fällen wohldefinierte Nanopartikel mit durchschnittlichen Durchmessern von ~200 nm und engen Partikelgrößenverteilungen erhalten wurden (Ergänzungstabelle 4). Es wurde gezeigt, dass die Bildung und die kolloidalen Eigenschaften der Nanopartikel reversibel sind, wenn die Temperatur zwischen 5 °C (unlöslicher Zustand, T < UCST, Nanopartikel mit P(AAm-co-BMDO)-Kern) und 40 °C (löslicher Zustand, UCST <) schwankt T LCST, Nanopartikel mit POEGMA-Kern) bis zu mindestens drei aufeinanderfolgenden Zyklen (Abb. 8c, d und ergänzende Abb. 37 und 38), was zu abbaubarem, doppelt wärmeempfindlichem führt47 ,48 Copolymer-Nanopartikel. Diese Variationen der durchschnittlichen Anzahl-, Intensitäts- und Volumendurchmesser (Ergänzende Abbildungen 37 und 38) bestätigten die unterschiedlichen Übergänge, die durch UV-Messungen beobachtet wurden. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse bestätigte die Bildung kugelförmiger und eng verteilter Nanopartikel (Abb. 8e und ergänzende Abb. 39 und 40), die Durchmesser im Bereich von 60–80 nm aufwiesen, was den Durchmessern im trockenen Zustand entspricht.

Die Entwicklung ihrer kolloidalen Eigenschaften wurde durch DLS bei Lagerung bei 37 ° C und 4 ° C überwacht (ergänzende Abbildung 41). Nach 3 Tagen bei Körpertemperatur wurde ein starker Rückgang des durchschnittlichen Durchmessers von 180 nm auf 50 nm beobachtet, was auf ihren Zerfall hinweist (wahrscheinlich durch gleichzeitige Zerlegung und hydrolytischen Abbau). Andererseits blieb ihr durchschnittlicher Durchmesser bei 4 °C während der Lagerung aufgrund einer Verlangsamung des Abbauprozesses (aber nicht dessen Stoppen, wie die Zunahme der Partikelgrößenverteilung zeigt) nahezu konstant.

Um das Feld der Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern, wurde der UCST-Übergang auch nahe an die Körpertemperatur angepasst, indem einfach die POEGMA-Kettenlänge und die Zusammensetzung des P(AAm-co-BMDO)-Blocks angepasst wurden. Dies wurde erreicht, indem ein kürzeres POEGMA-Makro-CTA (Mn, exp = 3200 g mol−1, Đ = 1,33) angestrebt wurde, um höhere UCST-Werte zu fördern, gefolgt von einer Kettenverlängerung mit AAm/BMDO (fBMDO,0 = 0,55). um ein endgültiges Mn zu erhalten, exp = 7700 g mol−1; Đ = 1,5, mit FBMDO = 0,126 (Ergänzungstabelle 5). Dieses Copolymer (P22) zeigte einen UCST-Übergang im Bereich von 40–42 °C, wie durch Transmissions- und DLS-Messungen gezeigt wurde (ergänzende Abbildungen 42 und 43), der für eine milde Hyperthermietherapie relevant sein könnte. Interessanterweise wurde während des Abbaus unter physiologischen Bedingungen eine fortschreitende Verschiebung seines Tcp zu niedrigeren Werten beobachtet, bis er 16 Tage lang 3 ° C erreichte (ergänzende Abbildung 44).

