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Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4906 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Enzymatisch basierte Proximity-Labeling-Ansätze auf Basis aktivierter Ester oder Phenoxyradikale werden häufig zur Kartierung subzellulärer Proteom- und Proteininteraktoren in lebenden Zellen eingesetzt. Aktivierte Ester sind jedoch wenig reaktiv, was zu einem großen Markierungsradius führt, und durch die Peroxidbehandlung erzeugte Phenoxyradikale können redoxempfindliche Signalwege stören. Hier berichten wir über eine photoaktivierungsabhängige Proximity-Labeling-Methode (PDPL), bei der das Photosensibilisator-Protein miniSOG genetisch an ein Protein von Interesse gebunden wird. Ausgelöst durch blaues Licht und abgestimmt auf die Bestrahlungszeit wird Singulett-Sauerstoff erzeugt, der anschließend die räumlich-zeitlich aufgelöste Anilin-Sondenmarkierung von Histidinresten ermöglicht. Wir demonstrieren seine hohe Genauigkeit durch die Kartierung organellenspezifischer Proteome. Ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID zeigt eine spezifischere und tiefere proteomische Abdeckung durch PDPL. Darüber hinaus wenden wir PDPL auf den krankheitsbedingten Transkriptionskoaktivator BRD4 und die E3-Ligase Parkin an und entdecken bisher unbekannte Interaktoren. Durch Überexpressionsscreening wurden zwei nicht gemeldete Substrate Ssu72 und SNW1 für Parkin identifiziert, deren Abbauprozesse durch den Ubiquitinierungs-Proteosomenweg vermittelt werden.

Die genaue Charakterisierung von Proteinnetzwerken liegt vielen grundlegenden zellulären Prozessen zugrunde1. Somit würde eine hochpräzise räumlich-zeitliche Kartierung von Proteininteraktionen eine molekulare Grundlage für die Entschlüsselung biologischer Pfade und Krankheitspathologien sowie für das Potenzial zur Störung dieser Interaktionen für therapeutische Zwecke liefern2. Zu diesem Zweck werden dringend Methoden benötigt, die transiente Wechselwirkungen in lebenden Zellen oder Geweben erkennen können. Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) wurde in der Vergangenheit verwendet, um Bindungspartner eines Proteins von Interesse (POI) zu ermitteln. Mit Fortschritten bei quantitativen Proteomics-Ansätzen wurde die größte Proteinnetzwerkdatenbank Bioplex3.0 basierend auf AP-MS eingerichtet3. Während AP-MS äußerst leistungsstark ist, wirken sich die Zelllyse- und Verdünnungsschritte im Arbeitsablauf auf schwache und vorübergehende Bindungsinteraktionen aus und führen zu Post-Lyse-Artefakten, wie z. B. falsch interagierenden Paaren, denen es vor der Lyse an Kompartimentierung mangelt4.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden unnatürliche Aminosäuren (UAA) mit Vernetzungsgruppen und Plattformen zur enzymatischen Proximity-Markierung (PL) (z. B. APEX und BioID) entwickelt5. Während UAA-Methoden in vielen Szenarien erfolgreich angewendet wurden und Informationen über direkte Proteinbinder6 liefern, ist noch eine Optimierung der UAA-Insertionsstellen erforderlich. Noch wichtiger ist, dass es sich um eine stöchiometrische Markierungsmethode handelt, bei der der katalytische Umsatz des Markierungsvorgangs fehlt. Umgekehrt fusionieren enzymatische PL-Methoden wie die BioID-Methode eine manipulierte Biotin-Ligase mit dem POI7 und aktivieren anschließend Biotin, um das reaktive Ester-Biotinoyl-AMP-Zwischenprodukt zu erzeugen. Dabei katalysiert das Enzym eine „Wolke“ aus aktiviertem Biotin und setzt diese frei, die proximale Lysinreste markiert. Allerdings benötigt BioID mehr als 12 Stunden, um ein ausreichendes Markierungssignal