Ein spezifisches Dispiropiperazin-Derivat, das den Zellzyklus stoppt und Apoptose, Nekrose und DNA-Schäden induziert | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8674 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dispiropiperazin-Verbindungen sind eine Klasse von Molekülen, von denen bekannt ist, dass sie biologische Aktivität verleihen, aber es gibt nur wenige, die als Zellzyklusregulatoren untersucht wurden. Hier berichten wir über die Charakterisierung und Synthese von zwei Dispiropiperazin-Derivaten: dem zuvor synthetisierten Spiro[2′,3]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin (SPOPP-3, 1) und sein bisher unbeschriebenes Isomer, Spiro[2′,5′]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin ( SPOPP-5, 2). Es wurde gezeigt, dass SPOPP-3 (1), aber nicht SPOPP-5 (2), antiproliferative Aktivität gegen eine Gruppe von 18 menschlichen Krebszelllinien mit IC50-Werten im Bereich von 0,63 bis 13 µM aufweist. Die Analyse der Durchflusszytometrie ergab, dass SPOPP-3 (1) in der Lage war, den Zellzyklus in der G2/M-Phase in menschlichen SW480-Krebszellen anzuhalten. Die Western-Blot-Analyse bestätigte außerdem, dass sich der Stillstand des Zellzyklus in der M-Phase befindet. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass SPOPP-3 (1) Apoptose, Nekrose und DNA-Schäden induziert und die Positionierung der mitotischen Spindel in SW480-Zellen stört. Diese Ergebnisse erfordern eine weitere Untersuchung von SPOPP-3 (1) als neuartigem Krebsmittel, insbesondere wegen seiner potenziellen Fähigkeit, Krebszellen für den strahleninduzierten Zelltod zu sensibilisieren, die Krebsimmuntherapie zu verbessern, Apoptose-bedingte Arzneimittelresistenzen zu überwinden und für eine mögliche Verwendung bei Krebsbehandlungen mit synthetischer Letalität.

Der Einsatz von Chemikalien und Strahlung zur Herbeiführung von DNA-Schäden ist die am häufigsten eingesetzte Methode zur Krebstherapie. In jüngster Zeit besteht ein erhöhtes Interesse an der Manipulation des Zellzyklus zur Auslösung einer mitotischen Katastrophe als neuartige Therapiestrategie gegen Krebs1,2,3,4,5. Eine mitotische Katastrophe ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellen normalerweise in der G2/M-Phase aufgrund einer Schädigung der DNA oder der mitotischen Spindel angehalten würden, aufgrund fehlerhafter Zellzyklus-Kontrollpunkte jedoch fälschlicherweise in die Mitose übergehen6. Das Endergebnis ist Seneszenz oder Zelltod durch Apoptose, Nekrose oder Autophagie7. Diese Strategie basiert auf der Verwendung von DNA-schädigenden Wirkstoffen oder Strahlung in Kombination mit Zellzyklus-Checkpoint-Inhibitoren. Tatsächlich haben mehrere G2/M-Phasen-Checkpoint-Inhibitoren1,2,3,4,5, darunter Irinotecan, ein derzeit verwendetes Chemotherapeutikum bei metastasiertem Darmkrebs, gezeigt, dass sie Tumorzellen für ionisierende Strahlung sensibilisieren können. Daher bleibt die Entdeckung neuer Verbindungen, die zum Stillstand des G2/M-Zellzyklus führen, ein wichtiger Bereich der Krebsforschung8,9,10.

Derzeit sind nur wenige biologisch aktive Dispiropiperazin-Derivate bekannt. Eines davon ist Prospidiumchlorid. Diese Verbindung, auch Prospidin genannt, hat zytostatische, entzündungshemmende und immunsuppressive Eigenschaften11,12,13. Aufgrund seiner Fähigkeit, die T- und B-Zell-Mitogenese während der lymphoblastischen Transformation zu hemmen11 und das Tumorvolumen krebserregender Brusttumoren bei Ratten zu senken12, wurde es als antineoplastische Verbindung eingestuft. Derzeit wird Prospidiumchlorid als Antirheumatikum bei refraktärer rheumatoider Arthritis eingesetzt14.

Trotz früherer Berichte über biologisch aktive Dispiropiperazin-Verbindungen wurden andere chemische Derivate nicht ausreichend erforscht. Hier berichten wir zum ersten Mal über die antiproliferative Aktivität von Spiro[2′,3]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin (SPOPP). -3, 1), ein zuvor synthetisiertes Dispiropiperazin-Derivat. SPOPP-3 (1) hat eine antiproliferative Aktivität gegen eine Reihe menschlicher Krebszelllinien und ist in der Lage, den Zellzyklus in der G2/M-Phase anzuhalten, Apoptose, Nekrose und DNA-Schäden zu induzieren und die Positionierung der mitotischen Spindel zu stören.

Ein kürzlich veröffentlichter Bericht demonstrierte die Synthese von zwei Dispiropiperazin-Derivaten, Spiro[2′,3]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin (hier bezeichnet als). SPOPP-3, 1) und Spiro[2′,5]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin, durch eine Azomethin-Ylid-Cycloadditionsreaktion unter Verwendung von Acenaphthenchinon (AcQ) und l-Prolin als Substrate15. Wir führten eine ähnliche Reaktion mit geringfügigen Modifikationen durch, wie in „Materialien und Methoden“ beschrieben, um SPOPP-3 (1) zu erhalten (Abb. 1). Überraschenderweise erhielten wir auch eine kleine Menge Spiro[2′,5′]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin (hier als SPOPP bezeichnet). -5, 2) (Abb. 1 und ergänzende Abbildungen S2, S3, S6–S11), ein Isomer, das aufgrund seines vorhergesagten ungünstigen Bildungswegs bisher nicht isoliert wurde15,16. Hier berichten wir zum ersten Mal über die Reinheit (Ergänzende Abbildung S2) und Struktur von SPOPP-5 (2), bestimmt durch FTIR (Ergänzende Abbildung S3), NMR (Ergänzende Abbildungen S6 – S10) und Röntgen Beugungsanalysen (Ergänzende Abbildung S11).