In dieser Studie haben wir entdeckt, dass die RAFT-vermittelte rROP von AAm mit verschiedenen CKAs (MPDL, BMDO und MDO) einen direkten Weg zur Synthese einer breiten Palette meist wohldefinierter P(AAm-co-CKA)-Copolymere darstellt zeigte unter physiologischen Bedingungen (PBS, pH 7,4, 37 °C) einen schnellen und einstellbaren Abbau, der sogar den von PLA und sogar PLGA unter den gleichen Bedingungen übertraf. Mit CKAs, die aromatische Ringe enthalten, zeigten die resultierenden Copolymere sogar einstellbare und scharfe UCST-Übergänge im Bereich von ~10–50 °C, was für Anwendungen zur Arzneimittelabgabe von großem Interesse sein könnte. Der UCST-Übergang konnte einfach und unabhängig angepasst werden, indem der CKA-Gehalt im Copolymer, die Copolymerkonzentration und der angestrebte durchschnittliche Polymerisationsgrad modifiziert wurden. Da die Copolymerisation sowohl auf MDO als auch auf MPDL/BMDO erfolgreich angewendet werden konnte, kann der Abbau somit von der Thermosensitivität entkoppelt werden, was je nach angestrebter Anwendung ebenfalls von Vorteil ist. Darüber hinaus zeigten vorläufige Zelllebensfähigkeitstests, dass sie eine gute Zytokompatibilität bei drei verschiedenen repräsentativen gesunden Zelllinien aufwiesen, was ein wichtiges Ergebnis im Hinblick auf biomedizinische Anwendungen darstellt.

Um die Robustheit und die breite Anwendbarkeit dieses Syntheseansatzes zu demonstrieren, wurden POEGMA-bP(AAm-co-CKA)-Diblockcopolymere synthetisiert, deren UCST ihre Formulierung durch ein innovatives Allwasser-Nanopräzipitationsverfahren ermöglichte, das den Einsatz organischer Lösungsmittel vermeidete. in eng verteilte Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 200 nm, die für Anwendungen zur Arzneimittelabgabe geeignet sind. Aufgrund der LCST des POEGMA-Blocks zeigten diese Nanopartikel sogar sowohl UCST- als auch LCST-Übergänge und können als erstes Beispiel für doppelt wärmeempfindliche, abbaubare Nanopartikel angesehen werden.

Unter Berücksichtigung aller wichtigen Merkmale und Vorteile glauben wir, dass dieses Zwei-in-eins-Copolymerisationssystem, bei dem das CKA sowohl effiziente Abbaubarkeit als auch Wärmeempfindlichkeit verleiht, zu sehr nützlichen makromolekularen Bausteinen führen könnte, die das derzeitige und etwas begrenzte Arsenal von erheblich erweitern würden abbaubare Materialien. Es kann daher spannende Perspektiven für ein breites Spektrum unterschiedlicher Anwendungen bieten, die vom Abbau hydrophiler Materialien auf Kunststoffbasis wie PAAm, einem Schlüsselpolymer in diesem Bereich49, bis hin zur durch Hyperthermie vermittelten Arzneimittelabgabe und Gewebezüchtung reichen.

Die zyklischen Ketenacetale MPDL, BMDO und MDO wurden unter Verwendung zyklischer Bromacetale als Zwischenprodukte hergestellt50. CDSPA (97 %), AAm (≥99 %), AIBN (98 %), wasserfreies DMSO (≥99,9 %), wasserfreies Acetonitril (≥99,9 %), Dubbelcos Phosphate Buffer Saline (PBS), geeignet für Zellkultur, Lipasen B von Candida antartica immobilisiert auf Immobead 150 (4584 U g−1), OEGMA (Mn = 300 g mol−1), Poly(d,l-lactid-co-glycolid) säureterminiert (Resomer® RG 502 H, PLGA, Mw = 7.000–17.000 g mol−1), säureterminiertes Poly(d,l-lactid) (Resomer® R 202 S, PLA, Mw = 10.000–18.000 g mol−1) und KOH (90 %) wurden von Sigma-Aldrich bezogen . Methanol (HPLC-Analysequalität) und Diethylether (HPLC-Analysequalität) wurden von Carlo Erba bezogen. THF (HPLC-Qualität) wurde von VWR Chemicals bezogen. DMSO-d6 wurde von Eurisotop bezogen. Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden wie erhalten verwendet, mit Ausnahme von AIBN, das durch Umkristallisation in Methanol gereinigt wurde, und AAm, das in Chloroform umkristallisiert wurde.

Die NMR-Spektroskopie wurde in Röhrchen mit 5 mm Durchmesser in DMSO-d6 bei 25 °C durchgeführt. Die 1H-NMR-Spektroskopie wurde auf einem Bruker Avance 300-Spektrometer bei 300 MHz durchgeführt. Die chemische Verschiebungsskala wurde basierend auf den internen Lösungsmittelsignalen kalibriert (δ = 2,50 ppm für DMSO-d6). Die Daten wurden mit der Software MestReNova 11.0.4 verarbeitet.

