Die pharmakologische Hemmung von HDAC6 verbessert die Muskelphänotypen bei Dystrophin

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7108 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Fehlen von Dystrophin bei Duchenne-Muskeldystrophie stört den Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplex, was zu Brüchigkeit und Atrophie der Skelettmuskelfasern führt, die mit Fibrose sowie einer Desorganisation von Mikrotubuli und neuromuskulären Verbindungen einhergehen. Kürzlich wurde gezeigt, dass die spezifische, nichtkonventionelle zytoplasmatische Histondeacetylase 6 (HDAC6) die Acetylcholinrezeptorverteilung und Muskelatrophie reguliert. Hier berichten wir, dass die Verabreichung des selektiven HDAC6-Inhibitors Tubastatin A an das mdx-Mausmodell der Duchenne-Muskeldystrophie die Muskelkraft erhöht, die Mikrotubuli, die neuromuskuläre Verbindung und die Organisation des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplexes verbessert und Muskelatrophie und Fibrose reduziert. Interessanterweise fanden wir heraus, dass die vorteilhaften Auswirkungen der HDAC6-Hemmung die Herunterregulierung der Beta-Signalübertragung des transformierenden Wachstumsfaktors beinhalten. Durch die Erhöhung der Smad3-Acetylierung im Zytoplasma verringert die HDAC6-Hemmung die Smad2/3-Phosphorylierung, die nukleare Translokation und die Transkriptionsaktivität. Diese Ergebnisse liefern In-vivo-Beweise dafür, dass Smad3 ein neues Ziel von HDAC6 ist und implizieren, dass HDAC6 ein potenzielles therapeutisches Ziel bei Duchenne-Muskeldystrophie ist.

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal vererbte neuromuskulär-rezessive Erkrankung, von der etwa 1 von 3500 neugeborenen Männern weltweit betroffen ist und die häufigste und tödlichste Form der Muskeldystrophie1,2. Patienten mit DMD zeigen ihre ersten klinischen Symptome im Alter von 3 bis 4 Jahren und werden im Alter zwischen 7 und 13 Jahren auf den Rollstuhl angewiesen. Die Gehzeit kann bei vielen Jungen mit DMD durch den frühen Beginn einer Steroidbehandlung verlängert werden. Das Endstadium der Krankheit beginnt, wenn Patienten im Alter von 20 Jahren eine assistierte Beatmung benötigen und in der Regel im dritten oder vierten Lebensjahrzehnt an Atem- oder Herzversagen sterben3,4,5,6,7. DMD resultiert aus Mutationen im Dystrophin-Gen, die zur Synthese von nicht funktionsfähigem Dystrophin oder dessen völligem Fehlen führen. Dystrophin ist ein wichtiger Bestandteil des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplexes (DGC) im Muskel8. DGC ist eine Struktur, die das Sarkolemm überspannt und über die Assoziation von Dystrophin mit Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskeletten und die Bindung von Dystroglycan an Laminin in der Basallamina eine mechanische Verbindung zwischen dem inneren Zytoskelett und der extrazellulären Matrix herstellt9,10. Während der Muskelkontraktion fungiert das DGC als molekularer Stoßdämpfer und stabilisiert die Plasmamembran11,12. Der Verlust von Dystrophin geht mit dem Verlust der DGC einher und führt zu Muskelverschlechterung und -degeneration, wodurch die DGC nicht in der Lage ist, ihre Funktionen auszuüben. Dies macht Muskelfasern anfälliger für kontraktionsbedingte Membranschäden, die zum Zelltod führen13,14,15,16. Dieser pathologische Prozess geht mit Entzündungen und Fibrose einher, die zu Muskelschwund und Funktionsverlust führen17,18,19,20,21.

Trotz enormer Forschungsanstrengungen gibt es noch keine Heilung für DMD-Patienten. Genbasierte Therapiestrategien wie Exon-Skipping, Unterdrückung von Stoppcodons, Adeno-assoziiertes Virus (AAV)-vermittelte Mini-Dystrophin-Abgabe oder CRISPR/Cas9-Genbearbeitung werden aktiv zur Behandlung von DMD untersucht22,23. Parallel dazu werden auch pharmakologische Behandlungen entwickelt24,25,26,27. Solche Ansätze wirken auf bestimmte Signalwege und zelluläre Ereignisse, einschließlich solcher, die eine Hochregulierung von Utrophin A28,29,30 verursachen können. Dennoch gelten Glukokortikoide immer noch als Goldstandardtherapie und wirken meist als entzündungshemmende Medikamente31. Durch den Einsatz von Steroiden und multidisziplinärer Betreuung, insbesondere mechanischer Beatmung, hat sich die Lebenserwartung von DMD-Patienten erheblich verlängert und die betroffenen Personen können nun ein Alter von 30 bis 40 Jahren erreichen.

Die TGF-β-Signalübertragung spielt eine zentrale Rolle bei der Förderung von Muskelatrophie und -fibrose bei neuromuskulären Erkrankungen. Eine Vielzahl von Liganden, darunter GDF8/Myostatin, GDF11 und Activine, binden an TGF-β-Rezeptoren vom Typ II und lösen bei Aktivierung die Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 aus. Die Smad2/3-Phosphorylierung ermöglicht die Oligomerisierung mit Smad4 und die Translokation in den Zellkern, um in Zusammenarbeit mit FoxO-Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen zu aktivieren, die an der Muskelatrophie beteiligt sind32,33,34. Die Hemmung von Smad2 und Smad3 reicht aus, um Muskelwachstum zu induzieren, und die konstitutive Expression von Smad3 löst Muskelschwund aus35,36. Interessanterweise haben frühere Arbeiten gezeigt, dass ein Crosstalk zwischen der TGF-β- und der mTOR-Signalisierung besteht. Tatsächlich hemmt Myostatin/GDF8 die Akt/mTOR-Signalübertragung über einen Smad3-induzierten Anstieg der PTEN-Translation37. Insgesamt scheint die TGF-β-Signalübertragung ein attraktives pharmakologisches Ziel zur Verhinderung von Muskelatrophie zu sein. Solche medikamentenbasierten Therapien könnten bei atrophischen Erkrankungen, darunter mehreren neuromuskulären Erkrankungen, Kachexie und Sarkopenie, erhebliche Vorteile haben.

HDAC6 ist ein einzigartiges zytoplasmatisches Mitglied der Histondeacetylase (HDAC)-Familie und gehört zur Klasse IIb HDAC38,39. HDAC6 deacetyliert mehrere zytoplasmatische Substrate wie α-Tubulin, Cortactin und HSP90, wohingegen andere HDACs typischerweise zentrale Regulatoren der Genexpression sind. Tatsächlich sind klassische HDACs wie HDAC4 und HDAC5 an der Regulierung von Atrogenen über die Transkriptionsfaktoren Myogenin und Foxo3 beteiligt. In diesem Zusammenhang haben wir zuvor gezeigt, dass HDAC6 ein durch FoxO3a aktiviertes Atrogen ist, das mit der Ubiquitin-Ligase Atrogin1/MAFbx42 interagieren kann. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um spezifische HDAC6-Inhibitoren zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten zu entwickeln. Insbesondere wurden mehrere gegen HDAC6 gerichtete Krebsbehandlungen vorgeschlagen43,44. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Deletion oder Hemmung von HDAC6 bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen von Vorteil ist, darunter amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit45,46,47. Der HDAC-Inhibitor Tubastatin A (TubA) zeichnet sich als hochselektiver HDAC6-Inhibitor aus. Tatsächlich hemmt TubA effizient und spezifisch die HDAC6-Deacetylaseaktivität mit einem IC50 von 15 nM und einer strengen Selektivität für HDAC6 gegenüber allen anderen HDACs (über 1000-fach), mit Ausnahme von HDAC8 (57-fach)46,48,49. Es ist bekannt, dass TubA die TGF-β-induzierte Typ-1-Kollagenexpression in Lungenfibroblasten hemmt50,51 und frühere Berichte haben gezeigt, dass TGF-β die Aktivität von HDAC erhöht650,52. Tatsächlich reguliert Smad7 die Expression von HDAC6 bei Prostatakrebs als Reaktion auf TGF-β53 und HDAC6 könnte eine unverzichtbare Rolle beim Ausgleich der Aufrechterhaltung und Aktivierung von Urfollikeln durch das mechanistische Ziel der Rapamycin-Signalübertragung (mTOR) bei Mäusen spielen54,55.

Frühere Arbeiten mit Pan-HDAC-Inhibitoren haben gezeigt, dass die HDAC-Hemmung den dystrophischen Phänotyp verbessert27,56. Allerdings ist derzeit noch unklar, welcher HDAC an dieser positiven Wirkung beteiligt ist. In einer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass HDAC6 die Stabilität von Mikrotubuli und die Clusterbildung von Acetylcholinrezeptoren (AChR) in normalen Muskelfasern reguliert57. Wir fragten uns daher, ob HDAC6 eine Rolle im Pathomechanismus von DMD spielen und als neues therapeutisches Ziel für die Krankheit genutzt werden könnte. Um dies zu testen, untersuchten wir die Wirkung von TubA, einem hochselektiven Inhibitor von HDAC6, im DMD-mdx-Mausmodell und in C2C12-Zellen. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die pharmakologische Hemmung der HDAC6-Deacetylase-Aktivität mit TubA sowohl funktionell als auch morphologisch von Vorteil für die Muskeln von mdx-Mäusen ist. Eine mechanistische Untersuchung der Wirkungsweise von TubA ergab, dass die HDAC6-Hemmung die TGF-β-Signalübertragung durch eine Erhöhung der Smad3-Acetylierung im Skelettmuskel herunterreguliert.

