Identifizierung und biochemische Charakterisierung eines neuen N

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 16991 (2022) Diesen Artikel zitieren

1154 Zugriffe

1 Zitate

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

N-Acetylglucosamin (GlcNAc) ist ein Schlüsselbestandteil von Glykanen wie Glykoprotein und der Zellwand. GlcNAc-Kinase ist ein Enzym, das ein Phosphat auf GlcNAc überträgt, um GlcNAc-6-Phosphat zu erzeugen, das eine Vorstufe für die Glykansynthese sein kann. GlcNAc-Kinasen wurden in einer Vielzahl von Organismen gefunden, darunter pathogene Hefen, Menschen und Bakterien. Dieses Enzym wurde jedoch nie in Saccharomyces cerevisiae, einem eukaryotischen Modell, entdeckt. In dieser Studie wurde die erste GlcNAc-Kinase aus S. cerevisiae identifiziert und Ngk1 genannt. Die Km-Werte von Ngk1 für GlcNAc und Glucose betrugen 0,11 mM bzw. 71 mM, was darauf hindeutet, dass Ngk1 im Gegensatz zu Hexokinasen eine hohe Affinität für GlcNAc besitzt. Ngk1 zeigte die GlcNAc-Phosphorylierungsaktivität mit verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, nämlich ATP, CTP, GTP, ITP und UTP, als Phosphoryldonoren. Ngk1 ist phylogenetisch von bekannten Enzymen entfernt, da die Aminosäuresequenzidentität mit anderen nur etwa 20 % oder weniger beträgt. Die physiologische Rolle von Ngk1 in S. cerevisiae wird ebenfalls diskutiert.

N-Acetylglucosamin (GlcNAc), ein allgegenwärtiges Kohlenhydrat sowohl in Prokaryoten als auch Eukaryoten, ist ein wesentlicher Bestandteil von Glykanen wie N-Glykoproteinen, GPI-Ankern und Zellwänden, einschließlich Peptidoglykanen von Bakterien und Chitinen von Hefen1,2,3. Für die Glykan-Biosynthese ist Uridindiphosphat-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten ein essentielles Substrat, da die GlcNAc-Einheit dieses Nukleotidzuckers durch Glykosyltransferasen in Glykane eingebaut wird2,3. Im Allgemeinen wird UDP-GlcNAc aus Fructose-6-phosphat (Fru-6-P) synthetisiert, einem Glykolyse-Zwischenprodukt, das in Glucosamin-6-P3 umgewandelt werden kann. In Eukaryoten wird Glucosamin-6-P zu GlcNAc-6-P acetyliert, gefolgt von der Isomerisierung zu GlcNAc-1-P3. In Prokaryoten hingegen wird Glucosamin-6-P hauptsächlich zu Glucosamin-1-P isomerisiert und dann zu GlcNAc-1-P3,4 acetyliert. Im letzten Schritt wird GlcNAc-1-P durch Uridylierung sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten in UDP-GlcNAc umgewandelt3,4.

GlcNAc-Kinase (EC 2.7.1.59) ist ein GlcNAc-metabolisierendes Enzym, das in zahlreichen Organismenarten vorkommt, darunter Bakterien, pathogene Hefen, Pflanzen und Tiere3,4,5,6,7,8. Dieses Enzym überträgt die Gamma-Phosphorylgruppe eines ATP auf die Hydroxylgruppe am C-6 von GlcNAc, um ein GlcNAc-6-P zu erzeugen. GlcNAc-Kinase ist strukturell mit Hexokinase (EC 2.7.1.1) verwandt, einer anderen Art von Zuckerkinase, die bevorzugt auf Glucose (Glc) einwirkt, um im ersten Schritt der Glykolyse Glc-6-P zu erzeugen, da diese Enzyme üblicherweise über eine ATPase verfügen Domäne9,10. Bei Säugetieren ist GlcNAc-Kinase als Enzym bekannt, das einen Rettungsweg für die UDP-GlcNAc-Biosynthese bereitstellt, da dieses Enzym GlcNAc-6-P produziert, das ein Vorläufer von UDP-GlcNAc11 sein kann. Im Gegensatz dazu wurde die Rolle von NagK, der GlcNAc-Kinase von Escherichia coli, bei der GlcNAc-Nutzung für die Biosynthese von Fru-6-P untersucht, da es einen umgekehrten Weg zur Umwandlung von GlcNAc-6-P in Fru-6-P gibt die Energiequelle in der Glykolyse4. In ähnlicher Weise wurde auch CaNag5, die GlcNAc-Kinase der pathogenen Hefe Candida albicans, identifiziert und es wurde berichtet, dass sie an der GlcNAc-Nutzung zur Erzeugung von Fru-6-P als Energiequelle beteiligt ist3,5,6. C. albicans kann wie Bakterien auf GlcNAc als Kohlenstoffquelle wachsen. Tatsächlich gibt es in C. albicans einen Weg zur Umwandlung von GlcNAc in Fru-6-P, da der Gencluster der GlcNAc-metabolisierenden Enzyme, bestehend aus GlcNAc-Kinase (CaNAG5) sowie GlcNAc-6-P-Deacetylase (CaNAG2) und Glucosamin-6-P-Desaminase (CaNAG1) wurde anhand der Sequenzähnlichkeit mit diesen Enzymen von E. coli4 identifiziert. Es wurde gezeigt, dass eine Störung dieser Gene das Wachstum von C. albicans auf GlcNAc als Kohlenstoffquelle verzögerte.