zu erhalten, was eine zeitlich aufgelöste Anwendung verhindert. Unter Verwendung der auf Hefe-Display basierenden gerichteten Evolution wurde TurboID mit viel größerer Effizienz aus BioID entwickelt und erreichte eine effektive Biotin-Markierung innerhalb von 10 Minuten8, was die Untersuchung dynamischerer Prozesse ermöglichte. Da TurboID hochaktiv ist und endogene Mengen an Biotin für eine Markierung auf niedrigem Niveau ausreichen, wird die Hintergrundmarkierung zu einem potenziellen Problem, wenn eine stark verstärkte und zeitlich regulierte Markierung durch die Zugabe von exogenem Biotin erforderlich ist. Darüber hinaus sind die aktivierten Esterspezies schlecht reaktiv (t1/2 ~5 min), was zu einem großen Markierungsradius führen kann, insbesondere nach der Sättigung benachbarter Proteine ​​mit Biotin5. Bei einem anderen Ansatz erzeugt eine genetische Fusion von manipulierter Ascorbinsäureperoxidase (d. h. APEX) bei Aktivierung mit H2O2 Biotin-Phenol-Radikale und erreicht die Proteinmarkierung innerhalb einer Minute9,10. APEX wird häufig zur Identifizierung subzellulärer Proteome, Membranproteinkomplexe und zytosolischer Signalproteinkomplexe eingesetzt11,12. Der Bedarf an hohen Peroxidkonzentrationen kann sich jedoch auf redoxempfindliche Proteine ​​oder Signalwege auswirken und zelluläre Prozesse stören.

Daher wären neue Methoden, die reaktivere Spezies erzeugen können, um den Markierungsradius mit hoher räumlicher und zeitlicher Genauigkeit und ohne nennenswerte Störung der Zellwege einzuschränken, eine wichtige Ergänzung zu aktuellen Methoden. Unter den reaktiven Spezies erregte Singulett-Sauerstoff aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und seines begrenzten Diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs in Zellen) unsere Aufmerksamkeit13. Es wurde berichtet, dass Singulettsauerstoff Methionin, Tyrosin, Histidin und Tryptophan promiskuitiv oxidiert, um ihre Polarität umzupolen14,15, die mit Sonden auf Amin- oder Thiolbasis verknüpft sind16,17. Auch wenn Singulett-Sauerstoff bei der RNA-Markierung in subzellulären Kompartimenten eingesetzt wurde18, bleibt die Neuausrichtung der Strategie bei der Proximity-Markierung endogener POIs ungenutzt. Hier stellen wir eine Plattform namens Photoactivation-Dependent Proximity Labeling (PDPL) vor, bei der wir blaues Licht verwenden, um einen mit einem Photosensibilisator miniSOG fusionierten POI zu beleuchten und die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff auszulösen, um proximale Reste zu oxidieren, gefolgt von der Modifikation oxidierter Zwischenprodukte mit einem Amin chemische Sonde in lebenden Zellen. Wir screenen eine Reihe chemischer Sonden, um die Markierungsspezifität zu maximieren und die Modifikationsstellen mithilfe eines Proteomik-Workflows mit offener Suche zu bestimmen. Ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID zeigt eine spezifischere und tiefere proteomische Abdeckung durch PDPL. Wir wenden diesen Ansatz zur organellenspezifischen Markierung subzellulärer Proteome und zur proteomweiten Identifizierung von Bindungspartnern für das krebsbedingte epigenetische Regulatorprotein BRD4 und die Parkinson-bedingte E3-Ligase Parkin an, wodurch ein Netzwerk bekannter und nicht gemeldeter Proteininteraktoren validiert wird. Die Fähigkeit von PDPL, E3-Substrate innerhalb der großen Größe von Proteinkomplexen zu identifizieren, stellt ein Szenario dar, in dem die Identifizierung indirekter Bindungspartner erforderlich ist. Zwei nicht gemeldete Parkin-Substrate, die durch den Ubiquitinierungs-Proteosom-Weg vermittelt werden, werden in situ validiert.