Um die Wirkung der Hemmung der HDAC6-Deacetylaseaktivität bei Mäusen mit Dystrophinmangel zu bewerten, erhielten 7 Wochen alte mdx-Mäuse täglich intraperitoneale Injektionen von TubA (mdx-TubA) oder Vehikel (mdx-veh) in einer Dosis von 25 mg/kg /Tag wie zuvor beschrieben46,58. Die Mäuse wurden 30 Tage lang behandelt, um einen Vergleich mit früheren präklinischen Studien zu ermöglichen, bei denen diese Behandlungsdauer bei mdx-Mäusen verwendet wurde59,60,61. Als Basiskontrollen wurden unbehandelte Wildtyp-Kontrollmäuse (WT-CTL) verwendet (Abb. 1a). Die Effizienz der Behandlung mit TubA wurde zunächst durch Messung des Anstiegs der Tubulinacetylierung bewertet (Abb. 1b). Wie in Abb. 1c, 1d gezeigt, verursachte die Behandlung mit TubA an 30 aufeinanderfolgenden Tagen erwartungsgemäß einen starken Anstieg der α-Tubulin-Acetylierung im Tibialis anterior (TA)-Muskel von mdx-Mäusen. In Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten57,58 zeigte die Quantifizierung des relativen Gehalts an acetyliertem Tubulin einen Anstieg von ~36,5 % ± 7,8 % nach der Behandlung mit dem selektiven HDAC6-Inhibitor (P < 0,001 im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen). Um zu bestätigen, dass die HDAC6-Hemmung keinen Einfluss auf die Histonacetylierung hatte, wurden die Histon-H3-Acetylierung an Lysin 9 (ac-H3K9) und die gesamten Histon-H3-Spiegel in TA-Muskeln mittels Western Blot ausgewertet. In Übereinstimmung mit der anhaltenden Muskelschädigung bei mdx-Mäusen war die H3K9-Acetylierung in den TA-Muskeln von mdx-Mäusen im Vergleich zu WT-CTL-Tieren erhöht (+43,8 % ± 14,6 %; ergänzende Abb. 1a, b). Der HDAC6-Proteinspiegel war in den mdx-Mausmuskeln im Vergleich zu den WT-CTL-Muskeln erhöht (+97 % ± 18,7 %; ergänzende Abbildung 1c, d). Allerdings erhöhte TubA weder die H3K9-Acetylierung noch die HDAC6-Spiegel in mdx-Mäusen (P > 0,05). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die intraperitoneale Injektion von TubA die HDAC6-Deacetylaseaktivität im Muskel effizient und spezifisch hemmt.

ein Protokoll der TubA-Behandlung. Drei Gruppen von 7 Wochen alten Mäusen wurden 4 Wochen lang entweder ohne Behandlung (Gruppe A, C57BL/10 Mäuse: WT-CTL) oder mit täglicher DMSO-Injektion an 30 aufeinanderfolgenden Tagen (Gruppe B, C57BL/10ScSn) untersucht -Dmdmdx/J-Mäuse; mdx-veh) oder mit TubA bei 25 mg/kg/Tag (Gruppe C, C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J-Mäuse; mdx-TubA). b Um den Grad der Tubulinacetylierung (ac-tubK40) in TA-Muskeln zu bewerten, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Quantifizierungen der Proteinspiegel von acetyliertem α-Tubulin (c) und α-Tubulin (α-tub, d) (n = 4–5 Mäuse pro Gruppe) wurden jeweils auf α-Tubulin und 2,2,2-Trichlorethanol (TCE) normalisiert. . Die Griffstärke wurde auf einem Raster gemessen, das die maximale Griffstärke der Hinterbeine normalisiert auf das Körpergewicht misst (n = 5 Mäuse pro Gruppe). f Der relative Kraftzuwachs wurde anhand der Differenz zwischen der am letzten Tag (Tag 30) und dem Tag vor Beginn der Behandlung (Tag 0) gemessenen Griffstärke berechnet und mit einem gepaarten t-Test (n = 5 Mäuse pro Gruppe) gemessen. g Die spezifische Maximalkraft wurde anhand der besten Griffkraftbewertung bewertet, die bei jedem Tier am 30. Tag erzielt wurde (n = 5 Mäuse pro Gruppe). Um die Konzentrationen von Utrophin A (Utr. A) und β-Dystroglycan (β-DG) in TA-Muskeln zu bewerten, wurden Western-Blot-Analyse (h, k) und Quantifizierung (i, l) durchgeführt (n = 4 Mäuse pro Gruppe). TCE wurde als Ladekontrolle verwendet. Querschnitte des EDL-Muskels wurden mit einem Antikörper gegen Utrophin A (j, in Grau) oder gegen β-Dystroglycan (m, in Grau) gefärbt. Maßstabsbalken: 50 μm. n 4 Tage alte C2C12-Myotubes, die 24 Stunden lang mit verschiedenen HDAC6-Inhibitoren TubA (5 μM) und Tubacin (TBC, 5 μM) oder mit DMSO (CTL) vorbehandelt wurden. o Repräsentative Western Blots, die Utrophin A zeigen. GAPDH wurde als Ladungskontrolle verwendet. p Quantifizierung der mit GAPDH normalisierten Utrophin-A-Proteinspiegel (n = 3 unabhängige Experimente quantifiziert). (c, d, e, f, g, i, l, p) Whiskers min bis max; Die Linie in der Mitte des Kastens wird als Median eingezeichnet. *P < 0,05; **P < 0,01; ns, nicht signifikant, P > 0,05; Mann-Whitney-U-Test. kDa, relatives Molekulargewicht in KiloDalton.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung der TubA-Behandlung auf die Muskelkraft bei mdx-Mäusen. Sieben Wochen alte unbehandelte mdx-Mäuse zeigten im Vergleich zu WT-CTL-Mäusen eine signifikant geringere Griffstärke für alle Pfoten (P <0, 01) (Abb. 1e). Nach 30-tägiger Behandlung mit TubA war die Griffkraft von mdx-Mäusen signifikant um das 1,5-fache erhöht (P < 0,05 im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen; Abb. 1e), mit einem erheblichen Kraftzuwachs über 30 Tage (P < 0,05; Abb . 1f). Die TubA-Behandlung stellte die Muskelkraft von mdx-Mäusen fast vollständig auf WT-Niveau wieder her (P = 0,5476 im Vergleich zu WT-CTL-Mäusen; Abb. 1e). Interessanterweise war die maximale Kraft bei mit TubA behandelten mdx-Mäusen im Vergleich zu mdx-veh-Tieren ebenfalls um 35 % ± 9,0 % erhöht, obwohl sie aufgrund interindividueller Variabilität nicht das Signifikanzniveau erreichte (P = 0,062; Abb. 1 g). Um die Muskelermüdbarkeit zu bewerten, wurde nach 30 Tagen TubA-Behandlung eine Reihe von 8 aufeinanderfolgenden Grifftests in 15-Sekunden-Intervallen durchgeführt. Mit Vehikel behandelte mdx-Mäuse zeigten einen fortschreitenden Kraftverlust, was auf Müdigkeit hindeutet. Die Behandlung mit TubA verhinderte effizient diesen Abfall der Griffstärke, mit einer Steigerung der Griffstärke beim Höhenzug um 24,5 % ± 6,4 % im Vergleich zu mit Vehikel behandelten mdx-Mäusen (P < 0,05; ergänzende Abbildung 1e). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Hemmung der HDAC6-Deacetylase-Aktivität bei mdx-Mäusen die Muskelkraft und Ermüdbarkeit auf WT-Niveau wiederherstellt.

Aufgrund seiner funktionellen und strukturellen Ähnlichkeit mit Dystrophin kann Utrophin A den Mangel an Dystrophin bei DMD ausgleichen24,29,62,63. In erwachsenen und gesunden Muskelfasern ist Utrophin A ausschließlich an myotendinösen Übergängen und Synapsen lokalisiert64,65 und es ist inzwischen gut erwiesen, dass die Expression von Utrophin A entlang der gesamten Muskelfasern den Mangel an Dystrophin effizient ausgleichen kann24,29,66,67,68. Mdx-Mäuse weisen insgesamt einen milderen Phänotyp auf als DMD-Patienten69. Dies wird teilweise durch die kompensatorische Hochregulierung der sarkolemmalen Utrophin-A-Expression erklärt24,25,29,62,63,70,71. Muskeln aller in Abb. 1a beschriebenen Tiergruppen wurden daher mittels Western Blot und Immunfluoreszenz analysiert, um die Utrophin-A-Spiegel zu bestimmen. Wie erwartet waren die Utrophin-A-Spiegel am Sarkolemma (P <0, 05, Abb. 1 h) in mdx erhöht Mäuse im Vergleich zu WT-CTL-Mäusen. Die TubA-Behandlung erhöhte die Utrophin-A-Spiegel im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen um das etwa Zweifache (P <0,05; Abb. 1i). Immunfluoreszenzexperimente ergaben außerdem, dass die TubA-Behandlung tatsächlich zu einem Anstieg der sarkolemmalen Utrophin-A-Spiegel in den Muskeln von mdx-Mäusen führte, was möglicherweise zu einer stärkeren Schutzwirkung auf die Muskelfaserintegrität führte (Abb. 1j). Darüber hinaus haben wir sowohl die Menge als auch die Lokalisierung von β-Dystroglycan (β-DG), einem Mitglied des DGC, untersucht, um festzustellen, ob die TubA-Behandlung den Wiederaufbau des DGC entlang des Sarkolemmas verursacht. Wie erwartet ist in Abwesenheit von Dystrophin die β-DG-Akkumulation an der Plasmamembran stark verringert (Abb. 1k, m). Die Western-Blot-Quantifizierung ergab, dass TubA die Menge an β-DG in mdx-Mäusen um 43,2 % ± 7,0 % erhöhte (P < 0,05; Abb. 1 l). Immunfluoreszenzexperimente mit TubA (Abb. 1 m) zeigten, dass zusätzlich zum Anstieg der Utrophin-A-Spiegel auch die β-DG-Akkumulation an der Plasmamembran zunahm, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit TubA den Wiederaufbau des DGC-Komplexes förderte.

Um festzustellen, ob die Auswirkungen von TubA auf die DGC-Expression auch in kultivierten Muskelzellen beobachtet wurden, wurden C2C12-Myotubes 24 Stunden lang mit 5 µM eines von zwei selektiven Inhibitoren der HDAC6-Deacetylaseaktivität behandelt: TubA und Tubacin72 (TBC; Abb. 1n). Nach der Behandlung wurde die Utrophin-A-Expression an Ganzzellextrakten mittels Western Blot bewertet (Abb. 1o). Beide HDAC6-Inhibitoren induzierten in C2C12-Muskelzellen im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Zellen eine signifikante Hochregulierung des Utrophin-A-Spiegels um das 1,75-fache (P <0,05) (Abb. 1p). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Behandlungen mit HDAC6-Inhibitoren die Utrophin-A-Spiegel in C2C12-Myotubes erhöhen, was mit den in vivo mit mdx-Mäusen gewonnenen Daten übereinstimmt.

Um festzustellen, ob die TubA-Behandlung zusätzliche Vorteile für die mdx-Muskelfasern brachte, wurde die Muskelatrophie untersucht. Frühere histopathologische Studien haben gezeigt, dass eine abnormale Fasergrößenverteilung mit einer starken Zunahme sehr kleiner Fasern ein Kennzeichen dystrophischer Muskeln ist73. Die Fasergrößenverteilung wurde daher durch Messung der Querschnittsfläche (CSA) einzelner Fasern im langsamen oxidativen Soleus-Muskel (SOL) und im schnellen glykolytischen Extensor-digitorum-longus-Muskel (EDL) von mit TubA oder Vehikel behandelten mdx-Mäusen beurteilt Kontrollmäuse. Wie erwartet zeigten die CSA-Profile der mit Vehikel behandelten mdx-Muskeln eine erhebliche Heterogenität und wiesen im Vergleich zu gesunden Muskeln viele kleine Fasern auf (Abb. 2a, b). In allen analysierten Muskeln stellte TubA die Fasergrößenverteilung auf ein mit dem der WT-Muskeln vergleichbares Niveau wieder her, indem der Anteil kleiner Muskelfasern deutlich verringert und der Anteil großer Muskelfasern verringert wurde (Abb. 2c, d). Bei mit TubA behandelten mdx-Mäusen gingen diese Muskelanpassungen mit einer signifikanten Abnahme des durchschnittlichen Varianzkoeffizienten einher. Tatsächlich reduzierte die TubA-Behandlung den Varianzkoeffizienten der Faser-CSA in mdx-EDL- und SOL-Muskeln um ~25 % (P <0,01 im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen) (Abb. 2e, f). Insgesamt normalisierte die 30-tägige Behandlung mit TubA die Fasergrößenverteilung sowohl in den EDL- als auch in den SOL-mdx-Muskeln, was auf eine schützende Wirkung von TubA gegen Muskelatrophie und -degeneration hinweist.