Synthese der Dispiropiperazin-Derivate SPOPP-3 (1) und SPOPP-5 (2).

Unseres Wissens wurde keine Bioaktivität für SPOPP-3 (1) berichtet. Hier zeigen wir zum ersten Mal, dass SPOPP-3 (1) die Zelllebensfähigkeit in menschlichen Dickdarmkrebszellen signifikant reduziert (Abb. 2). Für SPOPP-3 (1) betrug der IC50 5,06 ± 1,43 µM, 5,42 ± 0,96 µM und 2,44 ± 0,83 µM in den menschlichen Dickdarmkrebszellen SW480, HT29 und HCT116 (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu hatte sein Isomer SPOPP-5 (2) mit IC50 > 100 µM keine signifikante Wirkung (Abb. 2; Tabelle 1). Um festzustellen, ob SPOPP-3 (1) und SPOPP-5 (2) unterschiedliche Auswirkungen auf verschiedene Arten von Krebszellen haben, haben wir sie an weiteren 15 menschlichen Krebszelllinien untersucht, die weitere 8 verschiedene Arten menschlicher Krebsarten umfassen. Doxorubicin wurde als Positivkontrolle für die Zelllinien verwendet und die Zusammenfassung ist in Tabelle 1 dargestellt. SPOPP-3 (1) bleibt hemmend mit IC50-Werten im Bereich von 0,63 ± 0,17 µM in der CEM der menschlichen T-Lymphoblastoid-Zelllinie bis 13,0 ± 1,96 µM in menschliche Hepatomzelllinie HepG2. Auch hier zeigte SPOPP-5 (2) eine unbedeutende Aktivität in vier weiteren Krebszelllinien (MiaPaca-2, Panc-1, SKOV3 und MDA-MB-231) (Tabelle 1). Basierend auf den Ergebnissen, dass SPOPP-5 (2) bei sieben Krebszelllinien keinen signifikanten Effekt auf die Zelllebensfähigkeit hatte, wurde es bei den anderen Zelllinien nicht weiter untersucht. Die antiproliferative Wirkung von SPOPP-3 (1) war am größten gegen menschliche Leukämiezelllinien (IC50 von 0,63 bis 3,60 µM), menschliche Glioblastomzelllinien (IC50 von 2,95 bis 6,30 µM) und menschliche Darmkrebszelllinien (IC50 von 2,44). bis 5,42 µM), menschliche Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien (IC50 von 4,23 µM), menschliche Eierstockkrebs-Zelllinien (IC50 von 6,30 µM) und menschliche Brustkrebs-Zelllinien (IC50 von 4,00 bis 6,17 µM). SPOPP-3 (1) hat eine etwas schwächere antiproliferative Aktivität gegen menschliche Leberkrebszelllinien (IC50 von 13,03 µM), menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien (IC50 von 8,62 bis 9,17 µM) und menschliche Prostatakrebszelllinien (IC50 von 9,80 µM). ). Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass SPOPP-3 (1) eine relativ starke antiproliferative Wirkung auf eine Reihe menschlicher Krebszelllinien hat. Um den Mechanismus zu verstehen, durch den SPOPP-3 (1) seine antiproliferative Wirkung auf Zellen ausübt, wurden die folgenden Studien durchgeführt.

SPOPP-3 (1) hemmte die Lebensfähigkeit menschlicher Darmkrebszellen. Die Lebensfähigkeit der Zellen in menschlichen Dickdarmkrebszellen SW480, HT29 und HCT116 wurde mithilfe des MTT-Assays bewertet. Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von SPOPP-3 (1) oder SPOPP-5 (2) behandelt. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für drei separate Experimente. Fehlerbalken sind SEM.