SEC wurde bei 60 °C unter Verwendung von zwei in Reihe geschalteten Säulen von Agilent Technologies (PL PolarGel-M, 300 × 7,5 mm; Perlendurchmesser 8 µm; Molmassenbereich 1000–5.00.000 g mol−1) durchgeführt, denen eine Vorsäule von vorgeschaltet war Agilent Technologies (PL PolarGel-M, 7,5 × 50 mm; Perlendurchmesser 8 µm) und ein Dreifach-Detektionssystem (Viscotek TDA/GPCmax von Malvern) mit einem Differentialbrechungsindexdetektor, Detektoren für niedrige und rechtwinklige Lichtstreuung und einem Differentialviskosimeter Detektor. Der Eluent war DMSO mit 100 mM LiBr und 0,36 Gew.-% 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) als Marker bei einer Flussrate von 0,7 ml/min. Das System wurde unter Verwendung von Poly(methylmethacrylat) (PMMA)-Standards (Peakmolmassen, Mp = 540–342.900 g mol−1) von Agilent Technologies kalibriert. Dies ermöglichte die Bestimmung der zahlenmittleren Molmasse (Mn), der gewichtsmittleren Molmasse (Mw) und der Dispersität (Ð = Mw/Mn). Alle Proben wurden vor der Injektion über 0,22 µm PTFE-Filter filtriert. Die Daten wurden mit der OmniSEC 4.0-Software gesammelt und verarbeitet.

Die Lichtdurchlässigkeit (%) der Proben wurde mit einem Lambda 25 UV/VIS-Spektrometer, ausgestattet mit einem PTP 1 + 1 Peltier-System zur Temperaturkontrolle (PerkinElmer), bei einer Wellenlänge von 500 nm, einer Zellweglänge von 10 mm und unter magnetischem Einfluss gemessen rühren. Die Proben wurden mit 10 mg mL−1 in entionisiertem Wasser zubereitet und in eine Quarzküvette gegeben. Die Messungen wurden durchgeführt, indem die Lösung zunächst mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1 °C min−1 von der verwendeten höchsten Temperatur (T >> UCST) abgekühlt wurde und anschließend mit der gleichen Geschwindigkeit wieder auf die Ausgangstemperatur erhitzt wurde. Der Wendepunkt der Transmissionskurve wurde als UCST-Trübungspunkt betrachtet. Sie wurde grafisch durch das Maximum der ersten Ableitung der Kühl-/Heizkurven bestimmt. Die Daten wurden mit der Software Winlab 6.0.3.0730 gesammelt und mit der Software Data Processor and Viewer (DPV) 1.00.100.0010 verarbeitet.

Die Intensitätsdurchschnittsdurchmesser (Dz) und Partikelgrößenverteilungen von Nanopartikeln wurden durch DLS mit einem Nano ZS von Malvern gemessen, der mit einem 4 mW He-Ne-Laser (633 nm Wellenlänge) bei einem festen Streuwinkel von 173° ausgestattet war. Ähnlich wie bei UV-Vis-Messungen wurden Proben mit 10 mg mL−1 vorbereitet und in eine Quarzküvette gegeben. Die Kühl-/Heizmessungen wurden in einem Intervall von 1 °C beginnend bei T >> UCST durchgeführt und die Lösung wurde vor den Messungen 60 s lang bei jeder Temperatur äquilibriert. Der Wendepunkt der Intensitätsdurchschnittsdurchmesserkurve wurde als Trübungspunkt (UCST) betrachtet. Sie wurde grafisch durch das Maximum der ersten Ableitung der Kühl-/Heizkurven bestimmt. Die Daten wurden mit der Software Malvern-Zetasizer 7.12 verarbeitet.