Die photodynamische Therapie (PDT)19 und die chromophorunterstützte Laserinaktivierung (CALI)20, bei der Singulett-Sauerstoff durch Photobestrahlung des Photosensibilisators erzeugt wird, sind in der Lage, Zielproteine ​​zu inaktivieren oder den Zelltod auszulösen. Da Singulett-Sauerstoff eine hochreaktive Spezies mit einer theoretischen Diffusionsstrecke von ~70 nm17,18,21 ist, kann die räumlich begrenzte Oxidation um den Photosensibilisator herum kontrolliert werden. Basierend auf diesem Konzept haben wir beschlossen, Singulett-Sauerstoff zu nutzen, um eine Proximity-Markierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen zu erreichen. Wir haben die chemische Proteommethode PDPL so konzipiert, dass sie vier Merkmale verkörpert: (1) katalytische Erzeugung von reaktivem Singulett-Sauerstoff auf ähnliche Weise wie enzymatische PL-Ansätze; (2) Bereitstellung einer zeitaufgelösten Markierung durch Initiierung durch Lichtbeleuchtung; (3) eine ortsaufgelöste Markierung ermöglichen, indem die Bestrahlungszeit geändert wird, um den Markierungsradius anzupassen; (4) Vermeiden Sie die Verwendung endogener Cofaktoren (z. B. Biotin), um den Hintergrund zu reduzieren, oder die Verwendung stark störender exogener Reagenzien (z. B. Peroxide), um die Auswirkungen auf die Zellumgebung zu minimieren.

Photosensibilisatoren können in zwei Kategorien unterteilt werden, darunter Fluorophore auf Basis kleiner Moleküle (z. B. Bengalrosa, Methylenblau)22 und genetisch kodierte kleine Proteine ​​(z. B. miniSOG, KillerRed)23. Um ein modulares Design zu ermöglichen, haben wir die PDPL-Plattform der ersten Generation entwickelt, indem wir ein Photosensibilisatorprotein (PS)24,25 an den POI angehängt haben (Abb. 1a). Nach der Beleuchtung mit blauem Licht oxidiert Singulett-Sauerstoff proximale nukleophile Aminosäurereste, was zu einer Umpolungspolarität führt, die elektrophil ist und mit einem Aminsonden-Nukleophil weiter reagieren kann16,17. Die Sonden sind mit einem Alkin-Griff ausgestattet, der Click-Chemie und Pull-Down für die LC-MS/MS-Charakterisierung ermöglicht.

a Schematische Darstellung der miniSOG-vermittelten Proteinkomplexmarkierung. Bei Beleuchtung mit blauem Licht erzeugen miniSOG-POI-exprimierende Zellen Singulett-Sauerstoff, der interagierende Proteine ​​anstelle von Nicht-Binder-Proteinen modifiziert. Das Photooxidationszwischenprodukt wird durch die Markierung mit einer chemischen Aminsonde abgefangen und bildet ein kovalentes Addukt. Die Alkingruppe an der chemischen Sonde ermöglicht Click-Chemie zur Pull-Down-Anreicherung, gefolgt von einer quantitativen Analyse mittels LC-MS/MS. b Die chemische Struktur der Aminsonden 1-4. c Repräsentative Fluoreszenzgelanalyse der mitochondrienlokalisierten miniSOG-vermittelten proteomischen Markierung mit den Sonden 1–4 sowie die relative Quantifizierung basierend auf der Geldensitometrie. Negativkontrollexperimente ohne blaues Licht oder mit HEK293T-Zellen ohne miniSOG-Expression wurden verwendet, um die Signal-Hintergrund-Markierung der chemischen Sonden zu bewerten. n = 2 biologisch unabhängige Proben. Jeder Punkt stellt ein biologisches Replikat dar. d Repräsentativer PDPL-Nachweis und -Quantifizierung unter Verwendung der optimierten Sonde 3 in Gegenwart oder Abwesenheit der angegebenen PDPL-Komponenten, ähnlich wie bei c. n = 3 biologisch unabhängige Proben. Jeder Punkt stellt ein biologisches Replikat dar. Mittellinie und Whiskers bezeichnen den Mittelwert und ±SD. CBB: Coomassie-Brillantblau. e Konfokale