Querschnittsflächen (CSA) der gesamten EDL- (a) und SOL-Muskeln (b) von 11 Wochen alten C57BL/10-Mäusen (WT-CTL) und C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J-Mäusen, die mit Vehikel-DMSO (mdx) behandelt wurden -veh) oder mit TubA (mdx-TubA) für 30 aufeinanderfolgende Tage wurden mittels Lamininfärbung gefärbt und dann auf ImageJ binarisiert (n = 5 Mäuse pro Gruppe). Maßstabsbalken: 500 μm. Grafische Zusammenfassung der CSA im EDL- (c) und SOL-Muskel (d) (n = 5 Mäuse pro Gruppe; gesamte EDL- und SOL-Muskeln wurden pro Maus gezählt). c, d Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; Zweifaktorielle ANOVA (mdx-TubA versus mdx-veh). Die mittleren CSAs jedes Muskels werden über den Frequenzhistogrammen angezeigt. Messungen des Varianzkoeffizienten in EDL- (e) und SOL-Muskelfasern (f) (n = 5 Mäuse pro Gruppe). Um die Konzentrationen von MAFbx (g, h) und MuRF1 (i, j) in TA-Muskeln zu bewerten, wurden Western-Blot-Analysen (g, i) und Quantifizierungen (h, j) durchgeführt (n = 5 Mäuse pro Gruppe). k Repräsentative Beispiele von Querschnitten von EDL- und SOL-Muskeln wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Maßstabsbalken: 100 µm. Zentral kernhaltige Fasern sind grün gefärbt. Prozentsatz der zentralen Keimbildung in EDL- (l) und SOL-Muskelfasern (m) (n = 4 oder 5 Mäuse pro Gruppe). Um die Konzentrationen von Kollagen Typ I Alpha 1 (n, o, Col1A1) und Bindegewebswachstumsfaktor (p, q, CTGF) in TA-Muskeln zu bewerten, wurden Western-Blot-Analysen (n, p) und Quantifizierungen (o, q) durchgeführt ( n=4 Mäuse pro Gruppe). TCE wurde als Ladekontrolle für alle Western Blots verwendet. Um den Grad der Kollageninfiltration zu bewerten, wurden Massons Trichrom-Färbung (r) und Quantifizierung (s) im SOL-Muskel durchgeführt. Maßstabsbalken: 500 µm. Fibrotische Bereiche sind blau gefärbt (n = 28–50 Felder pro Maus, 3 Mäuse pro Gruppe). (e, f, h, j, l, m, o, q, s) Whiskers min bis max; Die Linie in der Mitte des Kastens wird als Median eingezeichnet. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns, nicht signifikant, P > 0,05; Mann-Whitney-U-Test. kDa, relatives Molekulargewicht in KiloDalton.

Wir haben zuvor gezeigt, dass HDAC6 zur Muskelatrophie beiträgt42. Angesichts der allgemeinen Zunahme der Fasergröße, die bei der Behandlung mit TubA in mdx-Muskeln beobachtet wurde, untersuchten wir den Mechanismus, durch den die pharmakologische Hemmung von HDAC6 die Muskelatrophie bei mdx-Mäusen verringerte (Abb. 2 g, i). Zu diesem Zweck wurde die Expression von Proteinmarkern, die an der Muskelatrophie beteiligt sind, mittels Western Blot ausgewertet. TubA verursachte eine Reduzierung von MAFbx/Atrogin1 um 57 % ± 11 % (P < 0,05; Abb. 2 h) und eine Reduzierung der E3-Ubiquitin-Protein-Ligase MuRF1/TRIM63 um 35 % ± 4 % (P < 0,05; Abb. 2j). im Vergleich zu mdx-veh-Tieren. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die HDAC6-Hemmung die Expression wichtiger Mediatoren der Muskelatrophie verringert und somit eine Erklärung für die Normalisierung der Muskelfasergröße liefert.

Darüber hinaus resultiert die Heterogenität der mdx-Fasergröße hauptsächlich aus dem Vorhandensein kleiner regenerierender Fasern nach dem Verlust nekrotischer Fasern. Die zentrale Keimbildung ist ein Schlüsselindikator für Muskelschäden in dystrophischen Muskelfasern73,74. Um die Wirkung von TubA auf das Ausmaß der Muskelschädigung zu bewerten, wurde die Anzahl der Fasern mit zentralen Kernen mithilfe der Hämatoxylin-Eosin-Färbung bewertet (Abb. 2k). TubA verursachte eine signifikante Abnahme der Anzahl zentronukleierter Fasern (–15 % ± 2 % im EDL-Muskel, Abb. 2 l und –24 % ± 2 % im SOL-Muskel, Abb. 2 m; beide P < 0,05, verglichen mit mdx -Fahrzeugmäuse). Darüber hinaus geht der Verlust von Muskelfasern mit der fortschreitenden Ansammlung von fibrotischem Gewebe einher75. Wir haben daher mittels Western Blot untersucht, ob die Expression von Fibrose-assoziierten Proteinen in mdx-Muskeln durch TubA reduziert wurde (Abb. 2n, p). Die Proteinspiegel der Typ-I-Kollagen-Alpha-1-Kette (Col1A1) und des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF) waren beide bei mit TubA behandelten mdx-Mäusen im Vergleich zu mit Vehikel behandelten mdx-Mäusen verringert (–36 % ± 7 %, Abb. 2o und –16). % ± 1 %, Abb. 2q; bzw. P < 0,05). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde Massons Trichrom-Färbung an Kryoschnitten von SOL- (Abb. 2r) und EDL-Muskeln (ergänzende Abb. 2a) durchgeführt. TubA verringerte die fibrotische Fläche im mdx SOL-Muskel signifikant (P < 0,001; Abb. 2s) im Vergleich zum Kontroll-mdx SOL (mit Vehikel behandelt). Im EDL-Muskel erreichte der TubA-Effekt auf die gesamte kollagenpositive Oberfläche keine Signifikanz (P > 0,05; ergänzende Abbildung 2b). Dennoch verhinderte TubA effizient die Bildung von Bereichen mit hohem Kollagengehalt im mdx-EDL-Muskel. Insgesamt zeigen diese Daten, dass die HDAC6-Hemmung in dystrophischen Muskeln die zentrale Keimbildung reduziert, die Fasergrößenverteilung normalisiert, den Anteil kleiner Fasern verringert und Fibrose verhindert.

Dystrophin und Utrophin A verbinden den DGC-Komplex mit dem Mikrotubuli-Netzwerk10,76. In Übereinstimmung mit früheren Daten 10, 77 haben wir durch Western Blot und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt, dass TA- und EDL-Muskelfasern von mdx-Mäusen mehr Tubulin bzw. eine größere Mikrotubulidichte aufweisen als WT-CTL-Mäuse (P <0, 05, Abb. 1d und Ergänzung). Abb. Abb. 3a, b). Die Behandlung mit TubA hatte jedoch keinen Einfluss auf die Gesamthäufigkeit von α-Tubulin (P > 0,05 im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen; Abb. 1d). Im gesunden Muskel bildet das Mikrotubuli-Netzwerk ein Gitter mit longitudinalen, transversalen und perinuklearen Mikrotubuli78,79,80. Hier haben wir bei WT-CTL-Mäusen beobachtet, dass transversale und longitudinale Mikrotubuli regelmäßig einen Abstand von ∼2 µm bzw. ∼5 µm haben (siehe Pfeilspitzen in Abb. 3a und ergänzende Abb. 3c – e). In mdx-Muskeln zeigen Immunfluoreszenzexperimente eine Desorganisation des Mikrotubuli-Netzwerks mit einem Verlust der gitterartigen Organisation (siehe Pfeile Abb. 3a). Interessanterweise wurde bei mit TubA behandelten mdx-Mäusen das Mikrotubuli-Gitter wiederhergestellt (siehe den Abstand zwischen Mikrotubuli in den blauen und gelben Linienscans und in der ergänzenden Abbildung 3c – e). Wir haben das Mikrotubuli-Netzwerk weiter mit einer Software analysiert, die speziell für die Analyse der Mikrotubuli-Direktionalität81 entwickelt wurde (TeDT-Programm; Abb. 3b). Die Analyse des TeDT-Programms ergab einen signifikanten Rückgang der quer ausgerichteten Mikrotubuli (zentriert um 90°) in mit Vehikel behandelten mdx-Muskeln im Vergleich zu WT und mit TubA-behandelten mdx-Mäusen (P < 0,05 im Vergleich zu mdx-veh-Mäusen). Diese Daten zeigen, dass die TubA-Behandlung die Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks in den MDX-Muskeln verbessert. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten57,82 zeigt dies weiter, dass die Acetylierung von Mikrotubuli durch HDAC6-Hemmung Mikrotubuli stabilisiert und ihre Querausrichtung begünstigt.

a, c Isolierte Fasern von TA aus 11 Wochen alten C57BL/10-Mäusen (WT-CTL) und C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J-Mäusen, behandelt mit Vehikel-DMSO (mdx-veh) oder mit TubA (mdx-TubA) für 30 aufeinanderfolgende Tage wurden mit einem Antikörper gegen β-Tubulin (ß-tub) angefärbt, um das MT-Netzwerk (a, in Rot) zu markieren, oder mit α-Bungarotoxin-A488 (c, in Grün, α-BTX-A488) angefärbt, um NMJs zu markieren . Maßstabsbalken: 25 μm. b MT-Netzwerkorganisationsanalyse mit TeDT-Software (n = 4 bis 6 Fasern von 3 Mäusen). Das endgültig generierte Diagramm stellt eine globale Bewertung für jeden gegebenen Grad der MT-Ausrichtung dar, wobei 0 und 180 Grad dem Längs-MT und 90 Grad dem Quer-MT entsprechen; Richtungshistogramme (HD). Pfeilspitzen stellen eine regelmäßige Organisation des MT-Netzwerks dar, während Pfeile eine Desorganisation des MT-Netzwerks mit einem Verlust der gitterartigen Organisation zeigen. Es wurde eine grafische Zusammenfassung des NMJ-Endplattendurchmessers (d) und der NMJ-Kompaktheit (e) erstellt. d, e, *, ** und *** Vergleich zwischen mdx-veh- und mdx-TubA-Mäusen. Der Medianwert jeder Mäusegruppe wird über den Häufigkeitshistogrammen angezeigt (n = 40–75 NMJs gezählt). Die Verteilung der Anzahl der Fragmente (f) und des Fragmentierungsindex (g) wurden quantifiziert (n = 43–73 der gezählten NMJs). g Whiskers min. bis max.; Die Linie in der Mitte des Kastens wird als Median eingezeichnet. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; (mdx-TubA versus mdx-veh), Mann-Whitney-U-Test.