Optische Bilder der Copolymerlösung in Wasser wurden mit einem Leitz Diaplan-Mikroskop aufgenommen, das mit einer Coolsnap ES-Kamera (Roper Scientific) ausgestattet war. Die Proben für die optische Mikroskopie wurden vorbereitet, indem vor der Untersuchung ein Tropfen der Copolymerlösung (10 mg mL−1) bei T < UCST und T > UCST auf einen Objektträger aus Glas gegeben wurde. Die Daten wurden mit der Software RS Image V1.9.2 gesammelt und verarbeitet.

Die Gitter glühten und waren vor der Verwendung entladen. 5 μL Nanopartikelsuspensionen (1,67 mg mL−1), die bei 4 °C gehalten wurden, wurden 5 Minuten lang auf Kupfergittern abgeschieden, die mit einem Formvar-Kohlenstofffilm bedeckt waren. Die überschüssige Lösung wurde mit Filterpapier abgetupft. Die Proben wurden dann 30 s lang mit Phosphorwolframsäure (2 %, w/v) gefärbt und ebenfalls bei 4 °C gelagert. Anschließend wurde die überschüssige Lösung mit Filterpapier entfernt. Anschließend wurden die Netze mit einem JEOL JEM-1400 bei 80 kV analysiert. Die Bilder wurden mit einer Orius-Kamera (Gatan Inc, USA) aufgenommen. Die Daten wurden mit der Software Zen 2.6 (Blue Edition) gesammelt und verarbeitet. Die Größen wurden mit ImageJ 1.53a gemessen.

Ein typisches Verfahren (P2, Tabelle 1) ist wie folgt: In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wird eine Mischung aus AAm (120 Äquivalente, 4,8 mmol, 0,34 g) und MPDL (fMPDL, 0 = 0,4, 80 Äquivalente, 3,2 mmol, 0,52 g (Gesamtmol = 8 mmol), CDSPA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 16,1 mg) und AIBN (0,6 Äquivalente, 0,024 mmol, 3,9 mg) wurden darin gelöst wasserfreies DMSO (1 ml). Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 16 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem Methanol wie folgt ausgefällt: Die Reaktionsmischung wurde zunächst tropfenweise in 50 ml kaltes Methanol gegeben und 10 Minuten lang bei 10 °C und 15.000 × g zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der flüssigen Fraktion wurden 50 ml kaltes Methanol zugegeben und das Copolymer in einem Ultraschallbad suspendiert. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und der Vorgang noch einmal wiederholt. Das erhaltene P(AAm-co-MPDL) wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das gleiche Verfahren wurde wie folgt für P0 [fMPDL,0 = 0, AAm (200 Äquivalente, 8 mmol, 0,57 g)], P1 [fMPDL,0 = 0,2, MPDL (40 Äquivalente, 1,6 mmol, 0,26 g)) angepasst. , AAm (160 Äquivalente, 6,4 mmol, 0,45 g)], P3 [fMPDL,0 = 0,6, MPDL (120 Äquivalente, 4,8 mmol, 0,78 g), AAm (80 Äquivalente, 3,2 mmol, 0,23 g)] und P4 [fMPDL,0 = 0,8, MPDL (160 Äquivalente, 6,4 mmol, 1,04 g), AAm (40 Äquivalente, 1,6 mmol, 0,11 g)].

Ein typisches Verfahren (P6, Tabelle 1) ist wie folgt: In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wird eine Mischung aus AAm (120 Äquivalente, 4,8 mmol, 0,34 g) und MDO (80 Äquivalente) gegeben ., 3,2 mmol, 0,37 g) (Gesamtmol = 8 mmol), CDSPA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 16,1 mg) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,024 mmol, 3,9 mg) wurden in wasserfreiem DMSO (1 ml) gelöst. . Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 16 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem Methanol ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das gleiche Verfahren wurde wie folgt für P5 [fMDO,0 = 0,2, MDO (40 Äquivalente, 1,6 mmol, 0,18 g), AAm (160 Äquivalente, 6,4 mmol, 0,45 g)], P7 [fMDO,0 = 0,6] angepasst , MDO (120 Äquivalente, 4,8 mmol, 0,55 g), AAm (80 Äquivalente, 3,2 mmol, 0,23 g)] und P8 [fMDO,0 = 0,8, MDO (160 Äquivalente, 6,4 mmol, 0,73 g), AAm (40 Äquivalente, 1,6 mmol, 0,11 g)].