Um den Mechanismus zu bestimmen, durch den SPOPP-3 (1) die Lebensfähigkeit der Zellen verringert, wurde eine Durchflusszytometrie zur Zellzyklusanalyse durchgeführt. Wie in Abb. 3 gezeigt, führte die Behandlung mit 20 µM SPOPP-3 (1) zu einem Stillstand des Zellzyklus in der G2/M-Phase (Abb. 3b). Für SPOPP-5 (2) wurde keine Aktivität beobachtet. Um weiter zu untersuchen, ob SPOPP-3 (1) einen Stillstand in der G2- oder M-Phase induziert, führten wir eine Western-Blot-Analyse durch, um Phosphohiston H3, einen etablierten empfindlichen mitotischen Marker, nachzuweisen17. Tatsächlich war der Phosphohiston-H3-Spiegel in SW480-Zellen, die mit SPOPP-3 (1), aber nicht mit SPOPP-5 (2) behandelt wurden, deutlich erhöht (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass SPOPP-3 (1) SW480-Zellen in der M-Phase anhält des Zellzyklus. Um die Auswirkungen von SPOPP-3 (1) auf den Zellzyklus weiter zu untersuchen, führten wir Immunfluoreszenzexperimente durch, um die Aktivierung von Cyclin B1 zu untersuchen. Cyclin B1 ist einer der Schlüsselfaktoren bei der Kontrolle des Eintritts in die Mitose18,19, wobei seine Expression in der G2-Phase schnell zunimmt und ihren Höhepunkt in der späten G2- oder frühen M-Phase20,21 erreicht. Wie in Abb. 5 gezeigt, war die Population tetraploider Zellen in SPOPP-3 (1)-behandelten Zellen, was durch Zellen mit verdoppeltem DAPI-Signal angezeigt wird, im Vergleich zur DMSO-Kontrolle signifikant erhöht. Dies bestätigt die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, dass SPOPP-3 (1) einen Zellzyklusstopp in der G2/M-Phase verursachte, in der es den Zellen nicht gelang, sich in Tochterzellen zu teilen. In den Kontrollzellen wiesen die meisten tetraploiden Zellen im Vergleich zu mit SPOPP-3 behandelten tetraploiden Zellen eine signifikant höhere Cyclin-B1-Färbung auf (Abb. 5b). Somit deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit SPOPP-3 (1) mit einer fehlerhaften Cyclin B1-Aktivierung verbunden ist.

SPOPP-3 (1) stoppte den Zellzyklus in der G2/M-Phase in SW480-Zellen. (a) SW480-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 2 % DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) oder 20 µM SPOPP-5 (2) behandelt, danach wurden die Zellen geerntet und einer Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie unterzogen. (b) Die Ergebnisse aus (a) und zwei weiteren zusätzlichen biologischen Replikaten (n = 3) wurden kombiniert und wie gezeigt ausgedrückt. Die Zellzyklusprozentsätze wurden basierend auf dem Watson Pragmatic-Modell berechnet. Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt: *p < 0,0001.

SPOPP-3 (1) induzierte Phosphohiston H3 in SW480-Zellen. (a) Immunblots, die die Expression von Phosphohiston H3 und GAPDH nach Behandlung mit 2 % DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) oder 20 µM SPOPP-5 (2) für 24 Stunden zeigen. (b) Die Ergebnisse von (A) und zwei weiteren biologischen Replikaten (n = 3) wurden gemittelt und wie gezeigt ausgedrückt. T-Test wurde verwendet: *p < 0,05.

Defekte Cyclin-B1-Induktion in SPOPP-3-behandelten Zellen, wie durch Immunfluoreszenzexperimente gezeigt. SW480-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 40 µM SPOPP-3 oder 2 % DMSO behandelt, bevor sie mit Cyclin B1-Antikörper und DAPI fixiert und immungefärbt wurden. (a) Repräsentatives Bild von mit SPOPP-3 behandelten Zellen (untere Bilder), das eine große Population tetraploider Zellen (angezeigt durch Pfeile) ohne Cyclin-B1-Färbung zeigt. Im Gegensatz dazu weisen DMSO-behandelte Zellen eine relativ kleine Population tetraploider Zellen auf, die alle Cyclin B1 exprimierten. (b) Tetraploide Zellen (mit verdoppeltem DAPI-Signal) (links) und der Prozentsatz tetraploider Zellen, die für Cyclin B1 positiv sind (rechts), wurden in jeder Gruppe quantifiziert und als Durchschnitt ± SD dargestellt. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet: *p < 0,05. Maßstabsleiste 20 mm.

Um den möglichen Effekt von SPOPP-3 (1) auf den Zelltod zu bestimmen, der zu der beobachteten Abnahme der Zelllebensfähigkeit führte, verwendeten wir Durchflusszytometrie zur Analyse von Apoptose und Nekrose. Die am häufigsten verwendeten Farbstoffe zum Nachweis von Nekrose und Apoptose sind 7-AAD bzw. Annexin V-PE. Nach 24-stündiger Behandlung mit SPOPP-3 (1), SPOPP-5 (2) oder 2 % DMSO wurden die Zellen doppelt mit 7-AAD und Annexin V-PE gefärbt. Wie in Abb. 6a gezeigt, veränderten sich mit SPOPP-3 (1) behandelte Zellen im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Zellen (Q1; 0,5 %) in einen nekrotischeren Zustand (Q1; 32,64 %), und dies ist statistisch signifikant (Abb . 6b). SPOPP-3 (1) induzierte auch signifikant Apoptose (Q2 + Q4) in SW480-Zellen (Abb. 6). Andererseits hatte SPOPP-5 (2) im Vergleich zur Kontrolle keinen signifikanten Einfluss auf Apoptose oder Nekrose.

SPOPP-3 (1) induzierte Apoptose und Nekrose in SW480-Zellen. (a) SW480-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 2 % DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) oder 20 µM SPOPP-5 (2) behandelt, danach wurden Zelllysate isoliert und einer Zelltodanalyse mittels Durchflusszytometrie unterzogen. (b) Die Ergebnisse aus (a) und zwei weiteren zusätzlichen biologischen Replikaten (n = 3) wurden kombiniert und wie gezeigt ausgedrückt. Es wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet: *p < 0,005, **p < 0,0001.