Im Gegensatz zu C. albicans wächst die Keimhefe Saccharomyces cerevisiae nicht auf GlcNAc als Kohlenstoffquelle3,5,6. Darüber hinaus ist kein Gen, das CaNAG5, CaNAG2 oder CaNAG1 ähnelt, im gesamten Genom von S. cerevisiae6 konserviert. Daher wurde davon ausgegangen, dass S. cerevisiae diese GlcNAc-metabolisierenden Enzyme nicht besitzt. In S. cerevisiae ist das Vorhandensein der drei Hexokinasen Hxk1, Hxk2 und Glk1 seit den 1980er Jahren bekannt12. Seit mehreren Jahrzehnten wird angenommen, dass S. cerevisiae außer Hxk1, Hxk2 und Glk1 keine andere Hexokinase besitzt. Wir haben jedoch das Vorhandensein von zwei anderen Hexokinase-ähnlichen Genen (deren Funktionen jedoch unbekannt waren) bemerkt und uns darauf konzentriert: EMI2 und YLR446W. In unserer vorherigen Arbeit wurde das Emi2-Protein zusätzlich zu den bisher bekannten Hexokinasen Hxk1, Hxk2 und Glk113 als vierte neue Hexokinase von S. cerevisiae identifiziert. In dieser Studie haben wir uns auf ein anderes Hexokinase-ähnliches Gen, YLR446W (systematischer Name), konzentriert, das keinen Standard-Gennamen hat, um zu untersuchen, ob es sich um eine zusätzliche neue Hexokinase in diesem Modellorganismus handelt. Unerwarteterweise fanden wir heraus, dass YLR446W eine neuartige GlcNAc-Kinase kodiert, die eine geringe Sequenzähnlichkeit zu bekannten GlcNAc-Kinasen aus anderen Organismen aufweist.

Das YLR446W-Gen ist ein Gen mit unbekannter Funktion, das ein Protein mit 433 Aminosäuren kodiert und eine Hexokinase-ähnliche ATPase-Domäne besitzt. Bei einer Homologiesuche wurde kein Enzym mit bekannter Funktion gefunden, das eine hohe Ähnlichkeit mit dem vom YLR446W-Gen (YLR446Wp) kodierten Protein aufweist. YLR446Wp weist jedoch eine Sequenzidentität von etwa 20 % mit Hxk1, Hxk2, Glk1 und Emi2 von S. cerevisiae auf (ergänzende Abbildung S1). Darüber hinaus wurde vorhergesagt, dass es sich bei diesem Genprodukt um etwa 50 kDa eines zytosolischen Proteins handelt, das keine Signalpeptidsequenz aufweist, wie es bei Hxk1, Hxk2, Glk1 und Emi der Fall ist29,13. Deshalb begannen wir zu untersuchen, ob dieses Gen eine Hexokinase kodiert. Das rekombinante YLR446Wp wurde in E. coli-Zellen exprimiert und zur Verwendung in einem enzymatischen Assay gereinigt (Daten nicht gezeigt).

Typischerweise kann ATP ein Phosphoryldonor für Hexokinase sein, indem es einen Komplex mit zweiwertigen Kationen wie Mg2+ bildet. Es wurde festgestellt, dass YLR446Wp in Gegenwart von ATP und Mg2+ eine geringe Glukosephosphorylierungsaktivität (0,010 U/mg) zeigte (Abb. 1a). Die relativen Aktivitätsniveaus der Glukosephosphorylierung in Gegenwart von ATP und entweder Mg2+, Co2+ oder Mn2+ betrugen 100 %, 170 % bzw. 80 % (Abb. 1b), was darauf hindeutet, dass Mg2+ durch Co2+ oder Mn2+ ersetzt werden kann. Andererseits wurde die Enzymaktivität in Gegenwart von Ca2+ oder Zn2+ kaum nachgewiesen. In Abwesenheit zweiwertiger Kationen wurde die Enzymaktivität in Gegenwart von ATP nicht beobachtet (Abb. 1a und b). Diese Ergebnisse zeigten, dass YLR446Wp eine Kinase ist, die auf Glc einwirkt und zweiwertige Kationen benötigt, ähnlich wie bei bekannten Hexokinasen13. Es wurde auch festgestellt, dass die Glucokinase-Aktivität dieses Enzyms in Gegenwart von 10 mM Glc niedriger war als die der anderen vier Hexokinasen, deren Werte unter unseren Testbedingungen für Hxk1, Hxk2, Glk1 und Emi2 0,044–180 mU betrugen. Obwohl die höchste Aktivität von YLR446Wp in Gegenwart von Co2+ beobachtet wurde, wurde nur eine Spurenmenge an intrazellulärem Co2+ nachgewiesen14. Andererseits ist Mg2+ in Hefezellen reichlich vorhanden und gilt als wichtiger Cofaktor für ATP-abhängige Kinasen15. Daher haben wir uns entschieden, den Enzymtest in den nachfolgenden Experimenten in Gegenwart von Mg2+ durchzuführen.

Test der Glc-Phosphorylierungsaktivität von YLR446Wp. (a) Die Enzymaktivität von YLR446Wp für die Glucosephosphorylierung wurde mithilfe eines Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-gekoppelten Tests überwacht. Die Reaktion der Glucosephosphorylierung mit Ngk1 wurde in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von MgCl2 bewertet. (b) Die spezifische Aktivität für die Glucosephosphorylierung in Gegenwart von MgCl2, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 oder EDTA wurde verglichen. Der Prozentsatz der spezifischen Aktivität in Gegenwart von MgCl2 wurde auf 100 % festgelegt. Fehlerbalken, die Standardabweichung zweier unabhängiger Experimente.