Ein typisches Verfahren (P13, Tabelle 2) ist wie folgt: In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wird eine Mischung aus AAm (120 Äq., 4,8 mmol, 0,34 g) und BMDO (80 Äq ., 3,2 mmol, 0,52 g) (Gesamtmol = 8 mmol), CDSPA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 16,1 mg) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,024 mmol, 3,9 mg) wurden in wasserfreiem DMSO (10 ml) gelöst. . Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 16 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem Methanol ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das erhaltene P(AAm-co-BMDO) wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das gleiche Verfahren wurde wie folgt für P9 [fBMDO,0 = 0, AAm (200 Äquivalente, 8 mmol, 0,57 g)], P10 [fBMDO,0 = 0,2, BMDO (40 Äquivalente, 1,6 mmol, 0,26 g)) angepasst. , AAm (160 Äq., 6,4 mmol, 0,45 g)], P11 [fBMDO,0 = 0,3, BMDO (60 Äq., 2,4 mmol, 0,39 g), AAm (140 Äq., 5,6 mmol, 0,4 g)], P12 [fBMDO,0 = 0,35, BMDO (70 Äq., 2,8 mmol, 0,45 g), AAm (130 Äq., 5,2 mmol, 0,37 g)], P14 [fBMDO,0 = 0,5, BMDO (100 Äq., 4 mmol, 0,65 g), AAm (100 Äq., 4 mmol, 0,28 g)], P15 [fBMDO,0 = 0,51, BMDO (102 Äq., 4,1 mmol, 0,66 g), AAm (98 Äq., 3,9 mmol, 0,28 g)], P16 [fBMDO,0 = 0,53, BMDO (106 Äq., 4,2 mmol, 0,69 g), AAm (94 Äq., 3,8 mmol, 0,27 g)] und P17 [fBMDO,0 = 0,55, BMDO ( 110 Äquivalente, 4,4 mmol, 0,71 g), AAm (90 Äquivalente, 3,6 mmol, 0,26 g)]. Hinweis: P9–P13 wurden in kaltem Methanol ausgefällt; P14–P16 wurden in kaltem THF und P17 in kaltem Diethylether ausgefällt.

Das gleiche Verfahren wurde auch wie folgt für P18 [fBMDO,0 = 0,4, BMDO (160 Äq., 3,2 mmol, 0,52 g), AAm (240 Äq., 4,8 mmol, 0,34 g), CDSPA (1 Äq., 0,02 g) angepasst mmol, 8,1 mg) und AIBN (0,6 Äq., 0,012 mmol, 2 mg)] und P19 [fBMDO,0 = 0,4, BMDO (240 Äq., 3,2 mmol, 0,52 g), AAm (360 Äq., 4,8 mmol, 0,34 g), CDSPA (1 Äquivalent, 0,013 mmol, 5,4 mg) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,008 mmol, 1,3 mg)].

P(AAm-co-BMDO) P13 (Tabelle 2, Mn, exp = 7600 g mol−1, Đ = 1,4, FBMDO = 0,093) wurde wie folgt mit AAm kettenverlängert: in einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem Magnetrührstab, einer Mischung aus AAm (200 Äq., 8,0 mmol, 0,57 g), P(AAm-co-BMDO) P13 (1 Äq., 0,04 mmol, 0,3 g) und AIBN (0,6 Äq., 0,024). mmol, 3,9 mg) wurde in wasserfreiem DMSO (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 2 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem Methanol ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das erhaltene P(AAm-co-BMDO)-b-PAAm wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Eine typische Synthese von POEGMA23-Makro-CTA wurde wie folgt durchgeführt: In einem vorgetrockneten 50-ml-Rundkolben, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem Magnetrührstab, wurde eine Mischung aus OEGMA (3,68 g, 0,012 Mol), CDSPA (1 0,24 mmol, 0,097 g) und AIBN (0,25 Äquivalente, 0,059 mmol, 9,6 mg) wurden in wasserfreiem Acetonitril (25 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 5 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Acetonitril wurde entfernt und die resultierende Polymerlösung wurde einmal im Überschuss einer kalten Mischung aus 1:1 Diethylether und Benzin ausgefällt. Das erhaltene POEGMA23-Makro-CTA (Mn, exp = 7400 g mol−1, Đ = 1,1) wurde anschließend im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