Um die mögliche Funktion von SPOPP-3 (1) als Mikrotubuli-Toxin zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenzstudien durchgeführt. Als Positivkontrollen wurden zwei Medikamente verwendet, Vinblastin und Colchicin, von denen bekannt ist, dass sie Mikrotubuli zerstören. Vinblastin, das zur Familie der Vinca-Alkaloide gehört, bindet an einer bestimmten Stelle an Tubulin und hemmt die Bildung der mitotischen Spindel, was zu einer Störung des Zellzyklus führt22,23. Es ist bekannt, dass Vinblastin bei Verwendung in hohen Konzentrationen aufgrund dicht gepackter Tubulinaggregate zur Bildung von Parakristallen führt24. Tatsächlich wurden bei der Behandlung von SW480-Zellen mit 50 nM Vinblastin Parakristalle beobachtet (Abb. 7). Colchicin hingegen zerstörte die Mikrotubuli und verursachte eine diffuse α-Tubulin-Färbung in den Zellen (Abb. 7). Im Gegensatz dazu konnten mitotische Spindeln in mit SPOPP-3 behandelten Zellen beobachtet werden (1). Allerdings schienen die Positionen der mitotischen Spindeln im Vergleich zu mit DMSO behandelten Kontrollzellen gestört zu sein (Abb. 7). Die Verschiebung der mitotischen Spindeln war auch mit der fehlenden Chromosomenausrichtung am Äquator der Zelle verbunden (Abb. 7). Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass SPOPP-3 (1) zwar die Bildung von Mikrotubuli nicht stört, die Positionierung der mitotischen Spindel jedoch beeinflusst zu sein scheint.

SPOPP-3 (1) verursacht keine Störung der Mikrotubuli. SW480-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 50 nM Vinblastin, 1 µM Colchicin oder 40 µM SPOPP-3 (1) behandelt, bevor sie mit α-Tubulin-Antikörper und DAPI fixiert und immungefärbt wurden. In mit SPOPP-3 (1) behandelten Zellen wurden deutlich mitotische Spindeln beobachtet, während Colchicin und Vinblastin über unterschiedliche Mechanismen eine Zerstörung der Mikrotubuli induzierten. Bei der Behandlung mit Colchicin bzw. Vinblastin können diffuse α-Tubulin-Färbungen im Zytoplasma und die Bildung von Parakristallen (Pfeile) beobachtet werden. Maßstabsleiste 5 mm.

Basierend auf den Erkenntnissen, dass SPOPP-3 (1) einen G2/M-Stillstand verursacht, der mit der Herunterregulierung von Cyclin B1 und der Verdrängung der mitotischen Spindel verbunden ist, ist es möglich, dass die Aktivität von SPOPP-3 (1) über DNA-Schäden erfolgt19,25. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, verwendeten wir die qPCR-basierte Methode (LORD-Q) zum Nachweis von DNA-Läsionen26. Da diese Methode DNA-Schäden unabhängig von der Art der DNA-Läsion erkennen kann, halten wir dies für die am besten geeignete Methode. Wie in Abb. 8 gezeigt, erreichten die Daten aufgrund der großen Datenvariation zwar keine statistische Signifikanz, die Wirkung von SPOPP-3 (1) auf DNA-Schäden kann jedoch bereits 1 Stunde nach der Behandlung nachgewiesen werden. Dieser Effekt ließ jedoch nach 20-stündiger Behandlung deutlich nach (Abb. 8).

SPOPP-3 (1) verursachte DNA-Schäden. Quantifizierung von DNA-Läsionen mit LORD-Q in SW480-Zellen, die für die angegebenen Zeiträume mit 40 µM SPOPP-3 (1) behandelt wurden. Aus dem mtDNA-Gen amplifizierte kurze und lange Amplikons wurden zur Quantifizierung von Läsionen in mitochondrialer DNA verwendet. Die dargestellten Daten werden aus drei biologischen Replikaten ± SEM (n = 3) gemittelt.

In dieser Studie berichten wir über die Synthese von SPOPP-3 (1) und zeigen zum ersten Mal, dass es eine starke antiproliferative Aktivität gegen 18 menschliche Krebszelllinien aufweist (Tabelle 1). Zu unserer Überraschung erhielten wir mit dem zuvor beschriebenen Syntheseverfahren15,16 auch das Strukturisomer SPOPP-5 (2), eine neuartige Verbindung. Wir glauben, dass SPOPP-5 (2) in unseren Händen gebildet wurde, weil wir für die Synthese 35 °C und 3 Stunden verwendeten, während Haddad et al.15 ihre Synthesereaktion 2 Stunden lang bei 65 °C unter Rückfluss erhitzten. Es ist bekannt, dass niedrigere Synthesetemperaturen während Cycloadditionsreaktionen ein kinetisch kontrollierteres Produkt begünstigen16. Im Gegensatz zu SPOPP-3 (1) hatte SPOPP-5 (2) praktisch keine antiproliferative Aktivität (Tabelle 1). Wir spekulieren, dass die Konfiguration der beiden Carbonylgruppen in SPOPP-3 (1), insbesondere in Abwesenheit zusätzlicher chemischer Komponenten zwischen ihnen, zu seiner antiproliferativen Aktivität beitragen könnte (Abb. 1). Zukünftige Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung müssten durchgeführt werden, um diese Hypothese zu überprüfen. Die unterschiedliche Wirkung von SPOPP-3 auf die verschiedenen Krebszelllinien könnte mit der Wachstumsrate der Zelllinien zusammenhängen. Beispielsweise hat SPOPP-3 eine stärkere antiproliferative Wirkung auf die schneller wachsenden menschlichen Leukämiezelllinien (K562, KG1a, CEM) und Glioblastomzelllinien (U251, U87), hat jedoch eine schwächere Wirkung auf die langsamer wachsende HepG2-Leberkrebszelllinie. DU145-Prostatakrebs-Zelllinie und Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien (MiaPaca2, Panc1) (Tabelle 1). Interessanterweise gilt dies nicht für die Positivkontrolle Doxorubicin, die eine starke antiproliferative Wirkung sowohl auf schneller wachsende Zellen (U251, U87) als auch auf langsamer wachsende Zellen (DU145, SKOV3) zeigte. Solche Beobachtungen legen nahe, dass SPOPP-3 und Doxorubicin ihre antiproliferative Wirkung über unterschiedliche Mechanismen ausüben.