Die stark fragmentierte Verteilung des postsynaptischen Acetylcholinrezeptors (AChR), die in mdx-Muskeln beobachtet wird, lässt stark darauf schließen, dass Dystrophin an der Aufrechterhaltung des NMJ83 beteiligt ist. Da die HDAC6-Hemmung die Kompaktheit der AChR-Verteilung am NMJ57 erhöht, analysierten wir die NMJ-Organisation in Kontroll- und behandelten mdx-Mäusen (Abb. 3c). Die α-Bungarotoxin-Färbung, die zur Visualisierung des Acetylcholinrezeptors verwendet wurde, zeigte, dass die NMJ-Organisation bei Kontrollmäusen, die mit mdx-veh behandelt wurden, im Vergleich zu Kontroll-WT-NMJs stark beeinträchtigt war (Abb. 3c, d), wie aus früheren Arbeiten erwartet 84, 85, 86. Genauer gesagt und im Vergleich zu WT-Muskeln war die Kompaktheit der mdx-veh-NMJs um 26 % ± 11 % verringert (P < 0,05; Abb. 3e), die Gesamtoberfläche der NMJs war um 38 % ± 18 % vergrößert (P < 0,05). ; Abb. 3d), der Fragmentierungsindex wurde um etwa das Doppelte erhöht (P < 0,001; Abb. 3g) und die durchschnittliche Anzahl von Fragmenten pro NMJ wurde erhöht (P < 0,001; Abb. 3f). Die TubA-Behandlung normalisierte die NMJ-Oberfläche (–24 % ± 13 %, P < 0,05 im Vergleich zu mit Vehikel behandelten mdx-NMJs; Abb. 3d) und die Kompaktheit (+31,3 % ± 12,5 %, P < 0,05 im Vergleich zu mit Vehikel behandelten mdx-NMJs) nahezu wieder ; Abb. 3e und ergänzende Abb. 3f, g). Im Vergleich zu mit Vehikel behandelten mdx-Mäusen normalisierte TubA auch teilweise den Fragmentierungsindex –13,2 % ± 2 % (P < 0,05; Abb. 3g) und die Anzahl der Fragmente pro NMJ (+63 % ± 1 % der NMJs, bestehend aus 1 bis). 3 Fragmente, P < 0,05; Abb. 3f). Insgesamt stellte die TubA-Behandlung durch eine Erhöhung der Kompaktheit und die Rekrutierung von AChR-Patches die normale AChR-Verteilung in den Muskelfasern der mdx-Maus teilweise wieder her.

Es ist bekannt, dass die Dystrophin-Transkription auch über den mTOR-Signalweg gesteuert wird87. Tatsächlich führt ein mTOR-Mangel zu einem verringerten Muskeldystrophingehalt und verursacht dystrophische Defekte, die zu schwerer Myopathie führen. In diesem Zusammenhang untersuchten wir, ob die HDAC6-Hemmung im mdx-Muskel die Proteinsynthese fördern könnte, indem wir die Phosphorylierung verschiedener Komponenten des mTOR-Signalwegs maßen (Abb. 4a). Der mTOR-Proteinspiegel wurde durch die TubA-Behandlung nicht signifikant verändert (P = 0,342; Abb. 4b, c), wohingegen ein etwa zweifacher Anstieg der p70-S6-Kinase-Phosphorylierung bei Threonin 389 beobachtet wurde (P <0,05; Abb. 4d, e). . In Übereinstimmung mit der erhöhten p70-S6-Kinaseaktivität beobachteten wir einen etwa zweifachen Anstieg der Phosphorylierung von S6 sowohl auf Ser235-236 als auch auf Ser240-244 (P <0, 05; Abb. 4f, g, h). Schließlich induzierte TubA einen signifikanten Anstieg der Phosphorylierung des Translationsinhibitors 4E-BP1 an den mTOR-sensitiven Stellen, wie durch den Anstieg des Verhältnisses von 4E-BP1 γ gegenüber 4E-BP1 β-Isoformen für Phospho-Thr37-46, Phospho, gezeigt wird -Thr70 sowie für insgesamt 4E-BP1 (Abb. 4i, j, k, l). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass eine 30-tägige Behandlung mit TubA die Muskelproteinsynthese bei mdx-Mäusen über den mTOR-Signalweg stimuliert.

eine schematische Zusammenfassung der nachgelagerten Ziele von mTOR. 11 Wochen alte C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J-Mäuse, die 30 aufeinanderfolgende Tage lang mit TubA (mdx-TubA) oder mit Vehikel-DMSO (mdx-veh) behandelt wurden, wurden mittels Western-Blot-Analyse (b, d, f, i). Quantifizierungen von mTOR (c), pp70 S6-Kinase (e, T389), pS6 (g, S240/244), pS6 (h, S235/236), p4E-BP1 (j, T37/46), p4E-BP1 (k , T70) und 4E-BP1 (l) wurden durchgeführt (n = 4 Mäuse pro Gruppe). TCE wurde als Ladekontrolle verwendet. (c, e, g, h, j, k, l) Whiskers min bis max; Die Linie in der Mitte des Kastens wird als Median eingezeichnet. *P < 0,05; ns, nicht signifikant, P > 0,05; Mann-Whitney-U-Test. kDa, relatives Molekulargewicht in KiloDalton.

Um festzustellen, ob die Wirkung von TubA auf den mTOR-Signalweg auch in kultivierten Muskelzellen beobachtet wurde, wurden C2C12-Myotubes 24 Stunden lang mit TubA vorbehandelt und dann mit Rapamycin, einem selektiven Inhibitor des mTOR-Komplexes 1 (mTORC1), behandelt (ergänzende Abb. 4a). Nach der Behandlung wurde die Phosphorylierung des S6-Proteins an Ganzzellextrakten mittels Western Blot bewertet (ergänzende Abbildung 4b). Basierend auf den In-vivo-Daten erhöhte die Behandlung mit TubA erwartungsgemäß die S6-Phosphorylierung in C2C12-Muskelzellen im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Zellen (ergänzende Abbildung 4c, d). In Gegenwart von Rapamycin war die S6-Phosphorylierung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TubA drastisch reduziert (P <0,001; ergänzende Abbildung 4c, d). Daher wirkt die HDAC6-Hemmung vor dem mTOR-Komplex, um den Signalweg zu aktivieren. In diesen Experimenten haben wir auch untersucht, ob der Anstieg der Utrophin-A-Expression durch die TubA-Behandlung auf dem mTOR-Signalweg beruht. Die Utrophin-A-Expression wurde in Gegenwart von TubA mit oder ohne Rapamycin bewertet. Rapamycin verhinderte die Hochregulierung von Utrophin A durch TubA, was darauf hinweist, dass der durch TubA induzierte Anstieg von Utrophin A den mTOR-Signalweg betrifft (ergänzende Abbildung 4f). Sowohl die mTOR- als auch die TGF-β-Signalübertragung spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Muskelmasse und diese Signalwege sind miteinander verbunden37,88.

Die Auswirkungen von TubA auf den mTOR-Signalweg, Muskelatrophie und Fibrose veranlassten uns zu untersuchen, ob die HDAC6-Hemmung die TGF-β-Signalübertragung beeinflusst. Die durch das TGF-β-Mitglied Myostatin induzierte Muskelatrophie beinhaltet die Smad2/3-Signalisierung, die die MAFbx-Expression aktiviert und die mTOR-Signalisierung herunterreguliert89,90. Smad2/3-Proteine ​​benötigen Phosphorylierung, um in den Zellkern einzudringen und seine Zielgene zu aktivieren91. Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass Smad2/3-Proteine ​​im Zellkern acetyliert werden92,93. Maus-C2C12-Myoblasten wurden 24 Stunden lang entweder mit Vehikel (DMSO), TubA oder SB431542 (SB43), einem spezifischen Inhibitor des TGF-β/Activin/NODAL-Signalwegs, behandelt94. Nach der Entfernung der Inhibitoren wurden C2C12-Myoblasten 30 Minuten lang rekombinantem humanem TGF-β195 (rhTGF-β1) ausgesetzt und die subzelluläre Lokalisierung von Smad2/3 wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-acetyliertem Tubulin und Anti-Smad2/3-Antikörpern analysiert.

Die TubA-Behandlung erhöhte in ähnlicher Weise die Tubulinacetylierung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von rhTGF-β1, was darauf hinweist, dass die TGF-β-Signalisierung die HDAC6-Deacetylaseaktivität nicht beeinflusst (Abb. 5a und ergänzende Abb. 3a, c). Wie erwartet96,97 erhöhte die rhTGF-β1-Behandlung die Smad2/3-Phosphorylierung bei den Serinen 465–467 bzw. 423–425 (ergänzende Abbildung 3b). Immunfluoreszenz- bzw. Western-Blot-Experimente in C2C12-Zellen zeigten übereinstimmend, dass rhTGF-β1 die Phosphorylierung und nukleare Akkumulation von Smad2/3 erhöhte, die durch SB43 blockiert wurden (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 5a – d). In Gegenwart von TubA waren die Smad2/3-Phosphorylierung und die Kernakkumulation stark verringert (Abb. 5a – d, f – h und ergänzende Abb. 5a – d), und diese Verringerung korrelierte mit einem Anstieg der Acetylierung von Smad3 (P < 0,05, Abb. 5e). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde eine Zellfraktionierung in Gegenwart oder Abwesenheit von TubA durchgeführt, um eine zytosolische Fraktion (CE) und eine Kernfraktion zu trennen, wobei letztere weiter in einen Kernextrakt (NE) und einen Chromatinextrakt (Chrm) unterteilt wurde. . In Gegenwart von TubA war das zytoplasmatische Verhältnis von nuklearem PhosphoSmad3 zu zytoplasmatischem PhosphoSmad3 umgekehrt, was bestätigte, dass die HDAC6-Hemmung die nukleare Translokation von Smad3 reduzierte (Abb. 5f, g).

a–e 4 Tage alte C2C12-Myoblasten, die 24 Stunden lang entweder mit HDAC6-Inhibitor (TubA, 5 μM) oder selektivem Inhibitor von TGF-β1 (SB43, 5 μM) oder mit DMSO (CTL) vorbehandelt wurden. Anschließend wurden die Myoblasten 30 Minuten lang mit rekombinantem humanem TGF-β1 (rhTGF-β1; 10 ng/ml) behandelt. a Myoblasten wurden mit Antikörpern gegen Smad2/3 (in grün) und acetyliertem Tubulin (ac-tub, in rot) doppelt gefärbt. Kerne wurden mit DAPI (in Blau) gekennzeichnet. Maßstabsbalken: 50 µm. b Grafische Zusammenfassung der Kernverteilung der Smad2/3-Fluoreszenzintensität aus drei unabhängigen Experimenten; Zweiwege-ANOVA (TubA+rhTGF-β1 versus DMSO + rhTGF-β1). c Die Niveaus der Smad2/3-Phosphorylierung (pSmad), der Smad2/3-Acetylierung (ac-Smad), des Smad2/3, des acetylierten α-Tubulins (ac-tub) und des α-Tubulins (α-tub) wurden durch Western-Blot-Analyse sichtbar gemacht . Um den Grad der Smad2/3-Phosphorylierung (d) und Smad3-Acetylierung (e) in C2C12-Zellen zu bewerten, wurden Quantifizierungen durchgeführt (n = 5 unabhängige Experimente quantifiziert); Mann-Whitney-U-Test. f, g Es wurde eine Zellfraktionierung in drei Fraktionen durchgeführt: Zytosolfraktion (CE), Kernextrakt (NE) und Chromatinextrakt (Chrm). f Die Niveaus der Smad3-Phosphorylierung (S423-425), Smad2/3, acetyliertem α-Tubulin (ac-tub-K40), GAPDH, HIRA und Histon H3 (H3) wurden durch Western Blot aus drei unabhängigen Experimenten sichtbar gemacht. g Quantifizierungen der Verteilung der Smad3-Phosphorylierung (S423-425); Zweifaktorielle ANOVA. Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) wurden mit Antikörpern gegen Smad2/3 durchgeführt. qPCR-Amplifikationen immunpräzipitierter Promotorregionen des MAFbx- (h) oder MuRF1-Gens (i) wurden verwendet, um das Vorhandensein dieser DNA-Fragmente in Immunpräzipitaten nachzuweisen (h, i, n = 3 unabhängige Experimente); Mann-Whitney-U-Test. *, P < 0,05. (j, k, l, m, n) 11 Wochen alte C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J-Mäuse, die 30 aufeinanderfolgende Tage lang mit Vehikel-DMSO (mdx-veh) oder mit TubA (mdx-TubA) behandelt wurden, wurden analysiert TA-Muskel durch Western-Blot-Analyse (j) und quantifiziert (k, l, m, n). Um den Grad der Smad3-Acetylierung (k), Smad2-Acetylierung (l), Smad3-Phosphorylierung (m) und Smad2/3 (n) in TA-Muskeln zu bewerten, wurden Quantifizierungen durchgeführt (n = 4 Mäuse pro Gruppe); Mann-Whitney-U-Test. TCE wurde als Ladekontrolle für alle Western Blots verwendet. (d, e, k, l, m, n) Whiskers min bis max; Die Linie in der Mitte des Kastens wird als Median eingezeichnet. (b, g, h, i) Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns, nicht signifikant, P > 0,05. kDa, relatives Molekulargewicht in KiloDalton.