POEGMA23 (Mn, exp = 7400 g mol−1, Đ = 1,1) wurde als Makro-RAFT-Mittel verwendet, um AAm und BMDO (fBMDO,0 = 0,5) zu polymerisieren und POEGMA-bP(AAm-co-BMDO)-Diblockcopolymer zu ergeben (P20, Ergänzungstabelle 4). In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wird eine Mischung aus AAm (100 Äquivalente, 4,0 mmol, 0,28 g) und BMDO (100 Äquivalente, 4,0 mmol, 0,65 g) (Gesamtmolzahl = 8) gegeben mmol), POEGMA23-Makro-CTA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 0,64 g) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,024 mmol, 3,9 mg) wurden in wasserfreiem DMSO (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 16 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem THF ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das erhaltene POEGMA-bP(AAm-co-BMDO) wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Für die Synthese von P22 wurde mit einigen Modifikationen ein identisches Verfahren befolgt: POEGMA (Mn, exp = 3200 g mol−1, Đ = 1,33) wurde als Makro-RAFT-Mittel zur Polymerisation von AAm und BMDO (fBMDO,0 = 0,55) verwendet. und ergibt POEGMA-bP(AAm-co-BMDO)-Diblockcopolymer (P22, Ergänzungstabelle 5). In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wurde eine Mischung aus AAm (90 Äquivalente, 3,6 mmol, 0,256 g) und BMDO (110 Äquivalente, 4,4 mmol, 0,714 g) (Gesamtmol = 8) gegeben mmol), POEGMA Macro-CTA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 0,128 g) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,024 mmol, 3,9 mg) wurden in wasserfreiem DMSO (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 16 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem Diethylether ausgefällt und dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Eine typische Synthese von P(AAm-co-BMDO)-Makro-CTA (fBMDO,0 = 0,5) wurde wie folgt durchgeführt: In einem 40-ml-Fläschchen, ausgestattet mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab, wurde eine Mischung aus AAm (100 Äquivalent, 4,0 mmol, 0,28 g) und BMDO (100 Äquivalent, 4,0 mmol, 0,65 g) (Gesamtmol = 8 mmol), CDSPA (1 Äquivalent, 0,04 mmol, 16,1 mg) und AIBN (0,6 Äquivalent, 0,024). mmol, 3,9 mg) wurde in wasserfreiem DMSO (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 8 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem THF ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das erhaltene P(AAm-co-BMDO)-Makro-CTA (Mn, exp = 4800 g mol−1, Đ = 1,5, FBMDO = 0,069) wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

P(AAm-co-BMDO) (Mn, exp = 4800 g mol−1, Đ = 1,5, FBMDO = 0,069) wurde als Makro-RAFT-Mittel verwendet, um OEGMA zu polymerisieren und P(AAm-co-BMDO)-b zu ergeben -POEGMA-Diblockcopolymer (P21, Ergänzungstabelle 4). In einem 40-ml-Fläschchen, das mit einem Gummiseptum und einem magnetischen Rührstab ausgestattet ist, wird eine Mischung aus OEGMA (40 Äq., 250 µmol, 75 mg), P(AAm-co-BMDO)-Makro-CTA (1 Äq., 6,25 g) gegeben µmol, 26 mg) und AIBN (0,6 Äq., 3,7 µmol, 0,6 mg) wurden in wasserfreiem DMSO (4,5 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit trockenem Argon durchströmt, um gelösten Sauerstoff zu entfernen, und dann 5 Stunden lang in ein vorgeheiztes Ölbad bei 70 °C getaucht. Die Lösung wurde dann schnell an der Luft abgekühlt. Das Copolymer wurde dann dreimal in kaltem THF ausgefällt, wobei ein ähnliches Verfahren wie oben für die Synthese von P0–P4 angewendet wurde. Das erhaltene P(AAm-co-BMDO)-b-POEGMA wurde dann im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