Die meisten der bekannten Hexokinasen, einschließlich Hxk1, Hxk2 und Emi2, können nicht nur auf Glukose, sondern auch auf Mannose, Fruktose und Glucosamin einwirken13,16. Wir untersuchten, ob YLR446Wp andere Monosaccharide als Glucose phosphorylieren kann, indem wir das Reaktionsprodukt mittels DC überwachten. Das Phosphorylierungsprodukt wurde kaum nachgewiesen, wenn Fruktose, Mannose oder Galaktose als Zuckersubstrat verwendet wurden, was darauf hindeutet, dass dieses Enzym diese Monosaccharide nicht als Substrat erkennt. Im Gegensatz dazu zeigt dieses Enzym die Phosphorylierungsaktivität auf GlcNAc, da das Phosphorylierungsprodukt mit einer Abnahme des Zuckersubstrats nach einer 30-minütigen Reaktion erzeugt wurde (Abb. 2a). Die Phosphorylierung anderer Aminozucker, Glucosamin, N'N'-Diacetylchitobiose, UDP-GlcNAc, N-Acetylmannosamin und N-Acetylgalactosamin, wurde ebenfalls untersucht und ergab, dass dieses Enzym bei diesen Aminozuckern außer GlcNAc keine nachweisbare Aktivität zeigt (Abb . 2b). Im Gegensatz dazu zeigte keine der anderen Hefehexokinasen, Hxk1, Hxk2, Glk1 und Emi2, die nachweisbare Aktivität auf GlcNAc (ergänzende Abbildung S2). Andererseits zeigten alle diese Hexokinasen eindeutig die Aktivität für Glc.

TLC-Analysen der Zuckersubstratspezifität von YLR446Wp. Die Substratspezifität des Enzyms für Monosaccharide (a) und Aminozucker (b) wurde durch TLC überwacht. Eine Reaktion, die ATP, MgCl2 und jeden der folgenden Zucker enthält: GlcNAc, Glc, Fructose (Fru), Mannose (Man), Galactose (Gal), Glucosamin (GlcN), N'N'-Diacetylchitobiose (GlcNAc2), UDP- GlcNAc, N-Acetylmannosamin (ManNAc) oder N-Acetylgalactosamin (GalNAc) wurde 30 Minuten lang mit (+) oder ohne (–) Enzym durchgeführt. Als Standardverbindung wurde Glc-6-P oder GlcNAc-6-P (jeweils 15 nmol) auf die DC-Platte aufgetragen. S, Zuckersubstrate; P, Produkte.

Um zu bestätigen, dass YLR446Wp GlcNAc-Kinaseaktivität besitzt, wurde das Reaktionsprodukt mittels HPLC analysiert. Nach 3-stündiger Reaktion mit dem Enzym war der Peak von GlcNAc (S: RT = 4,19 min) verringert und größtenteils durch das Produkt (P: RT = 10,39 min) ersetzt (Abb. 3a und b). Die Retentionszeit des Reaktionsprodukts (P) entsprach im Wesentlichen der von GlcNAc-6-P. Es wird darauf hingewiesen, dass GlcNAc-1-P, ein weiteres GlcNAc-Phosphat, unter den gleichen Bedingungen nach 9,87 Minuten eluiert wurde (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus zeigte die ESI-MS-Spektrometrie, dass die Molekülmasse des Reaktionsprodukts (P: RT = 10,39 min) mit der berechneten Masse von GlcNAc-6-P [m/z [M − H]− 300] übereinstimmte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass YLR446Wp im Gegensatz zu den anderen bekannten Hexokinasen in S. cerevisiae über eine GlcNAc-Kinaseaktivität zur Erzeugung von GlcNAc-6-P verfügt.

HPLC-Analyse von GlcNAc-Phosphorylierungsprodukten. Das Reaktionsgemisch in Abwesenheit (a) oder Anwesenheit (b) des Enzyms, bestehend aus 10 mM GlcNAc, 10 mM ATP und 10 mM MgCl2, wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) bei 30 °C durchgeführt 3 h inkubiert und mittels HPLC analysiert. Die Retentionszeit jedes bei UV = 205 nm nachgewiesenen Peaks wurde an die der Standardverbindungen angepasst: S, GlcNAc (4,2 min); P, GlcNAc-6-P (10,4 Min.); ADP (12,4 Min.); *, Tris (4,7 Min.).