Abbildung von Singulett-Sauerstoff durch den dunkelroten Farbstoff Si-DMA. Maßstabsleiste: 10 µm. Gelbildgebung und konfokale Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Wir begannen damit, die gut entwickelten Photosensibilisatoren miniSOG26 und KillerRed23, die stabil in HEK293T exprimiert werden, auf ihre Fähigkeit zu testen, die proteomische Markierung mit Propargylamin als chemischer Sonde zu vermitteln (ergänzende Abbildung 1a). Die In-Gel-Fluoreszenzanalyse ergab, dass mit miniSOG und Blaulichtbeleuchtung eine proteomweite Markierung erreicht wurde, während für KillerRed keine offensichtlichen Markierungsprodukte beobachtet wurden. Um das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen, testeten wir als nächstes eine Reihe chemischer Sonden, die entweder Anilin (1 und 3), Propylamin (2) oder Benzylamin (4) enthielten. Wir stellten fest, dass HEK293T-Zellen allein ein höheres Hintergrundsignal im Vergleich zum Weglassen von blauem Licht aufweisen, was vermutlich auf den endogenen Photosensibilisator Riboflavin, Flavinmononukleotid (FMN), zurückzuführen ist27. Die auf Anilin basierenden chemischen Sonden 1 und 3 ergaben eine bessere Spezifität, wobei HEK293T stabil miniSOG in Mitochondrien exprimierte und einen >8-fachen Anstieg des Signals für Sonde 3 zeigte, während Sonde 2, die in der RNA-Markierungsmethode CAP-seq verwendet wurde, nur ~2,5-fach erhöhtes Signal zeigte. Anstieg des Faltsignals, wahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Reaktivitätspräferenzen zwischen RNA und Protein (Abb. 1b, c). Darüber hinaus wurden auch die Isomere von Sonde 3 und Hydrazin-Sonde (Sonde 5, 6, 7) getestet, was bestätigt, dass Sonde 3 die optimierte ist (ergänzende Abbildung 1b, c). Ebenso wurden durch die In-Gel-Fluoreszenzanalyse weitere optimierte experimentelle Parameter ermittelt: Beleuchtungswellenlänge (460 nm), Konzentration der chemischen Sonde (1 mM) und Beleuchtungszeit (20 Minuten) (Ergänzende Abbildung 2a – c). Das Weglassen einer Komponente oder eines Schritts im PDPL-Protokoll führte zu einer signifikanten Umkehrung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses (Abb. 1d). Bemerkenswert ist, dass die Proteinmarkierung in Gegenwart von Natriumazid oder Trolox, die dafür bekannt sind, Singulettsauerstoff zu löschen, stark reduziert wurde28. Die Anwesenheit von D2O, von dem bekannt ist, dass es Singulettsauerstoff stabilisiert, verstärkte das Markierungssignal. Um den Beitrag anderer reaktiver Sauerstoffspezies zur Markierung zu untersuchen, wurden Mannitol und Vitamin C, etablierte Hydroxylradikal- bzw. Superoxidradikalfänger18,29, hinzugefügt, es wurde jedoch nicht festgestellt, dass sie die Markierung verringern. Die Zugabe von H2O2 anstelle von Beleuchtung konnte keine Markierung erzeugen (ergänzende Abbildung 3a). Die Fluoreszenzbildgebung von Singulett-Sauerstoff mittels Si-DMA-Sonde bestätigte das Vorhandensein von Singulett-Sauerstoff in der HEK293T-miniSOG-Linie, nicht jedoch in der übergeordneten HEK293T-Linie. Darüber hinaus konnte mitoSOX Red die Bildung von Superoxid nach der Beleuchtung nicht nachweisen (Abb. 1e und ergänzende Abb. 3b)30. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass Singulett-Sauerstoff der wichtigste ROS ist, der zur anschließenden Proteommarkierung führt. Die Zytotoxizität von PDPL, einschließlich der Blaulichtbeleuchtung und der Behandlung mit chemischen Sonden, wurde bewertet und es wurde keine signifikante Zytotoxizität beobachtet (ergänzende Abbildung 4a).