In einem 20-ml-Fläschchen mit Magnetrührer wurden 50 mg des gewünschten Copolymers in 2,5 ml entionisiertem Wasser bei 30 °C gelöst/dispergiert. Nach der Ultraschallbehandlung und der vollständigen Solubilisierung/Dispergierung wurden 2,5 ml Kaliumhydroxidlösung (5 Gew.-%) in entionisiertem Wasser hinzugefügt. Die Mischung wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Lösung zu diesem Zeitpunkt vollständig transparent wurde. Die Lösung wurde dann durch Zugabe einer wässrigen HCl-Lösung (1 m) gequencht. Die resultierende Lösung wurde dann über Nacht gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver zu ergeben. Das abgebaute Produkt wurde dann durch SEC-Chromatographie analysiert.

In einem 7-ml-Fläschchen wurden 20 mg des gewünschten Copolymers in 2 ml PBS (pH 7,4) oder entionisiertem Wasser gelöst/dispergiert und die Lösung in einem auf 150 U/min eingestellten und thermostatisierten Orbitalschüttelofen (IKA KS4000i-Steuerung) mechanisch gerührt bei 37 °C. In bestimmten Zeitintervallen (dh 1, 3 und 7 Tage) wurden Proben von 0,5 ml entnommen und gefriergetrocknet. Die Abbauprodukte wurden dann mittels SEC analysiert.

In einem 7-ml-Fläschchen wurden 20 mg des gewünschten Copolymers in 2 ml PBS (pH 7,4) gelöst/dispergiert, das immobilisierte Lipase aus Candida antartica (100 U ml−1) enthielt, und die Lösung wurde mechanisch in einem Orbitalschüttelofen gerührt ( IKA KS4000i-Steuerung) auf 150 U/min eingestellt und auf 37 °C thermostatisiert. In bestimmten Zeitintervallen (dh 1, 3 und 7 Tage) wurden Proben von 0,5 ml entnommen, zur Entfernung des Enzyms filtriert und gefriergetrocknet. Die Abbauprodukte wurden dann mittels SEC analysiert.

POEGMA-bP(AAm-co-BMDO)-Nanopartikel (1,67 mg mL−1) wurden durch Nanopräzipitation wie folgt hergestellt. POEGMA-bP(AAm-co-BMDO)-Diblockcopolymere wurden zunächst in entionisiertem Wasser gelöst, das über unsterile hydrophile 0,22 µm Polyethersulfon (PES)-Filter (10 mg mL−1) vorfiltriert wurde, bei 25 °C (T > UCST). Anschließend wurden 1,0 ml der Copolymerlösung tropfenweise in ein 20-ml-Glasfläschchen injiziert, das mit 5 ml entionisiertem Wasser vorgefüllt und über unsterile hydrophile 0,22-µm-PES-Filter mit 0,1 Gew.-% Pluronic F68 vorfiltriert war, unter ständigem Rühren (500 U/min) bei 5 °C (T < UCST).

HUVEC, embryonale Maus-Fibroblasten (NIH/3T3) und Maus-Makrophagen-Monozyten-Zellen (J774.A1) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben und wie empfohlen aufbewahrt. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Gibco gekauft, Penicillin-Streptomycin-stabilisierte Lösung, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und RPMI-1640-Medium wurden von Sigma-Aldrich gekauft und wie erhalten verwendet. J774.A1-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI) 1640, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (50 U ml–1) und Streptomycin (50 U ml–1), gezüchtet. NIH/3T3- und HUVEC-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (50 U ml–1) und Streptomycin (50 U ml–1), gezüchtet. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten.