Die kinetischen Parameter für GlcNAc und Glc wurden verglichen, indem die Erzeugung von ADP durch die ATP-abhängige Zuckerphosphorylierung mithilfe des Pyruvatkinase- und Laktatdehydrogenase-gekoppelten Assays überwacht wurde. Vor dem Test haben wir bestätigt, dass die maximale Enzymaktivität mit Tris-HCl-Puffer bei etwa pH 8,0 erreicht wurde. Die Km-Werte für GlcNAc und Glc wurden mit 0,11 mM bzw. 71 mM bestimmt, was darauf hinweist, dass die Affinität dieser Kinase für GlcNAc etwa 500-mal höher ist als die von Glc (Abb. 4a und b). Allerdings unterschieden sich die Umsatzraten dieser Zucker nicht wesentlich: Die kcat-Werte für GlcNAc und Glc betrugen 2,3 s−1 bzw. 1,1 s−1. Die Km- und kcat-Werte von Ngk1 für ATP wurden bei Verwendung von GlcNAc als Zuckersubstrat zu 1,2 mM bzw. 3,4 s−1 bestimmt (Daten nicht gezeigt). Die Km-Werte der anderen vier Hexokinasen von S. cerevisiae für die Glukosephosphorylierung lagen Berichten zufolge unter 0,20 mM (0,011–0,20 mM), wohingegen die kcat-Werte dieser Enzyme einen weiten Bereich lagen (0,042–63 s−1)13 ,16. Aus diesen Ergebnissen sind wir zu dem Schluss gekommen, dass YLR446W keine typische Hexokinase, sondern eine neuartige Zuckerkinase kodiert, die spezifisch für GlcNAc ist und in S. cerevisiae nie identifiziert wurde. Dementsprechend haben wir dieses Gen NGK1 genannt, für N-Acetylglucosamin-Kinase 1.

YLR446W kodiert eine GlcNAc-Kinase namens Ngk1. Die kinetische Analyse der Ngk1-Kinaseaktivität von GlcNAc (a) und Glc (b) wurde unter Verwendung eines gekoppelten Pyruvatkinase- und Laktatdehydrogenase-Assays durchgeführt.

Es gibt wenig Wissen über die Reaktivität von GlcNAc-Kinasen gegenüber anderen Nukleosidtriphosphaten als ATP. Es wurde berichtet, dass Hefezellen Nicht-ATP-Nukleosidtriphosphate, CTP, GTP, ITP und UTP17 enthalten. Daher untersuchten wir die Ngk1-Aktivität mit jedem dieser Nukleosidtriphosphate als Phosphoryldonor. Das Phosphorylierungsprodukt wurde unter Verwendung beliebiger Nukleosidtriphosphate, einschließlich ATP, GTP, CTP, ITP und UTP, nach der Reaktion mit Ngk1 beobachtet (Abb. 5a). Die relativen Aktivitäten gegen GTP, CTP, ITP und UTP betrugen 15 %, 10 %, 41 % bzw. 25 % im Vergleich zu ATP (Abb. 5b). Die Retentionszeit jedes Produkts in der HPLC stimmte mit der von GlcNAc-6-P überein (Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen nahe, dass Ngk1 breite Arten von Nukleosidtriphosphaten nutzen kann, um GlcNAc-6-P zu erzeugen.

Analyse der Reaktivität von Ngk1 gegenüber verschiedenen Nukleosidtriphosphaten. Die Ngk1-Aktivität der GlcNAc-Phosphorylierung unter Verwendung von ATP, GTP, CTP, ITP oder UTP als Phosphoryldonor wurde bestimmt. (a) DC-Analyse der Reaktion (40 min) mit (+) oder ohne (–) Enzym. S, Zuckersubstrate; P, Produkte. (b) Die spezifischen Aktivitäten wurden durch Messung der GlcNAc-6-P-Konzentration mittels HPLC nach der Reaktion (20 min) mit verschiedenen Nukleosidtriphosphaten bestimmt. Die spezifische Aktivität von Ngk1 gegen ATP wurde auf 100 % festgelegt. Fehlerbalken, die Standardabweichung zweier unabhängiger Experimente.

Aufgrund ihrer geringen Sequenzidentität (weniger als 15 %) war es schwierig, die Ngk1-Sequenz mit GlcNAc-Kinasen der bekannten Primärstruktur (z. B. menschliche und bakterielle GlcNAc-Kinasen) abzugleichen. Da davon ausgegangen wird, dass die GlcNAc-Kinase Hexokinasen funktionell und strukturell ähnlich ist, suchten wir nach möglichen Aminosäureresten, die an der Reaktion beteiligt sind, indem wir sie mit den bekannten Hexokinasen von S. cerevisiae abgleichten (ergänzende Abbildung S1). Unter diesen wurden die Struktur-Funktions-Beziehungen von Hxk2 gut untersucht18. Die Mehrfachausrichtung deutete darauf hin, dass Asp-196 und Lys-152 von Ngk1 die mutmaßlichen katalytischen bzw. ATP-bindenden Reste sein könnten. Der Ersatz von Asp-196 oder Lys-152 durch Ala (D196A oder K152A) verringerte die Enzymaktivität erheblich (ergänzende Abbildung S3). D196E war immer noch für einen Teil der Enzymaktivität verantwortlich, wohingegen D196A und D196N nach der Reaktion über Nacht keine nachweisbare Aktivität zeigten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die entscheidenden Reste für die Enzymkatalyse in Ngk1 konserviert sein könnten, während die Gesamtidentität von Ngk1 mit anderen Hexokinasen von S. cerevisiae nur etwa 20 % beträgt.

Die phylogene Analyse zeigt, dass Ngk1 von anderen bekannten GlcNAc-Kinasen sowie Hexokinasen entfernt ist (Abb. 6). Unter den bekannten Enzymen war die GlcNAc-Kinase aus C. albicans (Ca.NAG5) Ngk1 am nächsten, obwohl die Aminosäuresequenzidentität zwischen ihnen nur 22 % beträgt. Andere bekannte GlcNAc-Kinasen sowohl aus höheren Eukaryoten (Hs.NAGK und At.GNK aus Menschen bzw. Arabidopsis thaliana) als auch aus Bakterien4 (Ec.NagK aus E. coli) waren aufgrund ihrer Sequenzidentität mit Ngk1 offensichtlich weit von S. cerevisiae Ngk1 entfernt lagen unter 15 %. Es wird darauf hingewiesen, dass Ngk1-ähnliche Gene als hypothetische Proteine ​​in Hefen der Familie Saccharomycetaceae wie Zygosaccharomyces rouxii (Zr. Hypothetisches Protein, 41 % identisch mit Ngk1) konserviert sind, obwohl keines davon charakterisiert wurde.