Um die funktionellen Auswirkungen dieser zellulären Umverteilung zu untersuchen und festzustellen, ob TubA die Aktivierung von Smad2/3-Zielgenen beeinflusst, wurde ein Smad2/3-ChIP-Assay an C2C12-Zellen durchgeführt, die mit rhTGF-β1 oder rhTGF-β1 plus TubA behandelt wurden. Mutmaßliche Smad-Bindungsstellen wurden durch Softwareanalyse stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle in den Promotoren von MAFbx und MuRF1 identifiziert, dh zwischen den Positionen –618 und –424 und den Positionen –319 und –205 für MAFbx und zwischen den Positionen –727 und –608 für MURF1. Die Promotorregionen –1978 bis –1805 und –1320 bis –1232 wurden als Negativkontrollen für MAFbx bzw. MURF1 verwendet. Das Vorhandensein von TubA reduzierte die Bindung von Smad2/3 an die Promotoren von MAFbx (–63 % ± 12 % und –34 % ± 4 %) und MURF1 (–38 % ± 7 %) an ihren vorhergesagten Bindungsregionen (P < 0,05; Abb. 5h, i), was die Zellfraktionierungsdaten gut ergänzt.

Es ist bekannt, dass die TGF-β-Signalisierung in dystrophischen Muskeln hochreguliert ist98. Um in vivo zu bestätigen, dass die HDAC6-Hemmung die TGF-β-Signalübertragung herunterreguliert, wurden die Smad2/3-Acetylierung und -Phosphorylierung durch Western Blot in TA-Muskeln von mdx-Mäusen untersucht, die mit Vehikel-DMSO oder TubA behandelt wurden (Abb. 5j). Bei mit TubA behandelten mdx-Mäusen war die Smad3-Acetylierung an Lys19 fast dreimal höher als bei mit DMSO behandelten mdx-Mäusen (P < 0,05; Abb. 5k), wohingegen die Smad2-Acetylierung unbeeinflusst blieb (P > 0,05; Abb. 5l). Dieser Anstieg der Smad3-Acetylierung ging mit einer 55 % ± 4 %igen Abnahme der Smad3-Phosphorylierung auf Ser432-425 einher (P < 0,05; Abb. 5m). Bei mdx-Mäusen neigte die TubA-Behandlung dazu, den Gesamtspiegel von Smad2/3 im Vergleich zu mdx-veh-Tieren zu erhöhen. Dieser Anstieg war jedoch statistisch nicht signifikant (P = 0,0571; Abb. 5n). Die Wirkung von TubA auf die Smad4- und Smad7-Spiegel wurde ebenfalls bewertet, und bei den Kontrollen wurde kein Unterschied beobachtet (ergänzende Abbildung 5e – h).

Die Mechanismen, die die mTOR- und TGF-β/Smad-Signalwege verbinden, sind noch wenig verstanden. Dennoch wurde zuvor gezeigt, dass Smad3 die Translation von PTEN-mRNAs aktiviert und dadurch die Akt/mTOR-Signalübertragung und die Proteinsynthese hemmt (ergänzende Abbildung 5i). Wir untersuchten daher eine mögliche Herunterregulierung der PTEN-Expression infolge der Smad 3-Hemmung durch TubA. Sowohl in mdx-Mausmuskeln als auch in C2C12-Zellen induzierte TubA eine Abnahme der PTEN-Proteinspiegel (P <0, 05; ergänzende Abbildung 5j – m). Die Akt-Proteinspiegel und die Phosphorylierung wurden ebenfalls untersucht und stimmten mit der Abnahme der PTEN-Spiegel überein. Sowohl die Akt1- als auch die Akt2-Proteinspiegel und die Phosphorylierung waren in Gegenwart von TubA erhöht (P <0, 05; ergänzende Abb. 5n–s). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass TubA höchstwahrscheinlich den mTOR-Signalweg über Smad3 und PTEN aktiviert.

Hier haben wir die Wirkung der HDAC6-Hemmung durch TubA bei mdx-Mäusen und in C2C12-Muskelzellen untersucht. Die TubA-Behandlung verbesserte die mdx-Muskelfunktion deutlich und verringerte die gesamten histopathologischen dystrophischen Merkmale. Auf der Suche nach dem Wirkmechanismus von HDAC6 entdeckten wir, dass HDAC6 die TGF-β-Signalisierung über die Acetylierung von Smad3 regulierte und identifizierten Smad3 somit als neues Ziel von HDAC6. TubA erhöhte die Smad3-Acetylierung, verhinderte die Smad2/3-Phosphorylierung und die nukleare Translokation, verringerte dadurch die Expression von Atrogenen wie MAFbx und MuRF1 und regulierte den mTOR-Signalweg hoch. Insgesamt kann dieser Mechanismus die vorteilhafte Wirkung der HDAC6-Hemmung zur Bekämpfung von Muskelatrophie und -fibrose in mdx-Muskeln erklären (Abb. 6).

HDAC6-Inhibitoren wie TubA induzieren eine Abnahme der HDAC6-Aktivität, die zu einer Acetylierung von α-Tubulin und Smad3 führt. Die pharmakologische Hemmung von HDAC6 ermöglicht eine Erhöhung der α-Tubulin-Acetylierung, um DGC wiederherzustellen und die MT-Netzwerk-/NMJ-Organisation zu stabilisieren. Darüber hinaus erhöht die spezifische Hemmung von HDAC6 die Acetylierung von Smad3, was die TGF-β-Signalübertragung stören kann, um sowohl die Muskelatrophie durch Reduzierung der Expression von Schlüsselakteuren wie MAFbx/MuRF1 zu reduzieren als auch die Proteinsynthese über den mTOR-Weg zu stimulieren. Unsere Ergebnisse identifizieren HDAC6 als ein pharmakologisches Ziel von Interesse für DMD.

HDAC6 wird in vielen Geweben des Körpers exprimiert38. Bei Krebs ist HDAC6 überexprimiert und korreliert bekanntermaßen mit einer schlechten Prognose99,100. Hier haben wir beobachtet, dass die HDAC6-Expression bei mdx-Mäusen erhöht ist, was darauf hindeutet, dass sie an der DMD-Pathologie beteiligt sein könnte. In Übereinstimmung mit dieser Annahme verringerte die selektive Hemmung von HDAC6 mit TubA mehrere pathologische Merkmale des mdx-Mausmuskels, ohne die Expressionsniveaus von HDAC6 zu beeinflussen. Dies deutet darauf hin, dass die vorteilhafte Wirkung der HDAC6-Hemmung in der Verringerung seiner Deacetylaseaktivität liegt, unabhängig von seinem Proteingehalt.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Stabilisierung der Mikrotubuli durch die Verhinderung ihrer Deacetylierung die Organisation der Mikrotubuli in Muskeln mit Dystrophinmangel aufrechterhält. Bei MDX-Muskeln wird der Verlust der Kraftproduktion häufig auf strukturelle Beeinträchtigungen des Muskelfaser-Zytoskeletts und Veränderungen in der Signalübertragung zurückgeführt101. Interessanterweise zeigte sich, dass die Stabilisierung des Mikrotubuli-Netzwerks vor kontraktionsbedingten Verletzungen schützt, was darauf hindeutet, dass die gezielte Behandlung des Mikrotubuli-Zytoskeletts neue Möglichkeiten für therapeutische Interventionen bei DMD bieten könnte77. Dementsprechend enthalten mit TubA behandelte mdx-Muskeln weniger zentronukleierte Fasern, möglicherweise weil Muskelfasern widerstandsfähiger sind.

Unsere Daten zeigen, dass TubA die NMJ-Morphologie in mdx-Mäusen teilweise wiederherstellt. Bei DMD-Patienten und mdx-Mäusen sind die NMJs merklich desorganisiert und weisen Defizite in der neuromuskulären Funktion/Übertragung auf, was den Beitrag einer NMJ-Beeinträchtigung zur veränderten Funktion und Erholung dystrophischer Muskeln unterstreicht83,102,103,104. Wir haben kürzlich gezeigt, dass HDAC6 an der Mikrotubuli-Organisation im NMJ beteiligt ist, indem es die AChR-Verteilung und die NMJ-Organisation reguliert57. Bei mdx-Mäusen sind wahrscheinlich strukturelle Veränderungen in Mikrotubuli am NMJ an der Desorganisation des NMJ85 beteiligt. Unsere vorliegende Studie zeigt, dass der Schutz der NMJ-Struktur durch die Stabilisierung von Mikrotubuli wahrscheinlich zur positiven Wirkung der TubA-Behandlung auf die mdx-Muskelfunktion beiträgt. In mdx-Muskeln sind NMJs aufgrund der Fragmentierung ungewöhnlich groß und unsere aktuellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Stabilisierung des Mikrotubuli-Netzwerks diese Fragmentierung einschränkt, was mit unseren früheren Ergebnissen übereinstimmt, die zeigten, dass eine zunehmende Acetylierung der Mikrotubuli die Ausbreitung des NMJ58 einschränkt. Der Anstieg des Utrophin-A-Spiegels könnte auch zur Verbesserung der NMJ-Organisation durch TubA beitragen.

Ein signifikanter Anstieg des Utrophin-A-Spiegels korreliert mit einer verbesserten Prognose bei DMD-Patienten105. Daher trägt die Fähigkeit der HDAC6-Hemmung, den extrasynaptischen Utrophin-A-Spiegel zu erhöhen, wahrscheinlich zur Erhaltung der mdx-Muskelintegrität bei. Wie HDAC6 Utrophin A reguliert, muss noch ermittelt werden. Wir haben hier beobachtet, dass Rapamycin den Anstieg der Utrophin A-Expression durch TubA verhindert, was auf die Beteiligung des mTOR-Signalwegs hinweist. Eine zusätzliche vorteilhafte Wirkung von TubA könnte auch durch die Wiederherstellung des Mikrotubuli-Netzwerks vermittelt werden, was wiederum den Transport von Utrophin A zur Membran verbessern könnte.