MTT wurde von Sigma-Aldrich gekauft und wie erhalten verwendet. Die getrockneten Copolymere (P9–P14 und P17) wurden gewogen und mit dem geeigneten Medium solubilisiert, um die gewünschten Konzentrationen in sterilisierten 10-ml-Flakonröhrchen zu erreichen. Die Proben P9–P14 wurden direkt in einem Wasserbad bei 37 °C für mindestens 10 Minuten erwärmt, während die Wasserbadtemperatur für Probe P17 auf 50 °C eingestellt wurde. Die solubilisierten Proben wurden dann vor der Verwendung durch sterilisierte Filter (0,22 µm, Minisart®) filtriert. In Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (TPP, Schweiz) wurden Zellen ausgesät (HUVEC: 2 × 104 Zellen ml–1, NIH/3T3: 4 × 104 Zellen ml–1, J774.A1: 2 × 104 Zellen ml–1) in 100 μL Wachstumsmedium und 24 Stunden im Inkubator vorinkubiert (37 °C und 5 % CO2). Nach entsprechenden Verdünnungen wurden 100 μl Copolymerlösung in Zellkulturmedium (0,01 und 0,1 mg mL−1) zu den Zellen gegeben und 72 Stunden lang inkubiert. Eine MTT-Lösung (5 mg mL−1) wurde mit PBS hergestellt und mit Sterilfiltern (0,2 µm) filtriert. Am Ende der Inkubationszeit wurden 20 µL MTT-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Nach der Inkubation (1 Stunde für HUVEC- und J774.A1-Zellen, 1,5 Stunden für NIH/3T3-Zellen) wurde das Medium entfernt und dann 200 μl DMSO in jede Vertiefung gegeben, um die Formazankristalle aufzulösen. Die Absorption wurde dann mit einem Mikroplattenlesegerät (LAB Systems Original Multiscan MS) bei 570 nm gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Absorptionsverhältnis zwischen behandelten und unbehandelten Kontrollzellen berechnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt, um Mittelwerte und SD zu bestimmen.

Die Zellen wurden in 100 μl Wachstumsmedium ausgesät und 24 Stunden lang in einem Inkubator (37 °C und 5 % CO2) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen vorinkubiert. Für Copolymere wurde das gleiche Verfahren wie im Abschnitt Zelllebensfähigkeitstest angewendet. 100 μl Copolymerlösung in Zellkulturmedium (0,01 und 0,1 mg mL−1) mit angepasster Konzentration wurden über die Zellen gegeben. Die Zellmorphologie wurde direkt nach 72-stündiger Inkubation mit einem Umkehrmikroskop AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Deutschland) beobachtet, das mit einem XL-Inkubator mit 37 °C und einer CoolSnap-HQ2-Kamera mit ladungsgekoppeltem Gerät (CCD) (6,45 µm Pixelgröße; Photometrics) ausgestattet war , Tucson, USA) und einem Achroplan 4×/0,10 NA Trockenobjektiv im Hellfeldmodus (TL-Halogenlampe). Numerische 12-Bit-Bilder wurden mit der Software Zen 2.6 (Blue Edition) erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten und analysierten Daten sind in diesem Artikel und seinen Zusatzinformationen enthalten und auf Anfrage auch beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

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Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (Grant Agreement Nr. 771829). Wir danken dem China Scholarship Council (CSC) Ph.D. Stipendium (2017–2021) von CZ Dem CNRS und der Universität Paris-Saclay danken wir ebenfalls für die finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Claire Boulogne und Cynthia Gillet (I2BC, Gif-sur-Yvette, Frankreich) für die technische Unterstützung bei TEM.

Universität Paris-Saclay, CNRS, Institut Galien Paris-Saclay, 92296, Châtenay-Malabry, Frankreich

Amaury Bossion, Chen Zhu, Léa Guerassimoff, Julie Mougin und Julien Nicolas

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JN konzipierte und gestaltete die Forschung. JN, AB, CZ und LG haben die Experimente entworfen. AB, CZ, LG und JM führten die Experimente durch und analysierten die Daten. JN und AB haben die Arbeit geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und redigierten das Papier.

Korrespondenz mit Julien Nicolas.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bossion, A., Zhu, C., Guerassimoff, L. et al. Vinylcopolymere mit schnellerem hydrolytischem Abbau als aliphatische Polyester und einstellbaren oberen kritischen Lösungstemperaturen. Nat Commun 13, 2873 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30220-y

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Eingegangen: 13. Dezember 2021

Angenommen: 19. April 2022

Veröffentlicht: 24. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30220-y

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