Um den Markierungsmechanismus zu erforschen und eine proteomische Identifizierung von Proteinkomplexen mittels LC-MS/MS zu erreichen, mussten wir zunächst bestimmen, welche Aminosäuren modifiziert wurden und wie groß die Delta-Masse der Sondenmarkierung war. Es wurde berichtet, dass Methionin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin durch Singulett-Sauerstoff verändert werden14,15. Wir haben den TOP-ABPP-Workflow31 mit einer unvoreingenommenen offenen Suche integriert, die durch die MSFragger-basierte FragPipe-Rechenplattform32 ermöglicht wird. Nach der Singulett-Sauerstoffmodifikation und der chemischen Sondenmarkierung wurde ein spaltbarer Linker mit Biotin-Retrieval-Tag für die Klick-Chemie verwendet, gefolgt von Neutravidin-Pulldown und Trypsin-Verdau. Modifizierte Peptide, die noch an das Harz gebunden waren, wurden für die LC-MS/MS-Analyse fotogespalten (Abb. 2a und ergänzende Daten 1). Massen an Modifikationen, die proteomweit mit über 50 Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSMs) auftreten, sind aufgelistet (Abb. 2b). Überraschenderweise beobachteten wir nur Veränderungen an Histidin, vermutlich aufgrund der hohen Reaktivität von oxidiertem Histidin gegenüber der Anilinsonde gegenüber anderen Aminosäuren. Gemäß dem veröffentlichten Mechanismus der Histidinoxidation durch Singulettsauerstoff21,33 entspricht die mutmaßliche Struktur für die Deltamasse +229 Da dem Addukt für Sonde 3 mit 2-Oxo-Histidin nach zweimaliger Oxidation, während +247 Da das Hydrolyseprodukt von + ist 229 Da (Ergänzende Abb. 5). Die Auswertung der MS2-Spektren zeigt mit hoher Sicherheit die Identifizierung eines großen Anteils von y-Ionen und b-Ionen, einschließlich Fragmentionen (y und b), die die Identifizierung der Modifikation ermöglichten (Abb. 2c). Die Analyse des lokalen Sequenzkontexts von PDPL-modifizierten Histidinen ergab eine mäßige Motivpräferenz für kleine, hydrophobe Reste an der ±1-Position (ergänzende Abbildung 4b). Im Durchschnitt wurden 1,4 Histidine pro Protein identifiziert und diese markierten Stellen sind gut exponiert, was durch die Analyse der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche (SASA) und der relativen Lösungsmittelzugänglichkeit (RSA) bestimmt wird (ergänzende Abbildung 4c, d).

a Ein unvoreingenommener Arbeitsablauf zur Untersuchung der Rückstandsselektivität mithilfe der MSFragger-basierten FragPipe-Rechenplattform. Für die Click-Chemie wurde ein spaltbarer Linker verwendet, der die Photoabspaltung des modifizierten Peptids vom Streptavidinharz ermöglicht. Zur Identifizierung der Modifikationsmassen sowie der entsprechenden Rückstände wurde eine offene Suche eingesetzt. b Die proteomweit auftretenden Modifikationsmassen werden zugeordnet. Das Peptidspektrum des PSM stimmt überein. c MS2-Spektrumanmerkung einer Sonde 3-modifizierten Histidinstelle. Ein repräsentatives Beispiel ist die kovalente Reaktion mit Sonde 3, die der modifizierten Aminosäure +229,0938 Da hinzufügt. d Mutationsassay zur Validierung der PDPL-Markierung. PRDX3 (H155A, H225A) und PRDX1 (H10A, H81A, H169A) wurden zusammen mit ihren Wildtyp-Plasmiden zum Anti-Flag-Nachweis transfiziert. e Ein synthetisches Peptid wurde mit gereinigtem miniSOG in Gegenwart von Sonde 3 umgesetzt und das entsprechende Produkt mit Δm +247 und +229 wurde im LC-MS-Spektrum annotiert. f In-vitro-Protein-Protein-Interaktion, simuliert durch miniSOG-6xHis-Tag und Anti-6xHis-Antikörper. Anti-Biotin (Streptavidin-HRP) und Anti-Maus-Western-Blot-Analyse des mit Sonde 3 markierten miniSOG-6xHis/anti-6xHis-Antikörperkomplexes gegen die Lichtbestrahlungszeit. Die Markierung einzelner Proteine ​​ist bei den entsprechenden Molekulargewichten angegeben: LC leichte Kette des Antikörpers; HC schwere Kette des Antikörpers. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um die Markierungsstellen biochemisch zu validieren, wurden die in der Massenspektrometrie identifizierten Histidine von PRDX3 und PRDX1 zu Alanin mutiert und in einem Transfektionsassay mit dem Wildtyp verglichen. Die PDPL-Ergebnisse zeigten, dass die Mutationen die Markierung deutlich reduzieren (Abb. 2d). In der Zwischenzeit wurde eine in der offenen Suche identifizierte Peptidsequenz synthetisiert und in vitro mit gereinigtem miniSOG in Gegenwart von Sonde 3 und blauem Licht umgesetzt, wobei Produkte mit einer Massenverschiebung von +247 und +229 Da bei der LC-MS-Detektion auftraten (Abb. 2e). ). Um zu testen, ob proximale Proteininteraktoren als Reaktion auf die Photoaktivierung von miniSOG in vitro markiert werden können, haben wir einen künstlichen Proximity-Assay über die Wechselwirkung zwischen miniSOG-6xHis-Protein und monoklonalem Anti-His-Antikörper in vitro erstellt (Abb. 2f). In diesem Assay erwarteten wir eine proximale Markierung sowohl der schweren als auch der leichten Ketten des Antikörpers durch miniSOG. Tatsächlich zeigten Anti-Maus- (erkennt sowohl schwere als auch leichte Ketten des Anti-6xHis-Tag-Antikörpers) und Streptavidin-Western-Blot eine robuste Biotinylierung schwerer und leichter Ketten. Insbesondere stellten wir eine Selbstbiotinylierung von miniSOG aufgrund des 6xHis-Tags sowie eine Vernetzung zwischen leichter und schwerer Kette fest, vermutlich aufgrund der proximalen Reaktion zwischen Lysin und 2-Oxo-Histidin, über die bereits berichtet wurde34. Zusammenfassend kamen wir zu dem Schluss, dass PDPL Histidin proximity-abhängig verändert.

Unser nächstes Ziel war die Charakterisierung subzellulärer Proteome, um die Spezifität der In-situ-Markierung zu testen. Daher exprimierten wir miniSOG stabil im Zellkern, in der mitochondrialen Matrix oder in der ER-Außenmembran von HEK293T-Zellen (Abb. 3a). Die In-Gel-Fluoreszenzanalyse ergab zahlreiche Markierungsbanden sowie unterschiedliche Markierungsmuster an den drei subzellulären Stellen (Abb. 3b). Die Fluoreszenzbildanalyse ergab eine hohe Spezifität von PDPL (Abb. 3c). Der PDPL-Workflow, gefolgt von einer Klickreaktion mit einem Rhodaminfarbstoff, wurde verwendet, um die subzellulären Proteome durch Fluoreszenzmikroskopie abzugrenzen, wobei das PDPL-Signal zusammen mit DAPI, Mitochondrien-Tracker oder ER-Tracker lokalisiert wurde, was die hohe Wiedergabetreue von PDPL validierte. Für drei Organellenpositionen ergab ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID unter Verwendung eines Anti-Biotin-Western-Blots eine spezifischere Markierung durch PDPL im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen. Unter PDPL-Bedingungen traten mehr Markierungsbanden auf, was auf mehr markierte Proteine ​​​​durch PDPL hinweist (ergänzende Abbildung 6a – d).