Im Gegensatz zu den meisten HDACs, die über Transkriptionsregulationskomplexe direkt auf die Genexpression einwirken, ist HDAC6 ausschließlich zytoplasmatisch und keines seiner bekannten Substrate ist Transkriptionsfaktoren. Hier zeigen wir, dass HDAC6 Smad3 deacetyliert und seine nukleare Anreicherung reguliert. Smad2/3-Proteine ​​​​vermitteln die Wirkung des TGF-β-Signals, um den Proteinkatabolismus und die Fibrose zu fördern und den Proteinanabolismus zu hemmen. Die Hemmung der Smad2/3-Kernakkumulation durch HDAC6-Hemmung kann daher die vorteilhafte Wirkung von TubA auf Nierenfibrose106, die Reduzierung der Muskelatrophie und die Stimulation der Proteinsynthese über den mTOR-Weg erklären. Die vorteilhaften Wirkungen von HDAC-Inhibitoren wie Givinostat wurden zuvor bei mdx-Mäusen und DMD-Patienten nachgewiesen, indem sie die Expression des Aktivin-bindenden Proteins Follistatin stimulieren, dessen Hauptaktivität darin besteht, die TGF-β-Signalisierung zu blockieren27,56,107. Diese vorteilhaften Wirkungen von HDAC6 auf die MDX-Muskeln spiegeln die Wirkungen von Givinostat wider. Darüber hinaus schwächt die Hemmung der TGF-β-Aktivität in den Muskeln von mdx- und DMD-Patienten sowohl die Degeneration als auch die Fibroverkalkung108 und die Fibrose27. Konsequenterweise reduzierte die HDAC6-Hemmung auch die Fibrose in den mdx-Muskeln.

In einem Versuch, die Wirkung von TubA auf die TGF-β-Signalübertragung mit mTOR zu verknüpfen, beobachteten wir, dass die PTEN-Expression durch TubA verringert wurde, was auf die bekannte Rolle von Smad3 bei der Aktivierung der PTEN-Translation 37 hinweist. Es ist bekannt, dass die PTEN-Spiegel in dystrophischen Muskeln von DMD-Patienten und mdx-Mäusen erhöht sind, und es wurde gezeigt, dass die PTEN-Hemmung die Muskelregeneration und -funktion bei mdx-Mäusen verbessert109. Daher trägt die Wirkung von TubA auf die PTEN-Expression wahrscheinlich zur Verbesserung der MDX-Muskeln bei.

Interessanterweise beeinflusst HDAC6 nicht direkt die Expression einzelner Gene, wie für andere HDACs gezeigt, sondern wirkt auf die TGF-β-Signalübertragung, indem es auf Smad3 im Zytoplasma abzielt. Daher reguliert HDAC6 die nachgeschalteten Ziele von Smad2/3 und bietet so einen neuen pharmakologischen Zugang zur Störung der TGF-β-Signalübertragung. Smad2 und Smad3 teilen sich 92 % der Sequenzidentität, ihre Funktionen sind jedoch nicht vollständig redundant. Smad2-Knockout-Mäuse sterben am Embryonaltag 10,5 mit Gefäß- und Schädelanomalien und beeinträchtigter Links-Rechts-Musterung110,111, wohingegen Smad3-Knockout-Mäuse lebensfähig sind, aber an einer beeinträchtigten Immunfunktion und chronischen Entzündungen leiden112,113. Darüber hinaus zeigen sie Präferenzen für die Assoziation mit bestimmten Transkriptionsfaktoren. Beispielsweise interagiert Smad3 bevorzugt mit FoxO gegenüber Smad232. Interessanterweise betrafen frühere Berichte zur Smad2/3-Acetylierung ausschließlich Kernfaktoren92,93 und die Wirkung der Smad2/3-Acetylierung korrelierte mit der Promotorbindung, der Transaktivierungsaktivität, dem Kernexport oder der Proteinstabilität. Im Zellkern wird Smad3 als Reaktion auf TGF-β durch p300/CBP an Lysin 19 acetyliert, was seine DNA-Bindungsaktivität und Bindung an Zielgen-Promotoren erhöht114. Die Acetylierung von Smad3 kann die Expression von TGF-β-regulierten Genen selektiv nach oben oder unten regulieren. Bemerkenswert ist, dass Smad3 auch an mehreren anderen Lysinen acetyliert werden kann92,93. Da HDAC6 rein zytoplasmatisch ist, beeinflusst die Smad3-Deacetylierung durch HDAC6 wahrscheinlich verschiedene Prozesse. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine zunehmende Smad3-Acetylierung die Phosphorylierung von Smad 3 und seine nukleare Anreicherung verringert. Wir können daher spekulieren, dass die Verhinderung der Deacetylierung von Smad3 im Zytoplasma seine Phosphorylierung durch TGF-β-Rezeptoren und/oder seine Assoziation mit Smad4 verringert. Insgesamt ist die Acetylierung von Smad3 im Zellkern erforderlich, um die Expression seiner Zielgene zu aktivieren, wohingegen die Acetylierung von Smad3 im Zytoplasma seine Funktion hemmt. Interessanterweise erhöhte die HDAC6-Hemmung trotz der hohen Ähnlichkeit zwischen Smad2 und Smad3 selektiv die Smad3-Acetylierung, beeinträchtigte jedoch die Phosphorylierung und den Kerneintritt von Smad2 und Smad3. Wir nehmen an, dass acetyliertes Smad3 im Zytoplasma Smad2 binden und dessen Phosphorylierung hemmen könnte und dass die Bildung eines acetylierten Smad2/3-Dimers ihre Fähigkeit, in den Zellkern einzudringen, verringern könnte. Es ist denkbar, dass acetylierte Smad2/3-Moleküle, die vom Zellkern in das Zytoplasma zurückexportiert werden, nach ihrer Aktivierung durch p300 einer Deacetylierung durch HDAC6 bedürfen, um ihren Wiedereintritt in den TGF-β-Weg zu ermöglichen. Daher würde die Hemmung von HDAC6 die Deacetylierung von Smad3 im Zytoplasma verhindern, wodurch die Menge an Smad2/3, die für die Teilnahme an der TGF-β-Signalisierung zur Verfügung steht, reduziert und die Menge an zytoplasmatischem Smad2/3 erhöht würde. Eine andere Möglichkeit wäre, dass die Deacetylierung von Smad3 durch HDAC6 dessen Ubiquitinierung und den anschließenden Abbau reguliert. Beide Hypothesen stimmen mit der Tatsache überein, dass die HDAC6-Hemmung die Menge des zytoplasmatischen Smad2/3-Proteins erhöht.

Über funktionelle Zusammenhänge zwischen HDAC6 und TGF-β wurde bereits berichtet. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Smad3-Phosphorylierung und die nukleare Akkumulation durch HDAC6106,115 reguliert werden. Es wurde auch gezeigt, dass TGF-β die Deacetylierung von α-Tubulin durch HDAC6 induziert, was zu einer erhöhten Zellmotilität führt115, und die Stabilität der Mikrotubuli reguliert die TGF-β-induzierte Smad-Phosphorylierung116,117,118. Indem wir hier zeigen, dass HDAC6 sowohl die Acetylierung von Smad3 als auch von Mikrotubuli reguliert, liefern unsere Ergebnisse einen direkten molekularen Zusammenhang zwischen der Stabilität von Mikrotubuli und der TGF-β-Signalisierung.

In einer früheren Arbeit haben wir gezeigt, dass die HDAC6-Expression während der Muskelatrophie erhöht war und über eine direkte Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase MAFbx42 zum Muskelschwund beitrug. Daher schlagen wir vor, dass die HDAC6-Hemmung den Abbau von Muskelproteinen auf zwei Ebenen verhindert: Hemmung der TGF-β-Signalübertragung über Smad2/3 und Hemmung der Ubiquitinierung und anschließenden Abbau von MAFbx-Substraten. Die Hemmung des TGF-β-Signals erwies sich auch in Mausmodellen als vorteilhaft für die Begrenzung von Kachexie und Krebsfortschritt119,120. Viele Tumoren sezernieren TGF-β und die Feststellung, dass HDAC6 TGF-β reguliert, könnte auch relevant sein, um die positiven Auswirkungen zu erklären, die mit HDAC6-Inhibitoren auf das Fortschreiten des Krebses beobachtet werden53,54,121.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die pharmakologische Hemmung von HDAC6 mehrere funktionelle, biochemische und morphologische Marker in den Skelettmuskeln von Mäusen mit Dystrophinmangel über drei komplementäre Mechanismen signifikant verbessert (Abb. 6): (i) Mikrotubuli-Stabilisierung, die die Wiederherstellung von NMJ und DGC begünstigt, (ii) Erhöhung des Utrophin-A-Spiegels, (iii) Hemmung der TGF-β-Signalübertragung über Smad3-Targeting, was Muskelatrophie und Fibrose reduziert und die Proteinsynthese stimuliert. Dementsprechend stellt die Hemmung von HDAC6 mit pharmakologischen Wirkstoffen ein attraktives therapeutisches Ziel für DMD dar und bietet viele Vorteile, darunter einfache Verabreichung, Wirkung auf alle Muskeln und Vorteile für alle Patienten, unabhängig von den Dystrophinmutationen.

Alle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden von der institutionellen Ethikkommission genehmigt und folgten den Richtlinien des National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals sowie des Animal Care Committee der University of Ottawa. Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien des Canadian Council of Animal Care. Für In-vivo-Experimente wurden sowohl männliches Kontroll-C57 black 10 (C57BL10) als auch männliches C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J mdx verwendet (The Jackson Laboratory Bar Harbor, USA). Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Diese Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkel-Zyklus bei kontrollierter Temperatur (23 °C ± 0,9 °C) mit 50 % ± 4 % Luftfeuchtigkeit und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Mdx-Mäuse wurden 30 aufeinanderfolgende Tage lang entweder mit Tubastatin A (TubA, APExBIO, #A4101; 25 mg/kg/Tag, intraperitoneal), gelöst in 2 % DMSO, oder mit Kochsalzlösung, ergänzt mit 2 % DMSO (Vehikelkontrolle), behandelt46. Diese Mäuse wurden im Tierpflege- und Veterinärdienst der Universität Ottawa gehalten. Bei allen Tierarbeiten wurden alle relevanten ethischen Vorschriften eingehalten. Nach der Behandlung wurden die Mäuse mit Isofluran-Anästhesie betäubt (Referenz VI-1586 auf dem Gerät TEM SEGA, MiniTag V1 / Evaporator Tec7) und durch Zervixluxation eingeschläfert. Anschließend wurden die Muskeln präpariert und entweder (i) zur Protein- und RNA-Extraktion in flüssigem Stickstoff eingefroren und zerkleinert oder (ii) in Tissue-Tek OCT-Verbindung (VWR, Mississauga, Kanada) eingebettet und in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan für den Kryostat eingefroren Schnitte57 oder (iii) wurden manuell dissoziiert80 mit den folgenden Modifikationen: Einzelne TA-Fasern wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS-4 % Paraformaldehyd fixiert, 60 Minuten in PBS-1 % Triton X-100 bei 30 °C permeabilisiert, bevor sie gesättigt und inkubiert wurden mit Antikörpern wie unten beschrieben.