Phylogenetische Analyse von Ngk1 mit GlcNAc-Kinasen und Hexokinasen. Phylogenetischer Baum identifizierter oder mutmaßlicher GlcNAc-Kinasen und Hexokinasen. Die folgenden phylogenetischen Bäume wurden mit Clustal Omega19 erstellt und mit Dendroskop 320 visualisiert. Ngk1 und Hexokinasen von S. cerevisiae: Sc.Unch(Ngk1)(AAT92658.1), Sc.Hxk1(NP_116711.3), Sc.Hxk2(NP_011261. 1). ), Sc.Glk1 (NP_009890.1), Sc.Emi2 (NP_010804.3). GlcNAc-Kinasen von C. albicans (Ca.NAG5, BAB43816.1), Mensch (Hs.NAGK, EAW99780.1), E. coli (Ec.NagK, NP_415637), Salmonella enterica (Se.NagK, EDN6582917.1), Arabidopsis thaliana (At.GNK, NP_564358.1), Eutrema salsugineum (Es.NAGK, XP_006415457.1) und Gorilla gorilla gorilla (Gg.NAGK, XP_018876635.1). N-Acetylmannosamin-Kinasen von Staphylococcus aureus (Sa.ROK, WP_000291445.1) und Staphylococcus pseudintermedius (Sp.ROK, WP_214533982.1). Hexokinasen höherer Eukaryoten, Mensch (Hs.HKDC1, NP_079406.4), Arabidopsis thaliana (At.Hexokinase1, NP_194642.1) und Danio rerio (Dr.Hexokinase-2, NP_998231.1). Hypothetische Proteine ​​von Candida Tropicalis (Ct.Hypothetical Protein, XP_002549429.1) und Zygosaccharomyces rouxii (Zr.Hypothetical Protein, GAV52624.1).

In dieser Studie haben wir die erste GlcNAc-Kinase aus S. cerevisiae, einem eukaryotischen Modellorganismus, identifiziert. Bisher wurden GlcNAc-Kinasen aus einer Vielzahl von Organismen, darunter Bakterien und Tieren, identifiziert. Es wurde jedoch angenommen, dass S. cerevisiae keine GlcNAc-Kinase besitzt, da es im gesamten Genom kein Gen gibt, das den bekannten GlcNAc-Kinasen ähnelt. Tatsächlich konnten wir anhand der Aminosäuresequenz nicht vorhersagen, dass das funktionsunbekannte, unbenannte Gen YLR446W von S. cerevisiae ein Gen der GlcNAc-Kinase ist, da die Sequenzähnlichkeit mit den bekannten GlcNAc-Kinasen etwa 20 % oder weniger beträgt. Hier haben wir die biochemischen Eigenschaften von YLR446Wp bestimmt und herausgefunden, dass dieses Gen tatsächlich eine GlcNAc-Kinase kodiert, und haben es deshalb Ngk1 genannt.

Unsere enzymatische Analyse zeigte, dass Ngk1 sowohl für GlcNAc als auch für Glc eine Kinaseaktivität besitzt, obwohl die Km-Werte für GlcNAc und Glc 0,11 mM bzw. 71 mM betrugen (Abb. 4a, b). Wenn man bedenkt, dass die intrazelluläre Glukosekonzentration in S. cerevisiae-Zellen auf etwa 1,5 mM21 geschätzt wird, ist Ngk1 unter physiologischen Bedingungen möglicherweise nicht an der Glukosephosphorylierung beteiligt. Es gibt einige Berichte über biochemische Analysen von GlcNAc-Kinasen aus anderen Organismen; Die Km-Werte von GlcNAc-Kinasen aus C. albicans und Menschen wurden mit 0,38 mM bzw. 0,45 mM angegeben6,8. Daher ist die Affinität von Ngk1 für GlcNAc höher als die für andere GlcNAc-Kinasen. Ngk1 zeigte keine Kinaseaktivität für Zucker außer GlcNAc und Glc (Abb. 2a, b). Die menschliche GlcNAc-Kinase wirkt sowohl auf ManNAc als auch auf Glc, allerdings in geringerem Maße als GlcNAc8. Andererseits weist C. albicans Nag5 eine teilweise Aktivität für Glc und Mannose auf, nicht jedoch für ManNAc6. Ngk1 zeigte Aktivität mit allen Nukleotidzuckern, z. B. GTP, CTP, ITP und UTP (Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass Ngk1 möglicherweise ein breites Spektrum an Nukleosidtriphosphaten als Phosphoryldonoren nutzt. Obwohl es nur wenige Berichte über die Reaktivität von Zuckerkinasen für verschiedene Nukleosidtriphosphate gibt, wurde berichtet, dass CaNag5 mit Ausnahme von ATP und CTP5 keine Kinaseaktivität mit diesen Nukleotidzuckern zeigte. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass sich die enzymatischen Eigenschaften von GlcNAc-Kinasen von denen ihrer Spezies unterscheiden. GlcNAc-Kinasen verschiedener Arten sind phylogenetisch weit voneinander entfernt, wohingegen Hexokinasen verschiedener Arten relativ nahe beieinander liegen (Abb. 6). Daher können GlcNAc-Kinasen verschiedener Arten von weit entfernten Ursprüngen stammen und sich auf einzigartige Weise entwickelt haben. Bemerkenswert ist, dass Ngk1-ähnliche Gene in verschiedenen Pilzgattungen, z. B. Z. rouxii, als hypothetische oder funktionelle unbekannte Proteine ​​konserviert sind. Ngk1 von S. cerevisiae könnte ein Hinweis auf die Entdeckung eines neuen Clusters von GlcNAc-Kinasen sein.