ein Schema der miniSOG-vermittelten organellenspezifischen proteomischen Markierung. miniSOG wird genetisch durch Fusion mit den N-terminalen 23 Aminosäuren von menschlichem COX4 (Mito-miniSOG) auf die mitochondriale Matrix, durch Fusion mit H2B (Nucleus-miniSOG) auf den Zellkern und über die zytoplasmatische Seite der ER-Membran gezielt Fusion zu Sec61β (ER-miniSOG). Die Auslesung umfasst Gelbildgebung, konfokale Bildgebung und Massenspektrometrie. b Repräsentative Gelbildgebung von drei organellenspezifischen PDPL-Profilen. CBB Coomassie Brillantblau. c Repräsentative konfokale Bildgebung von HEK293T-Zellen, die verschiedene subzellulär lokalisierte miniSOG stabil exprimieren, die mit V5-Tag-Antikörper (rot) nachgewiesen wurden. Subzelluläre Marker werden für Mitochondrien und ER (grün) verwendet. Der PDPL-Workflow umfasst Klick-Chemie mit Cy3-Azid, um die miniSOG-markierten subzellulären Proteome (gelb) zu erkennen. Maßstabsleiste: 10 µm. d Vulkandiagramme von PDPL-markierten Proteomen in verschiedenen Organellen, quantifiziert durch markierungsfreie Quantifizierung (n = 3 unabhängige biologische Experimente). Im Vulkandiagramm wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. Als Negativkontrolle wurde Wildtyp-HEK293T verwendet. Signifikant veränderte Proteine ​​werden rot hervorgehoben (p < 0,05 und >2-facher Ionenintensitätsunterschied). Relevante Proteine, die in HEK293T-miniSOG, aber nicht in HEK293T von Bedeutung sind, sind grün markiert. e Spezifitätsanalyse für proteomische Datensätze, die aus Experimenten in d abgeleitet wurden. Die Gesamtzahl der statistisch signifikanten Proteine ​​in jeder Organelle (rote und grüne Punkte) wurde oben markiert. Balken zeigen in Organellen lokalisierte Proteine ​​basierend auf MitoCarta 3.0, GO-Analyse und A. Ting et. al. Datensatz für Mitochondrien, Kern und ER. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Ermutigt durch die Gel- und Bildgebungsergebnisse wurde eine markierungsfreie Quantifizierung eingesetzt, um die identifizierten Proteome in jeder Organelle zu quantifizieren (Ergänzungsdaten 2). Als Negativkontrolle wurde nicht transfiziertes HEK293T verwendet, um die Hintergrundmarkierung abzuziehen. Die Volcano-Plot-Analyse zeigte deutlich angereicherte Proteine ​​(p < 0,05 und > 2-fache Ionenintensität) sowie Singleton-Proteine, die nur in miniSOG-exprimierenden Linien vorhanden sind (Abb. 3d, rote und grüne Punkte). Durch die Kombination dieser Daten identifizierten wir 1364, 461 und 911 statistisch signifikante Proteine ​​für den Zellkern, die Mitochondrien und die ER-Außenmembran. Um die Genauigkeit der Organellen-lokalisierten PDPL zu analysieren, verwendeten wir MitoCarta 3.0, die Gene-Ontologie-Analyse (GO) und die Analyse von A. Ting et al. Datensatz8 für Mitochondrien, Zellkern und ER zur Validierung der Organellenspezifität der erkannten Proteine, was einer Genauigkeit von 73,4, 78,5 und 73,0 % entsprach (Abb. 3e). Die Spezifität von PDPL bestätigt, dass PDPL ein ideales Werkzeug zur Identifizierung organellenspezifischer Proteome ist. Bemerkenswerterweise ergab die submitochondriale Analyse der identifizierten mitochondrialen Proteine, dass das eingefangene Proteom hauptsächlich in der Matrix und der inneren Membran verteilt war (226 bzw. 106), was 91,7 % der insgesamt identifizierten mitochondrialen Proteine ​​ausmachte (362), was den hohen Wert weiter bestätigte -Treue von PDPL (Ergänzende Abbildung 7a). Ebenso ergab die subnukleare Analyse, dass das eingefangene Proteom überwiegend im Kern, im Nukleoplasma und im Nukleolus verteilt war (ergänzende Abbildung 7b). Die Profilierung des Kernproteoms durch Peptide mit Kernlokalisierungssignalen (3xNLS) ergab eine ähnliche Genauigkeit wie das H2B-Konstrukt (ergänzende Abbildung 7c – h). Um die Markierungsspezifität von PDPL zu definieren, wurde nukleares Lamin A als diskreter lokalisierter POI-Köder ausgewählt7. PDPL identifizierte 36 signifikant angereicherte Proteine, wobei 12 Proteine ​​(30,0 %, einschließlich Lamin A) gut charakterisierte, mit Lamin A interagierende Proteine ​​waren, die von der String-Datenbank annotiert wurden, was einen höheren Prozentsatz darstellt als die BioID-Methode (28 von 122 Proteinen, 22,9 %). 7. Unsere Methode identifizierte weniger Proteine, wahrscheinlich aufgrund der eingeschränkten Markierungsfläche, die durch den reaktiveren Singulett-Sauerstoff ermöglicht wird. Die GO-Analyse zeigt, dass sich die identifizierten Proteine ​​hauptsächlich im Nukleoplasma (26), der Kernhülle (10), der Kernmembran (9) und der Kernpore (5) befinden. Zusammengenommen machen diese im Zellkern lokalisierten Proteine ​​80 % der angereicherten Proteine ​​aus, was die Spezifität von PDPL weiter demonstriert (ergänzende Abbildung 8a – d).