Alle Injektionen und Verhaltenstests wurden blind in der Kerneinrichtung für Tierverhalten der Universität Ottawa durchgeführt. Bei TubA-Experimenten wurden die täglichen Injektionen während des Verhaltenstestzeitraums fortgesetzt. Um Störungen zu minimieren, wurden die Injektionen am Nachmittag nach Abschluss jedes Tests durchgeführt. Vor jedem Test wurden die Mäuse mindestens 30 Minuten lang an den Raum gewöhnt und die Tests wurden unter normalen Lichtbedingungen durchgeführt. Vor dem ersten Test wurden die Mäuse 3 Tage lang einmal täglich behandelt. Die Muskelkraft jedes Tieres wurde mit einem Griffstärkemessgerät (Chatillion DFE II, Columbus Instruments) an allen Pfoten gemessen (Test der Griffstärke der Hinterbeine). Die Maus wurde näher an das Messgerät herangeführt, bis sie die Sonde fest im Griff hatte. Die Maus wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 2,5 cm/s horizontal von der Stange weggezogen, bis sie die Sonde freigab. Der Wert der maximalen Spitzenkraft wurde aufgezeichnet (gF). Dies wurde für jedes Tier achtmal im Abstand von 15 Sekunden wiederholt. Bei jedem Tier wurde nach 30 Tagen der beste Wert als spezifische Maximalkraft definiert. Die Messungen der Griffstärke wurden vom selben Prüfer durchgeführt, um die Variabilität zu begrenzen, und wurden in zufälliger Reihenfolge durchgeführt. Dem Forscher, der die Messungen durchführte, war die Behandlungsgruppe jeder einzelnen Maus beim Test nicht bekannt.

C2C12-Zellen (ATCC, CRL-1772) wurden auf Matrigel-beschichteten (Matrigel®-Matrix, Corning) Platten mit 35 mm Durchmesser ausgesät und als Myoblasten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (Multicell). Anschließend wurden die Zellen in Differenzierungsmedium (DMEM-Medium, ergänzt mit 2 % Pferdeserum, Bio Media Canada) differenziert. In Platten mit 35 mm Durchmesser gezüchtete Zellen wurden entweder für Western Blot oder Immunfluoreszenz behandelt. Für den Western Blot wurden die Zellen durch Trypsinisierung gesammelt, mit PBS gewaschen, zentrifugiert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Für die Immunfluoreszenz wurden die Zellen 20 Minuten lang in PBS-4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert, in PBS gewaschen und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

C2C12-Zellen wurden mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt: TubA (bei 5 µM, APExBIO, #A4101), Tubacin (TBC, 5 µM, Sigma, #SML0065), Rapamycin (Rapa, 100 nM, Sigma #CAS 53123-88-9) und SB 431542 (SB43, 10 µM, Tocris, #1614). Rekombinantes menschliches TGF-β1 (rhTGF-β1, 10 ng/ml, Nr. 100-21) wurde von PeproTech erworben. Alle in dieser Studie verwendeten Primärantikörper sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Sekundärantikörper, die für Immunfluoreszenzstudien verwendet wurden, wurden an Alexa-Fluor 488 oder Alexa-Fluor 555 (Molecular Probes) gekoppelt; oder zu Cy3 oder Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Sekundäre Antikörper, die für das Western Blot verwendet wurden, waren entweder Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelte polyklonale Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Bio-Rad) oder HRP-Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Bio-Rad). Alle in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von den Herstellern oder in zuvor veröffentlichten Arbeiten des Labors validiert. Um NMJ für Immunfluoreszenzstudien sichtbar zu machen, verwendeten wir α-Bungarotoxin in einer Konzentration von 5 µg/ml in Konjugaten mit Alexa-Fluor 488 (Molecular Probes, Nr. B13422) und DAPI (Sigma-Aldrich; Nr. D9542) wurde zur Färbung der Kern-DNA verwendet. Zur Visualisierung und Quantifizierung von Proteinen im Western Blot verwendeten wir 2,2,2-Trichlorethanol122 (TCE, Sigma, #T54801).

TA-Muskeln wurden aus den Hinterbeinen erwachsener Mäuse entnommen und die präparierten Muskeln auf Trockeneis zerkleinert. Muskelpulver wurde in Harnstoff/Thioharnstoff-Puffer [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 65 mM Chaps, 100 mM DTT, 10 U DNase I, Proteaseinhibitoren (komplett; Roche/Sigma-Aldrich)] resuspendiert und die Proteinkonzentration wurde mit CB- bestimmt. X-Protein-Assay-Kit (G-Bioscience, St. Louis, MO). Nach der Trypsinierung wurden C2C12-Zellen in RIPA-Puffer [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS und Proteaseinhibitoren (Complete; Roche/Sigma-Aldrich)] solubilisiert. ]. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce/ThermoFisher Scientific) gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt.

Fünf bis zwanzig µg Gesamtproteine ​​wurden durch SDS-PAGE, ergänzt mit 0,5 % TCE, aufgetrennt und auf Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen übertragen. Die unspezifische Bindung wurde mit 4 % Rinderserumalbumin (BSA, Euromedex), verdünnt in 1X PBS, ergänzt mit Tween 0,1 %, blockiert und die Membranen wurden mit primären Antikörpern inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit 0,1 % Tween 1X PBS wurden die Membranen mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (Jackson Immunoresearch Laboratories/Cederlane) inkubiert. Nach weiteren Waschvorgängen wurden die Signale mithilfe von ECL-Substratreagenzien (Bio-Rad) sichtbar gemacht und die Erfassung erfolgte mithilfe eines ChemiDocTM MP Imaging Systems (Bio-Rad) oder mittels Autoradiographie mit Röntgenfilmen (Fisher Scientific). Quantifizierungen auf Basis der TCE-Membran wurden mit der Image Lab-Software (Bio-Rad) oder der FIJI-Software (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n, National Institutes of Health, Bethesda, MD) durchgeführt.

Gefrorene EDL- und SOL-Muskelproben wurden vor der weiteren Verarbeitung mindestens 20 Minuten lang bei –20 ° C in den Kryostaten (HM 525 NX, Thermo Fisher Scientific) gegeben. 10 µm dicke Muskelschnitte wurden quer geschnitten. Muskelquerschnitte wurden mit Hämatoxylin- und Eosin-Farbstoffen gefärbt. Die Schnitte wurden mit 70 %, 90 % und 100 % Ethanollösungen dehydriert und mit Toluol gewaschen. Die Schnitte wurden mit Permount (Thermo Fisher Scientific) montiert und mit einem epifluoreszierenden EVOS FLAuto2-Umkehrmikroskop am Cell Biology and Image Acquisition Core der University of Ottawa (RRID: SCR_021845) sichtbar gemacht. Der Prozentsatz der zentralen Nukleation wurde durch Zählen der Gesamtzahl der Muskelfasern und der Anzahl der zentral nukleierten Muskelfasern aus 6 bis 8 Querschnittsansichten unter Verwendung der Northern Eclipse Software (NES, EMPIX Imaging) bestimmt. Massons Trichrom-Färbung wurde an Soleus- und EDL-Kryostat-Querschnitten an der Louise Pelletier Histology Core Facility der University of Ottawa (RRID:SCR_021737) durchgeführt. Die Schnitte wurden in Bouin-Lösung (75 ml gesättigte Pikrinsäure, 25 ml 37–40 % Formaldehyd, 5 ml Eisessig) 1 Stunde lang bei 56 °C fixiert und mit fließendem Wasser gespült, bis die gelbe Farbe verschwand. Anschließend wurden die Schnitte 10 Minuten lang in Weigert-Hämatoxylin (gleiche Teile von Lösung A: 1 g Hämatoxylin, 100 ml 95 %iger Alkohol und Lösung B: 4 ml 29 %iges Eisenchlorid, 95 ml destilliertes Wasser, 1 ml Eisessig) gefärbt und 10 Min. unter fließendem Wasser gewaschen. Die Schnitte wurden in Biebrichs scharlachroter saurer Fuchsinlösung (90 ml 1 % wässriges Biebrich-Scharlachrot, 10 ml 1 % wässriges saures Fuchsin, 1 ml Eisessig) 2 Minuten lang gefärbt und mit Wasser gespült. Die Objektträger wurden in Phosphomolybdän-Phosphowolframsäure-Lösung (2,5 g Phosphomolybdänsäure, 2,5 g Phosphorwolframsäure, 120 ml destilliertes Wasser) 10–15 Minuten lang inkubiert und mit Anilinblaulösung (2,5 g Anilinblau, 2 ml Eisessig, 100 ml) gefärbt destilliertes, gereinigtes Wasser) für 5 Minuten, gespült, für 3–5 Minuten in 1 %ige Essigsäurelösung gegeben, mit 95 %igem und absolutem Ethylalkohol dehydriert, mit Xylol geklärt und mit Deckgläsern versehen. Die Schnitte wurden mit einem Zeiss Axio Scan abgebildet. Z1 ausgestattet mit einem Plan-Apochromat 20x/0,8 Objektiv. Kerne sind schwarz, Zytoplasma rot und Kollagen blau gefärbt.

Inkubationen mit primären Antikörpern in PBS-0,1 % Tween 20 wurden entweder 60 Minuten lang bei Raumtemperatur (C2C12-Zellen) oder über Nacht bei 4 °C (isolierte dissoziierte Muskelfasern) durchgeführt und gewaschen. Nach 1–3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern wurde die Kern-DNA 10 Minuten lang mit DAPI gefärbt. Deckgläser wurden mit FluorSaveTM-Reagenz (Calbiochem) auf Objektträger montiert. Die Bilder wurden bei RT entweder mit einem Zeiss LSM880-Mikroskop (Carl Zeiss) mit einem AiryScan1-Detektor mit einem 63 × 1,4-NA-Objektiv am INMG oder einem Zeiss Axio Imager M2 (Carl Zeiss) aufrechten Mikroskop mit einem 63 × 1,4-NA-Objektiv aufgenommen. NA- oder 10 × 0,45 NA-Objektive und AxioCam mRm CCD-Detektor an der Kerneinrichtung für Zellbiologie und Bilderfassung der Universität Ottawa (RRID: SCR_021845). Alle Bilder wurden entweder mit der Software ZEN blue, der Software Zeiss AxioVision (Zeiss, Oberkochen, Deutschland), Photoshop CS5 (Abobe Systems, San Jose, CA, USA) oder der Software FIJI (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n) verarbeitet , National Institutes of Health, Bethesda, MD). Bilder wurden blind analysiert, indem Dateinamen mithilfe des Makros „name_randomizer“ in ImageJ80 zufällig in Zahlen umbenannt wurden.