Die antiproliferative Aktivität von SPOPP-3 (1) war mit seiner Fähigkeit, Apoptose und Nekrose zu induzieren (Abb. 6), sowie seiner Fähigkeit, einen Zellzyklusstopp in der G2/M-Phase zu verursachen (Abb. 3), verbunden. Unter Verwendung von phosphoryliertem Histon H3 als M-Phasenmarker wurde gezeigt, dass zumindest einige Zellen in der M-Phase angehalten wurden (Abb. 4). Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass die Cyclin-B1-Expression durch die Behandlung mit SPOPP-3 (1) drastisch reduziert wurde (Abb. 5). Obwohl ein Anstieg der Cyclin B1-Expression in der späten G2-Phase und ihre Translokation in den Zellkern für die Einleitung der Mitose wichtig ist, führt ihre Depletion durch siRNA-Knockdown nicht dazu, dass Zellen erst in der G2-Phase angehalten werden, da dies durch die redundante Funktion erklärt werden kann von Cyclin B218,27. Mithilfe der Mikroskopie haben wir auch gezeigt, dass Mikrotubuli zwar von der Behandlung mit SPOPP-3 (1) unbeeinträchtigt zu sein scheinen, dass jedoch Defekte in der M-Phase, einschließlich der Positionierung der mitotischen Spindel und der Ausrichtung der kondensierten Chromosomen, beobachtet wurden (Abb. 7). Dies kann auf verringerte Cyclin-B1-Spiegel zurückzuführen sein, da bekannt ist, dass Cyclin B1 normalerweise in Zentrosomen und Kinetochoren rekrutiert wird28,29. Wir untersuchten weiter, ob SPOPP-3 (1) DNA-Schäden verursacht, da dokumentiert wurde, dass die Cyclin-B1-Spiegel infolge von DNA-Schäden reduziert werden30,31. Tatsächlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass SPOPP-3 (1) ähnlich wie Bleomycin26 DNA-Schäden in einem frühen Stadium verursacht, die 1 Stunde, aber nicht 20 Stunden nach der Behandlung nachweisbar waren (Abb. 8). Dies ähnelt der Wirkung von Bleomycin26 und ist wahrscheinlich das Ergebnis der schnellen Reaktion auf die Reparatur von DNA-Schäden 32. Infolgedessen könnte ein so frühes DNA-Schadensereignis zu einer Reduzierung von Cyclin B1, einem Stillstand des Zellzyklus, Apoptose und Nekrose führen, die zelluläre Prozesse sind die viel später auftreten.

Die antiproliferativen Eigenschaften von SPOPP-3 (1) haben wichtige Auswirkungen auf die Krebstherapie. Synthetische Letalität ist ein neuartiger Ansatz in der Krebsbehandlung4,5. Da SPOPP-3 (1) ein starker Auslöser des G2/M-Arrests ist, besteht das Potenzial, in Kombination mit G2/M-Checkpoint-Inhibitoren eine mitotische Katastrophe auszulösen, was derzeit auch als günstige Behandlungsstrategie zur Förderung des Zelltods angesehen wird über Apoptose, Nekrose oder Autophagie1,2,3,4,5. Insbesondere in den meisten Melanomfällen, in denen der durch den Cyclin-CDK4-Signalweg vermittelte G1/S-Übergang fehlerhaft ist und eine erhöhte Abhängigkeit vom G2/M-Kontrollpunkt besteht, um einen Zellzyklusstopp auszulösen, wenn er DNA-Schäden ausgesetzt ist, kann SPOPP-3 (1) vorliegen ein zusätzlicher Vorteil in Kombination mit G2/M-Inhibitoren4. Zweitens fanden wir heraus, dass SPOPP-3 (1) ein Auslöser von Nekrose ist. Mehrere Untersuchungslinien haben Belege für die Rolle der Nekrose bei der Verbesserung der Krebsimmuntherapie und als mögliche Strategie zur Überwindung der Resistenz von Krebszellen gegenüber Apoptose geliefert33,34. Zu diesem Zweck wird es wichtig sein zu beurteilen, ob SPOPP-3 (1) eine solche Fähigkeit besitzt, entzündungsfördernde Prozesse durch die Freisetzung schädigungsassoziierter molekularer Muster wie das High Mobility Group 1 (HMGB1)-Protein, ein Marker für Nekrose, auszulösen . Die Freisetzung solcher Faktoren in die extrazelluläre Matrix kann zur Aktivierung von CD8+-Leukozyten führen und die Antitumorimmunität fördern34.