Die physiologische Bedeutung von GlcNAc-Kinasen ist unklar, obwohl dieses Enzym in einer Vielzahl von Organismen, von Bakterien bis hin zum Menschen, gefunden wurde. Bei C. albicans wurde berichtet, dass die Störung von Nag5 zu einer Abschwächung seiner Virulenz bei Mäusen sowie zu einer Verringerung des Wachstums auf GlcNAc-Medium6 führte. Es wird angenommen, dass GlcNAc-Kinasen von Säugetieren einen Rettungsweg für die UDP-GlcNAc-Synthese darstellen, indem sie intrazelluläres GlcNAc phosphorylieren, das möglicherweise aus Lysosomen stammt11, es wurden jedoch nur wenige experimentelle Beweise gemeldet. In E. coli spielt NagK bekanntermaßen eine Rolle bei der Nutzung von intrazellulärem GlcNAc, das aus dem Zellwand-Murein-Abbau stammt, da extrazelluläres GlcNAc während seines Transports in die Zellen phosphoryliert wird4. Zumindest trägt Ngk1 von S. cerevisiae möglicherweise nicht zum GlcNAc-Metabolismus für die Glykolyse bei, da dieser Organismus nicht wächst, indem er extrazelluläres GlcNAc als Kohlenstoffquelle nutzt5. Eine Möglichkeit besteht darin, dass Ngk1 zur UDP-GlcNAc-Biosynthese beiträgt, indem es GlcNAc in der Zelle phosphoryliert. Es ist jedoch immer noch ungewiss, ob intrazelluläres freies GlcNAc entweder von außerhalb oder innerhalb der Zellen vorhanden sein kann, da in diesem Organismus keine Wege zur Bereitstellung von intrazellulärem GlcNAc identifiziert wurden. Vermutlich könnte Ngk1 für vegetativ wachsende Zellen entbehrlich sein, wenn genügend Glucose vorhanden ist, da UDP-GlcNAc über den bekannten Weg aus Fru-6-P synthetisiert wird. Tatsächlich wuchsen Hefezellen ohne Ngk1 normal, wenn ausreichend Glukose vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Angesichts der Tatsache, dass ein genomweites Transkriptom darauf hindeutet, dass das Transkript dieses Gens während der Sporulation und der entfalteten Proteinantwort hochreguliert wird22,23, könnte Ngk1 unter bestimmten Bedingungen eine Rolle als alternativer Versorgungsweg spielen. GlcNAc-6-P als Vorläufer von UDP- GlcNAc. Derzeit laufen Analysen zur Aufklärung der physiologischen Rolle von Ngk1 in S. cerevisiae.

Ein DNA-Fragment voller Länge der ORF-Region von YLR446W wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA des Stamms S. cerevisiae BY4742 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) als Matrize und Oligonukleotidprimern amplifiziert (vorwärts: 5'-ATTTATCATATGACAATTGAAAGCACTCTAGCTCGGG – 3'; umgekehrt: 5'-ATTTATCTCGAGTTATTGAACTTGGTTGTCTGATTTGTTCAAGTAGGTG-3'). Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Nde I und Xho I verdaut und in die entsprechenden Stellen eines pCold II-Vektors (Takara Bio, Shiga, Japan) ligiert, um am N-Terminus mit einem His6-Tag fusioniert zu werden. Die Nukleotidsequenz des resultierenden Plasmids (pColdII-His6-Ngk1) wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Anschließend wurde E. coli BL21 (DE3) mit pColdII-His6-Ngk1 transformiert und das rekombinante Protein gemäß dem Protokoll des Herstellers exprimiert. Die Zellen wurden geerntet und auf Eis in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 150 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Dithiothreitol enthielt, beschallt. Der zellfreie Extrakt wurde auf eine HisTrap™ HP-Säule (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) aufgetragen und das Protein gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung einer Protein Assay CBB-Lösung (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) gemessen. Rekombinante Proteine ​​von Hxk1, Hxk2, Glk1 und Emi2 wurden wie zuvor berichtet hergestellt13.

Die ortsspezifische Mutagenese von Ngk1 wurde durch PCR unter Verwendung von pColdII-His6-Ngk1 als Matrize und den in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführten Oligonukleotidprimern gemäß dem für das ortsspezifische Mutagenese-Kit QuikChange (Stratagene, Deutschland) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Mutation jedes Plasmids wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Unter Verwendung der resultierenden Plasmide wurde jedes mutierte Enzym von Ngk1 in E. coli BL21 (DE3) exprimiert und nach der Reinigung für den Enzymtest verwendet, wie oben für das Wildtyp-Enzym beschrieben.