C2C12-Zellen wurden 24 Stunden lang mit TubA vorbehandelt und dann 30 Minuten lang mit TGF-ß1 behandelt. Anschließend wurden die Zellen gesammelt und 3 Minuten lang bei 4 ° C mit 300 g pelletiert. Die Pellets wurden mit 10 Volumina eiskaltem E1-Puffer (20 mM NaOH pH 7,6, 5 mM Kaliumacetat, 0,5 mM MgCl2), ergänzt mit 1 x Protease-Inhibitor-Cocktail und 1 x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, resuspendiert und in einen 1 ml Dounce-Homogenisator gegeben. Die Zellen wurden mit 25 Stößen des losen Stößels homogenisiert und 10 Minuten auf Eis inkubiert, bevor sie 3 Minuten lang bei 2100 × g und 4 ° C zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde gesammelt (Zytoplasmaextrakt, CE) und das Pellet wurde im gleichen Volumen E1-Puffer, ergänzt mit 600 mM NaCl, resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert und 20 Minuten bei 20.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt (Kernextrakt, NE) und das Pellet wurde im gleichen Volumen E1-Puffer, ergänzt mit 600 mM NaCl und Benzonase (1/1000, Millipore, 71205), resuspendiert und entsprach dem Chromatinextrakt (Chrm). Das gleiche Volumen jeder Fraktion wurde auf Any kD Mini PROTEAN TGX-Gele (Biorad) geladen, auf Nitrozellulosemembran-Blot übertragen und mit dem angegebenen Antikörper sichtbar gemacht.

Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) des Smad2/3-Proteins, das sich auf den Promotorsequenzen von Atrogenen (MAFbx und MuRF1) befindet, wurden mit dem SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology) wie folgt durchgeführt: C2C12-Zellen wurden mit vorbehandelt oder unbehandelt TubA für 24 Stunden und dann mit TGF-ß1 für 30 Minuten. Die Zellen wurden in 5 ml Zellkulturmedium (DMEM Glutamax) in Abwesenheit von fötalem Kälberserum gewaschen. Die Zellen wurden dann in DMEM Glutamax, ergänzt mit 1 % Paraformaldehyd, 10 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Die Vernetzung wurde durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M und 15-minütige Inkubation bei 25 °C gestoppt. Die Zellen wurden in 1X PBS durch Abkratzen der Platten gesammelt, in 1X PBS gewaschen und in ChIP-Beschallungs-Zelllysepuffer (SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit) resuspendiert, der 1X Protease-Inhibitor-Cocktail in einer Konzentration von 2,107 Zellen/ml enthielt. Nach 15 Minuten auf Eis wurden die Zellen durch 3-minütige Zentrifugation bei 3000 g und 4 °C gesammelt und erneut in ChIP-Beschallungs-Zelllysepuffer, der 1X Protease-Inhibitor-Cocktail enthielt, resuspendiert. Nach 5 Minuten auf Eis wurde dieser letzte Schritt ein drittes Mal für 10 Minuten wiederholt. Die Zellen wurden in einem Covaris S220 in einem 1-ml-Röhrchen (Spitzenleistung: 140; Arbeitsfaktor 10; Zyklen/Burst: 200) 12 Minuten lang bei 4 °C beschallt. Die Effizienz der Ultraschallbehandlung wurde auf einem 1 %igen Agarosegel kontrolliert, um das Vorhandensein von Fragmenten im Bereich von 500–1000 bp zu überprüfen, und die Chromatinkonzentration wurde an einer entvernetzten Fraktion unter Verwendung eines Nanotropfens bewertet. Die Immunpräzipitation wurde wie im ChIP CST-Kit-Protokoll angegeben durchgeführt, indem 2,5 µg Chromatin mit 10 µL Antikörper in einem Endvolumen von 500 µl (angepasst mit ChIP-Beschallungs-Lysepuffer) 12 Stunden lang bei 4 °C unter Rotation inkubiert wurden. Die verwendeten ChIP-Antikörper sind: IgG (CST; #2729; als Negativkontrolle); Histon H3 (CST; #4620, als Positivkontrolle); Smad 2/3 (CST; #8685). Immunpräzipitierte Fragmente wurden gemäß dem CST-Kit-Protokoll gewonnen, gereinigt und entvernetzt. Das Vorhandensein von DNA wurde durch QPCR (Biorad CFX Connect) unter Verwendung von SsoADV Universal SYBR Green Supermix (Biorad) und den folgenden Primern (Eurogentec) nachgewiesen: MAFbx-Promotorregion −205/−319 (Fbxo32-5F: 5'TTCCTTGCTACACCCTGCTT3'; Fbxo32- 5R: 5'ACCTCTGCACCTCCCCTACT3'); MAFbx-Promotorregion −424/−618 (Fbxo32-2F: 5'CTTCTTTCCCCTTCCTTTGC3'; Fbxo32-2R: 5'GGTAGGGGTGCATTCTTTGA3'); MAFbx-unabhängige Promotorregion −1232/−1320 (Fbxo32-7F:5'GGCCTGCCAGTACAGACAAT3'; Fbxo32-7R: 5'AGGTGTCTTCCTTGCTCACG3'); MuRF1-Promotorregion −608/−727: (Trim63-2F: 5'CAGCACAAGGGTGTTCATGT3'; Trim63-2R: 5'CTCAGTGGTAAAGGGGCTTG3'); MuRF1-unabhängige Promotorregion −1805/−1978: (Trim63-9F: 5' GTGGATGCCAGGAACTGAAT'; Trim63-9R: 5' GGCTGTCCTGGAACTCACTC3').

Mit ImageJ wurde die Mikrotubuli-Organisation mit vertikalen (gelbe Balken) und horizontalen (blaue Balken) Linienscans visualisiert. Mit einem kürzlich entwickelten Direktionalitätsanalysetool81 (TeDT) wurde die Gitterdirektionalität des Mikrotubuli-Netzwerks für alle Mauslinien berechnet. Eine Zwei-Wege-ANOVA wurde verwendet, um die Auswirkung des Schnittwinkels der Mikrotubuli über Gruppen hinweg zu bewerten. Zweiseitige Post-hoc-Messungen des U-Tests (Mann-Whitney) wurden verwendet, um das Ausmaß der Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen. Die Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Für eine genaue Analyse wurde jedes Bild als einzelnes NMJ im Gesicht aufgenommen. Teilweise schräg zum Sichtfeld verlaufende NMJs wurden nur dann berücksichtigt, wenn der schräge Teil weniger als etwa 10 % der Gesamtfläche ausmachte. Um die Kompaktheit und den Fragmentierungsindex zu quantifizieren, wurden die Bilder mithilfe der „NMJ-Morph“-Methode analysiert123. Die Kompaktheit von AChRs an der Endplatte wurde wie folgt definiert: Kompaktheit \(=\,\left(\frac{{{{{\rm{AChR}}}}}}\; {{{{{\rm{area }}}}}}}{{{{{{\rm{endplate}}}}}}\; {{{{{\rm{area}}}}}}\right)\,\times 100\ ).

Der Fragmentierungsindex wurde berechnet, wobei eine feste, Plaque-ähnliche Endplatte einen Index von (0) hat und eine stark fragmentierte Endplatte einen Index hat, der zu einem numerischen Wert von (1) tendiert: Fragmentierungsindex \(=\,1-\left(\ frac{1}{{{{{\rm{Anzahl}}}}}}\; {{{{{\rm{von}}}}}}\; {{{{{\rm{AChR}} }}}}\; {{{{{\rm{cluster}}}}}}}\right)\).

Die Grundabmessungen der postsynaptischen motorischen Endplatte wurden mit Standard-ImageJ-Funktionen gemessen. „NMJ-Morph“ wird verwendet, um die Anzahl der diskreten AChR-Cluster zu quantifizieren, aus denen die motorische Endplatte besteht.

Alle statistischen Analysen wurden mit Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA) durchgeführt. Es wurde der nichtparametrische, zweiseitige U-Test (Mann-Whitney) angewendet. Für eine multifaktorielle Varianzanalyse wurde die zweifaktorielle ANOVA angewendet. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen (in den Abbildungen als einzelnes Sternchen dargestellt).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. In diesem Manuskript gibt es keine Einschränkungen hinsichtlich der Datenverfügbarkeit. Die in dieser Studie hauptsächlich generierten Rohdaten werden in den Zusatzinformationen als Quelldatendatei bereitgestellt. Ergänzende Zahlen finden Sie am Ende der Zusatzinformationsdatei. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken John Lunde, Jean Luc Thomas, Amanda Tran, Laurent Coudert, Nawres Ben Marzouk und Jacques Brocard für fachkundige technische Hilfe und fruchtbare Diskussion. Wir danken den PLATIM- und CIQLE-Mikroskopieeinrichtungen von Lyon und dem Cell Biology and Image Acquisition Core der University of Ottawa (RRID: SCR_021845) für den Zugang zu Mikroskopen. Die Finanzierung dieser Arbeit erfolgte über ein Stipendium der Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon) an BJJAO, das im Verlauf dieser Arbeit von einem Postdoktorandenstipendium der AFM profitierte. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeit kam vom AFM-Telethon durch die strategische MyoNeurALP-Allianz, von der Fondation pour la Recherche Médicale durch eine „équipe FRM“-Finanzierung an LS und von den Canadian Institutes of Health Research an BJJ

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bernard J. Jasmin, Laurent Schaeffer.

Pathophysiologie und Genetik von Neuronen und Muskeln (INMG-PGNM), CNRS UMR 5261, INSERM U 1315, Université de Lyon, Lyon, Frankreich

Alexis Osseni, Edwige Belotti, Isabella Scionti, Yann-Gaël Gangloff, Vincent Moncollin, Laetitia Mazelin, Remi Mounier, Pascal Leblanc und Laurent Schaeffer

Zentrum für Zellbiotechnologie, Hospices Civils de Lyon, Lyon, Frankreich

Alexis Osseni & Laurent Schaeffer

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Medizin, Fakultät für Medizin, 451 Smyth Road, University of Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Kanada

Aymeric Ravel-Chapuis & Bernard J. Jasmin

Éric Poulin Centre for Neuromuscular Disease, Medizinische Fakultät, Universität Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Kanada

Bernard J. Jasmin

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AO, BJJ und LS konzipierten die Studie, gestalteten das Projekt und erhielten Zuschüsse. AO und ARC führten Immunfluoreszenz- und alle Tierversuche durch. AO und EB führten Zellfraktionierungsexperimente durch. AO und IS führten TGF-β-Experimente durch. AO, LM und YGG führten mTOR-Experimente durch. AO und PL führten alle Western Blots durch. AO und VM führten ChIP-Experimente durch. AO führte alle Zellkulturexperimente durch. AO erstellte Figs. 1a und 6 auf Adobe Illustrator. AO und LS haben den ersten Manuskriptentwurf geschrieben. AO, ARC, EB, IS, YGG, VM, LM, RM, PL, BJJ und LS analysierten, interpretierten die Daten, überprüften, finalisierten das Manuskript und lieferten Kommentare und Änderungen.

Korrespondenz mit Alexis Osseni, Bernard J. Jasmin oder Laurent Schaeffer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Chiara Mozzetta und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Osseni, A., Ravel-Chapuis, A., Belotti, E. et al. Die pharmakologische Hemmung von HDAC6 verbessert die Muskelphänotypen bei Mäusen mit Dystrophinmangel durch Herunterregulieren von TGF-β über Smad3-Acetylierung. Nat Commun 13, 7108 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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Eingegangen: 28. Januar 2022

Angenommen: 01. November 2022

Veröffentlicht: 19. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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