Es ist auch wichtig, den Mechanismus, durch den SPOPP-3 (1) Zellen in der G2/M-Phase anhält, weiter zu entschlüsseln. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Piperazinderivate reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen erzeugen35. Daher wäre es von Interesse zu untersuchen, ob SPOPP-3 (1) ROS erzeugen kann, was zu oxidativen DNA-Schäden und anschließendem Stillstand in der G2/M-Phase führt. Im Hinblick auf Nekrose, eine der Formen des Zelltods, die in mit SPOPP-3 behandelten Zellen nachgewiesen wurde (1), wird immer deutlicher, dass es sich bei Nekrose möglicherweise nicht einfach um einen unkontrollierten zellulären Prozess handelt, sondern um einen regulierten Weg, der allgemein als Nekroptose bekannt ist36. Es wurde auch berichtet, dass Nekroptose die Krebsmetastasierung in bestimmten Zelllinien erhöht37. Die Dualität der Nekroptose als anti- und protumorigener Natur muss noch untersucht werden, um festzustellen, in welchem Kontext Nekroptose vorteilhaft ist. Da wir eine respektable antiproliferative Aktivität von SPOPP-3 (1) gegen eine große Anzahl von Krebszelllinien festgestellt haben, wäre es wichtig, die Art des Zelltods in verschiedenen Zelllinien weiter zu untersuchen.

Abschließend beschreiben wir die Synthese und biochemische Charakterisierung eines spezifischen Dispiropiperazin-Derivats namens SPOPP-3 (1) mit starker antiproliferativer Aktivität gegen eine Vielzahl menschlicher Krebszelllinien. SPOPP-3 (1) ist in der Lage, DNA-Schäden, Apoptose und Nekrose zu induzieren, den Zellzyklus in der G2/M-Phase anzuhalten und die normale Positionierung der mitotischen Spindel zu stören. Diese Studie hat den Grundstein für die Weiterentwicklung von SPOPP-3 (1) für den möglichen Einsatz als chemisches Werkzeug zur Störung und zum Verständnis zellulärer Prozesse sowie als potenzielle Antikrebsverbindung gelegt. Für Letzteres sollte SPOPP-3 (1) im Rahmen eines synthetischen Letalitätsansatzes und als nekroseinduzierende Antikrebsverbindung untersucht werden.

Wir haben die zuvor beschriebene Methode zur Synthese von Spiro[2′,3]-bis(acenaphthen-1′-on)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazin (SPOPP-3, 1)15 übernommen ,16. Eine Mischung aus Acenaphthenchinon (1,822 g, 10 mmol) und l-Prolin (1,151 g, 10 mmol; Sigma-Aldrich) wurde in Methanol (200 ml) gelöst und 3 Stunden lang auf 35 °C erhitzt. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Ethylacetat:Hexan (1:2; Vol./Vol.) überwacht und die Flecken wurden mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht. Typischerweise bildete sich während der ersten Stunde ein orangefarbener Niederschlag, der sich nach einer weiteren Stunde in eine orangebraune Farbe und nach Abschluss der Reaktion in eine dunkelbraune Farbe änderte. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein dunkelbraunes Pulver (1,722 g) zurückblieb. Das Rohprodukt, das sowohl SPOPP-3 (1) als auch SPOPP-5 (2) enthielt, wurde mit 2 g normalem Siliciumdioxid in 200 ml Methanol gemischt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und die Silicamischung trocken auf eine Säule geladen. Zur Isolierung einer Mischung aus SPOPP-3 (1) und SPOPP wurde eine Reinigung durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Normalphasen-Silica (50 g) und einer 9:1-Mischung aus Hexanen und Ethylacetat bei einer Flussrate von 12 ml/min durchgeführt -5 (2). Anschließend wurde eine Reinigung mit drei Durchläufen der Flash-Chromatographie mit insgesamt 686 mg Rohprodukt durchgeführt. Eine orangefarbene Bande, die bei 530–830 ml eluiert, entsprechend Rf = 0,14 mit 9:1 (Hexane:Ethylacetat), wurde unter reduziertem Druck getrocknet, um 280 mg halbgereinigtes SPOPP-3 (1) zu ergeben. SPOPP-3 (1) wurde anschließend für biologische Tests durch HPLC unter Verwendung einer Phenomenex Luna 5u Phenyl-Hexyl-Säule mit 4,60 mm × 250 mm gereinigt. Als Elutionsmittelbedingungen wurde ein Gradient von 80 bis 92 % Acetonitril für 6 Minuten bei einer Flussrate von 2 ml/min verwendet. Vom halbgereinigten SPOPP-3 (1) wurden insgesamt 12,5 mg in die HPLC injiziert und 5 mg (16 %) gereinigtes SPOPP-3 (1) (bei einer Retention von 4,08 min) erhalten. Eine gelb gefärbte Bande, die bei 320–405 ml eluiert, entsprechend Rf = 0,24 (9:1 Hexane:Ethylacetat), ergab 120 mg gereinigtes SPOPP-5 (2). SPOPP-5 (2) wurde unter Verwendung der gleichen HPLC-Bedingungen wie SPOPP-3 (1) gereinigt. Einhundertzwanzig mg halbgereinigtes SPOPP-5 (2) wurden in die HPLC injiziert und 21 mg (3 %) gereinigtes SPOPP-5 (2) (bei einer Retention von 6,02 Minuten) wurden erhalten. HPLC-MS- und NMR-Analysen wurden verwendet, um die Identität von SPOPP-3 (1) und SPOPP-5 (2) zu bestätigen. 1D- und 2D-NMR-Spektren wurden mit einem Agilent/Varian Inova 400-MHz-NMR-Spektrometer mit einem 5-mm-Kimble-NMR-Röhrchen (Rockwood, TN, USA) an der University of Alberta oder mit einem Bruker 600-MHz-NMR mit einer Kryosonde an der University of Alberta aufgezeichnet Britisch-Kolumbien. Alle HPLC-Analysen wurden auf Agilent 1260 Infinity Systemen mit UV-Detektor durchgeführt und die Massenspektrometrie erfolgte mit Agilent 6120 Single Quad MS.