Die Messung der Glucokinase-Aktivität von Ngk1 erfolgte durch die Kopplungsreaktion der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (Oriental Yeast, Tokio, Japan) mit der Umwandlung von NAD+ in NADH13,24. Die Testmischung umfasste 10 mM Glucose, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 2 mM NAD+, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,6 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und eine geeignete Menge des Enzyms. Um die Wirkung zweiwertiger Kationen zu untersuchen, wurden 5 mM MgCl2 durch eine der gleichen Konzentrationen an CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 oder durch 1 mM EDTA ersetzt. Die Reaktion bei 30 °C wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und anschließend der Anstieg der Absorption bei 340 nm für die NADH-Produktion überwacht. Eine Einheit (U) ist definiert als die Menge des Enzyms, die die Phosphorylierung von 1 μmol Glc pro Minute bei 30 °C katalysiert.

Um die Substratspezifität des Enzyms für verschiedene Zucker zu untersuchen, wird eine Reaktion mit 10 mM Zucker (entweder GlcNAc, Glucose, Mannose, Fructose, Galactose, Glucosamin, N-Acetylmannosamin, UDP-GlcNAc oder N'N'-Diacetylchitobiose) durchgeführt, 10 mM ATP und 10 mM MgCl2 wurde bei 30 °C in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit oder ohne Enzym für die angegebene Zeit durchgeführt. Für Enzymassays mit verschiedenen Nukleosidtriphosphaten als Phosphoryldonoren wurde ATP durch eines der Nukleosidtriphosphate (GTP, CTP, ITP oder UTP) ersetzt, wobei GlcNAc als Zuckersubstrat verwendet wurde. Die Reaktion wurde durch 3-minütiges Erhitzen auf 100 °C gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels TLC und HPLC analysiert. Eine Einheit (U) ist definiert als die Menge des Enzyms, die die Phosphorylierung von 1 μmol GlcNAc pro Minute bei 30 °C katalysiert.

Eine Probe (3 µl) wurde auf eine TLC-Kieselgel-60-F254-Platte (Merck, Darmstadt, Deutschland) getüpfelt. Die Platte wurde in 1-Butanol/Essigsäure/Wasser (8/3/2) entwickelt, getrocknet und vor dem Backen bei 100 °C in einem Farbreagenz (2 % Diphenylamin, 2 % Anilin und 85 % Phosphorsäure) eingeweicht für 10 Min. Als Standards wurden kommerzielles Glc-6-P, GlcNAc-6-P und GlcNAc verwendet.

Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC unter Verwendung einer COSMOSIL HILIC-Säule (Nacalai Tesque, Japan) und eines UV-Detektors bei 205 nm analysiert. Als mobile Phase wurde eine Mischung aus Natriumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,0) und Acetonitril (40:60, v/v) mit einer Flussrate von 1,0 ml/min verwendet und die Säulentemperatur auf 30 °C eingestellt . Als Standards wurden kommerzielles GlcNAc, GlcNAc-6-P, GlcNAc-1-P, ADP und Tris verwendet. GlcNAc-6-P wurde anhand der integrierten Peakflächen quantifiziert. ESI-MS wurde auch durchgeführt, um die Masse des Moleküls, bei dem es sich vermutlich um GlcNAc-6-P handelt, in den Reaktionsprodukten mithilfe eines LCMS-2010EV-Massenspektrometers (Shimadzu, Kyoto, Japan) zu bestimmen.

Um die kinetischen Parameter zu bestimmen, wurde die Menge an ADP, die durch die Zuckerphosphorylierung gebildet wurde, mithilfe eines Pyruvatkinase- und Laktatdehydrogenase-gekoppelten Assays gemessen, wie zuvor etabliert13,24. Die Testmischung umfasste sechs bis sieben verschiedene Konzentrationen von GlcNAc (0,031–2,0 mM) oder Glucose (7,3–500 mM) als Zuckersubstrat, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM Phosphoenolpyruvat, 0,3 mM NADH, 50 mM Tris– HCl (pH 8,0), 18 U/ml Pyruvatkinase (Oriental Yeast, Japan), 20 U/ml Lactatdehydrogenase (Oriental Yeast, Japan) und eine angemessene Menge Ngk1. Die Reaktion bei 30 °C wurde durch Zugabe von Ngk1 gestartet und anschließend die Abnahme der NADH-Absorption bei 340 nm überwacht. Die Km- und kcat-Werte wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse mit der Origin-Software (OriginLab, Northampton, MA, USA) bestimmt.

Die in dieser Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Fruktose

Glucose

N-Acetylglucosamin

1-Phosphat

6-Phosphat

Uridindiphosphat N-Acetylglucosamin

Varki, A. Biologische Rollen von Glykanen. Glycobiology 27, 3–49 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Dell, A., Galadari, A., Sastre, F. & Hitchen, P. Ähnlichkeiten und Unterschiede in den Glykosylierungsmechanismen in Prokaryoten und Eukaryoten. J. Mikrobiol. 2010, 148178 (2011).

Google Scholar

Milewski, S., Gabriel, I. & Olchowy, J. Enzyme der UDP-GlcNAc-Biosynthese in Hefe. Hefe 23, 1–14 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Uehara, T. & Park, JT Die N-Acetyl-D-Glucosamin-Kinase von Escherichia coli und ihre Rolle beim Murein-Recycling. J. Bakteriol. 186, 7273–7279 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Rai, YP, Singh, B., Elango, N. & Datta, A. Reinigung und einige Eigenschaften der induzierbaren N-Acetylglucosamin-Kinase aus Candida albicans. Biochim. Biophys. Acta 614, 350–356 (1980).