Einzelne orangefarbene unregelmäßige Kristalle von SPOPP-5 (2) (50 mg) wurden aus Acetonitril (10 ml) durch langsames Verdampfen umkristallisiert. Kristalle wurden am 7. Tag erhalten. Ein geeigneter Kristall mit den Abmessungen 0,22 × 0,20 × 0,11 mm3 wurde ausgewählt und auf einem Bruker APEX II-Flächendetektordiffraktometer montiert. Der Kristall wurde während der Datenerfassung auf einer konstanten Temperatur von T = 90(2) K gehalten. Die Struktur wurde mit dem Lösungsprogramm ShelXT38 unter Verwendung dualer Methoden und Olex239 als grafischer Schnittstelle gelöst. Das Modell wurde mit XL38 unter Verwendung der Minimierung der kleinsten Quadrate der vollständigen Matrix auf F2 verfeinert.

Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection bezogen, mit Ausnahme von HT29 (Colon-Adenokarzinom), das von Dr. Ranjana Bird an der UNBC bezogen wurde. Alle Zellen wurden in Eagle's Minimal Essential Medium (Lonza) gehalten, mit Ausnahme der folgenden: MiaPaca-2 und Panc-1 wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Lonza) gehalten, während K562, KG1a und CEM in RPMI 1640 Medium (Lonza) gehalten wurden. Alle Medien wurden mit 10 % fötalem Rinderserum (Life Technologies Inc.) und Antibiotika ergänzt.

Der zytotoxische MTT-Assay wurde wie zuvor beschrieben zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen verwendet40. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit einer Dichte von 1,5 × 103 Zellen/Well in 96-Well-Platten ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 48 Stunden lang mit SPOPP-3 (1) oder SPOPP-5 (2) in einem Konzentrationsbereich von 0,16 bis 100 µM behandelt. Die Zellen wurden mit der Positivkontrolle Doxorubicin in einer Konzentration von 0,003 bis 0,8 µM behandelt. Alle Absorptionsdaten wurden relativ zur Kontrolle, 0,1 % DMSO, ausgedrückt, was als 100 % Zelllebensfähigkeit angenommen wurde.

SW480-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 3,0 x 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät und dann am nächsten Tag mit 20 µM SPOPP-3 (1), 20 µM SPOPP-5 (2) oder 2 % DMSO behandelt 24 Std. Zelllysate wurden wie zuvor beschrieben hergestellt41. Für die Immunoblot-Analyse wurden Proteinproben auf einer 10 %igen SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Der Phospho-H3-Antikörper (Ser10) (D2C8, 1:1.000, Cell Signaling) wurde mit einer Inkubation über Nacht bei 4 °C verwendet. Anti-GAPDH (G8795, Klon GAPDH-71.1, 1:20.000, Sigma) wurde ebenfalls verwendet. Anti-Maus-IgM-HRP (sc-2064, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology), Anti-Maus-IgG-HRP (W402B, 1:4000, Promega) und Anti-Kaninchen-IgG-HRP (W401B, 1:4000, Promega). ) wurden als Sekundärantikörper verwendet. Alle Blots wurden mit dem FluorChem Q-System (ProteinSimple) visualisiert. Die Densitometrieanalyse wurde mit der AlphaView Q-Software (ProteinSimple) durchgeführt.

Die Zellen wurden mit 2,5 × 105 Zellen/Well in 6-Well-Platten ausplattiert und mit den oben beschriebenen Verbindungen behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert, anschließend zentrifugiert und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Lebende Zellen wurden mit PE Annexin V und 7-AAD gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines BD FACSMelody-Zellsortierers (BD Biosciences) und der BD FACSChorus-Software (V 1.0) analysiert. Für die Zellzyklusanalyse wurde das BD Cycletest plus DNA-Reagenzienkit zum Färben auf DNA verwendet und die Daten wurden mit der Software FlowJo analysiert.

SW480-Zellen wurden in 4-Well-Deckglaskammern mit einer Dichte von 15 × 104 Zellen pro Well mit 0,5 ml EMEM ausplattiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen Arzneimitteln behandelt, bevor sie 10 Minuten lang mit 100% Methanol (–20 ° C) fixiert wurden. Anschließend wurden die Zellen mit PBS mit 2 % BSA und 0,1 % Triton-x-100 blockiert und dann mit α-Tubulin-Antikörper (1:100; Ab4074; Abcam) oder Cyclin-B1-Antikörper (D5C10, 1:200, Zellsignalisierung) angefärbt ). Als Sekundärantikörper wurden Anti-Maus-AF594 und Anti-Kaninchen-AF 594 (1:200; Molecular Probes) verwendet. Alle verwendeten Antikörper wurden in PBS mit 0,5 % BSA und 0,1 % Triton-x-100 verdünnt. Alle Blockierungs- und Antikörperinkubationsschritte wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach jedem Antikörper-Inkubationsschritt wurden die Zellen dreimal (jeweils 10 Minuten) mit Waschpuffer gewaschen, der 0,1 % Triton-x-100 in PBS enthielt. Für die Cyclin B1-Immunfluoreszenz wurden die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Um die DNA anzufärben, wurden die Zellen nach der Immunfärbung mit dem sekundären Antikörper 5 Minuten lang mit DAPI-Dihydrochlorid (300 nM verdünnt in PBS) inkubiert. Alle Fluoreszenzbilder wurden mit einem inversen Zeiss Axio Observer Z1-Mikroskop mit motorisiertem Tisch, einer Zeiss Axiocam 503-Monokamera, einer Colibri 2-Mehrfarben-LED-Lichtquelle, einem Plan-Apochromat 20×/0,8 M27 oder einem Plan-Apochromat 63×/1,4 Oil DIC M27 aufgenommen als Ziele. Zur Quantifizierung tetraploider Zellen wurde das DAPI-Signal in jeder Zelle in jedem Bild mithilfe der Funktion „Region of Interest“ in der Zen-Software quantifiziert. Tetraploide Zellen wurden mit einem DAPI-Signal unterschieden, das doppelt so hoch war wie das der übrigen Zellen im selben Bild. Drei Bilder (jedes mit mindestens 36 Zellen) aus jeder Gruppe wurden quantifiziert. Die Population tetraploider Zellen, die Cyclin B1-positiv waren, wurde dann in jedem Bild bestimmt und als Durchschnitt für jede Gruppe dargestellt. Vinblastinsulfat und Colchicin (beide von Sigma bezogen) wurden als Positivkontrollen für Mikrotubuli-Toxine einbezogen.