Artikel CAS Google Scholar

Yamada-Okabe, T., Sakamori, Y., Mio, T. & Yamada-Okabe, H. Identifizierung und Charakterisierung der Gene für N-Acetylglucosamin-Kinase und N-Acetylglucosamin-Phosphat-Deacetylase im pathogenen Pilz Candida albicans. EUR. J. Biochem. 268, 2498–2505 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Furo, K., Nozaki, M., Murashige, H. & Sato, Y. Identifizierung einer N-Acetylglucosamin-Kinase, die für die UDP-N-Acetylglucosamin-Salvage-Synthese in Arabidopsis essentiell ist. FEBS Lett. 589, 3258–3262 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Weihofen, WA et al. Strukturen der menschlichen N-Acetylglucosamin-Kinase in zwei Komplexen mit N-Acetylglucosamin und mit ADP/Glucose: Einblicke in die Substratspezifität und -regulation. J. Mol. Biol. 364, 388–399 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Cárdenas, ML, Cornish-Bowden, A. & Ureta, T. Evolution und regulatorische Rolle der Hexokinasen. Biochim. Biophys. Acta 1401, 242–264 (1998).

Artikel Google Scholar

Berger, M., Chen, H., Reutter, W. & Hinderlich, S. Struktur und Funktion der N-Acetylglucosaminkinase. EUR. J. Biochem. 269, 4212–4218 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Campbell, S. et al. Glutaminmangel löst eine NAGK-abhängige Hexosamin-Rückgewinnung aus. Elife 10, e62644. https://doi.org/10.7554/eLife.62644 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bisson, LF & Fraenkel, DG Beteiligung von Kinasen an der Glucose- und Fructoseaufnahme durch Saccharomyces cerevisiae. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 80, 1730–1734 (1983).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Umekawa, M., Hamada, K., Isono, N. & Karita, S. Das Emi2-Protein von Saccharomyces cerevisiae ist eine Hexokinase, die unter Glukoselimitierung exprimiert wird. J. Appl. Glykosci. 67, 103–109 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Cyert, MS & Philpott, CC Regulierung des Kationengleichgewichts in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 193, 677–713 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Rimareva, LV et al. Untersuchung der intrazellulären Ionenzusammensetzung der Biomasse der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Russ. Landwirtschaft. Wissenschaft. 43, 186–189 (2017).

Artikel Google Scholar

Smallbone, K. et al. Ein Modell der Hefeglykolyse, das auf einer konsistenten kinetischen Charakterisierung aller seiner Enzyme basiert. FEBS Lett. 587, 2832–2841 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Osório, H. et al. Einfluss der chronologischen Alterung auf das Überleben und den Nukleotidgehalt von Saccharomyces cerevisiae-Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet wurden: Auftreten einer hohen Konzentration von UDP-N-Acetylglucosamin in stationären Zellen, die in 2 % Glucose gezüchtet wurden. FEMS Heferes. 5, 387–398 (2005).

Artikel Google Scholar

Kraakman, LS, Winderickx, J., Thevelein, JM & De Winde, JH Struktur-Funktionsanalyse der Hefehexokinase: Strukturelle Anforderungen für die Auslösung der cAMP-Signalisierung und Katabolitenrepression. Biochem. J. 343, 159–168 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Sievers, F. et al. Schnelle, skalierbare Generierung hochwertiger Protein-Mehrfachsequenz-Alignments mit Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Artikel Google Scholar

Huson, DH & Scornavacca, C. Dendroskop 3: Ein interaktives Tool für verwurzelte phylogenetische Bäume und Netzwerke. Syst. Biol. 61, 1061–1067 (2012).

Artikel Google Scholar

Teusink, B. et al. Die intrazelluläre Glukosekonzentration in dereprimierten Hefezellen, die Glukose verbrauchen, ist hoch genug, um die Glukosetransportrate um 50 % zu reduzieren. J. Bakteriol. 180, 556–562 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Chu, S. et al. Das Transkriptionsprogramm der Sporulation in Keimhefe. Science 282, 699–705 (1998).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Travers, KJ et al. Funktionelle und genomische Analysen zeigen eine wesentliche Koordination zwischen der entfalteten Proteinantwort und dem ER-assoziierten Abbau. Zelle 101, 249–258 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Nishimasu, H., Fushinobu, S., Shoun, H. & Wakagi, T. Identifizierung und Charakterisierung einer ATP-abhängigen Hexokinase mit breiter Substratspezifität aus dem hyperthermophilen Archäon Sulfolobus tokodaii. J. Bakteriol. 188, 2014–2019 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Hirotaka Katsuzaki (Mie University) für die MS-Analyse. Wir danken auch Riki Mizuta für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von JSPS KAKENHI Nr. 22K05380 und teilweise vom Institute for Fermentation, Osaka (Japan) (Grant No. G-2022-2-009).

Graduate School of Bioresources, Mie University, Tsu, 514-8507, Japan

Midori Umekawa, Ayano Nishikawa, Naoto Isono und Shuichi Karita

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

MU konzipierte die Experimente und schrieb das Manuskript; NI hat das Manuskript überarbeitet; MU, AN und NI führten die Experimente durch; MU und SK analysierten die Ergebnisse. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Midori Umekawa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Umekawa, M., Nishikawa, A., Isono, N. et al. Identifizierung und biochemische Charakterisierung einer neuen N-Acetylglucosamin-Kinase in Saccharomyces cerevisiae. Sci Rep 12, 16991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

Zitat herunterladen

Eingegangen: 09. Juni 2022

Angenommen: 27. September 2022

Veröffentlicht: 10. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.