Um zu beurteilen, ob die Behandlung mit SPOPP-3 DNA-Schäden verursacht, wurde eine auf Langzeit-PCR basierende Methode (LORD-Q) mit Modifikationen verwendet26. SW480-Zellen (2,5 × 106) wurden in 6-Well-Platten mit DMSO (Kontrolle) oder 40 μM SPOPP-3 für die angegebenen Zeiträume behandelt, bevor sie zur vollständigen DNA-Isolierung mit dem DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) geerntet wurden. Die LORD-Q-Methode wurde unter Verwendung der etablierten Primersätze sowohl für die langen als auch für die kurzen Amplikons für das mtDNA-Gen26 durchgeführt. Die PCR-Effizienz wurde unter Verwendung von 37,5, 18,75, 9,375 und 4,688 ng DNA als Matrize pro PCR-Reaktion berechnet. Die rtPCR-Reaktion (15 μL Gesamtvolumen) bestand aus 0,05 × ResoLight-Farbstoff, 1 × KAPA2G Fast Hot Start ReadyMix, 500 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und den oben genannten Mengen isolierter DNA als Matrize. Zur Amplifikation kurzer Amplikons als Referenz wurde Quantabio PerfeCTa® SYBR® Green FastMix® verwendet. Die Echtzeit-PCR-Analyse wurde mit einem Bio-Rad CFX96-System und die Datenanalyse mit der CFX Maestro-Software durchgeführt. Die Anzahl der Läsionen pro 10 kb wurde auf der Grundlage der zuvor aufgestellten Gleichung26,42 berechnet. Die präsentierten Daten werden aus 3 biologischen Replikaten ± SEM gemittelt

Die zytotoxischen MTT-Tests wurden dreifach durchgeführt (3 Vertiefungen/Behandlung) und der Absorptionswert der jeweiligen Kontrolle wurde als 100 % Zelllebensfähigkeit angenommen. Für die Immunoblot-Analyse wurde die Densitometrie der Phosphohiston-H3-Banden auf ihre jeweiligen GAPDH-Banden normalisiert und dann relativ zur DMSO-Kontrolle (angenommen als 1,0) ausgedrückt. Wie angegeben wurde eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und mit GraphPad Prism Version 8.0.2 (La Jolla, CA) oder t-Test analysiert. Für die Post-hoc-Analyse wurde der Holm-Sidak-Test verwendet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Dieses Projekt wurde durch Mittel des NSERC Discovery Grant (227158) an CHL, der Canada Foundation for Innovation (34711) an CHL und des BC Knowledge Development Fund (103970) an CHL unterstützt. VL, MZ und JL wurden durch UNBC Research Project Awards unterstützt.

Abteilung für Chemie und Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, University of Northern British Columbia, Prince George, BC, V2N 4Z9, Kanada

Victor P. Liu, Wai-Ming Li, Jack Lofroth, Mehreen Zeb und Chow H. Lee

Fachbereich Chemie, University of British Columbia, Vancouver, BC, V6T 1Z1, Kanada

Brian O. Patrick

Department of Physical Sciences, MacEwan University, 10700-104 Avenue, Edmonton, AB, T5J 4S2, Kanada

Tina M. Bott

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VPL, WML und CHL konzipierten und gestalteten die Studie. VPL führte die Synthese und Experimente durch, um die Abbildungen vorzubereiten. 1, 3, 4, 6 und Abb. S1–S11. WML führte die Experimente durch und erstellte Abbildungen. 5, 7 und 8. BOP führte die Röntgenkristallographieexperimente durch und erstellte Abb. S11. VL, JL und CHL führten die MTT-Tests durch und erstellten Abb. 2 und Tabelle 1. MZ führte einige der Durchflusszytometrie-Experimente durch und erstellte Abb. 6. CHL, WML und TMB sorgten für die Aufsicht. CHL verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts und leitete die Überarbeitung des Manuskripts. CHL stellte Finanzierungs- und Forschungseinrichtungen zur Verfügung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Chow H. Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, VP, Li, WM., Lofroth, J. et al. Ein spezifisches Dispiropiperazin-Derivat, das den Zellzyklus stoppt und Apoptose, Nekrose und DNA-Schäden induziert. Sci Rep 13, 8674 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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Eingegangen: 16. März 2023

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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