Nachdem wir die Fähigkeit von PDPL zur Proximity-Markierung in Organellen nachgewiesen hatten, testeten wir als Nächstes, ob PDPL zur Profilierung der Bindungspartner eines POI verwendet werden kann. Insbesondere wollten wir das PDPL-Profiling von zytosolischen Proteinen bestimmen, die aufgrund ihrer hochdynamischen Natur im Vergleich zu membranlokalisierten Gegenstücken als schwierigere Ziele angesehen wurden12. Das Bromodomänen- und extraterminale (BET) Protein BRD4 erregte unsere Aufmerksamkeit aufgrund seiner entscheidenden Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten35,36. Die von BRD4 gebildeten Komplexe sind Transkriptionskoaktivatoren und wichtige therapeutische Ziele. Durch die Regulierung der Expression der Transkriptionsfaktoren c-myc und Wnt5a wird BRD4 als Schlüsselfaktor bei akuter myeloischer Leukämie (AML), multiplem Myelom, Burkitt-Lymphom, Dickdarmkrebs und entzündlichen Erkrankungen zugeschrieben37,38. Darüber hinaus zielen mehrere Viren auf BRD4 ab, um die virale und zelluläre Transkription zu regulieren, beispielsweise das Papillomavirus, HIV und SARS-CoV-236,39.

Um eine Interaktionskarte von BRD4 mithilfe von PDPL zu bestimmen, haben wir miniSOG entweder am N- oder C-Terminus mit der kurzen Isoform von BRD4 fusioniert. Proteomische Ergebnisse zeigten eine hohe Überlappung zwischen den beiden Konstrukten (ergänzende Abbildung 9a). Das durch miniSOG-H2B bestimmte Kernproteom deckte 77,6 % der BRD4-interagierenden Proteine ​​ab (ergänzende Abbildung 9b). Als nächstes wurden verschiedene Beleuchtungszeitpunkte (2, 5, 10, 20 Minuten) verwendet, um den Markierungsradius zu regulieren (Abb. 4a und ergänzende Daten 3). Wir kamen zu dem Schluss, dass PDPL bei kürzerer Beleuchtungsdauer hauptsächlich direkte Bindungspartner markieren würde, während lange Zeiten Proteine ​​umfassen würden, die in der kürzeren Photoaktivierungsperiode identifiziert wurden, sowie indirekte Ziele in Komplexen markieren würden. Tatsächlich fanden wir eine hohe Überlappung zwischen benachbarten Zeitpunkten (84,6 % für 2 vs. 5 Min.; 87,7 % für 5 vs. 10 Min.; 98,7 % für 10 vs. 20 Min.) (Abb. 4b und ergänzende Abb. 9c). In allen Versuchsgruppen haben wir nicht nur die Selbstmarkierung von BRD4 entdeckt, sondern auch mehrere seiner bekannten Ziele, wie MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A und HMGB1, wie in der String-Datenbank kommentiert. Die Ionenintensität dieser Ziele ist proportional zur Beleuchtungszeit (Abb. 4c und ergänzende Abb. 9d). Die GO-Analyse der in der 2-Minuten-Gruppe identifizierten Proteine ​​ergab, dass die identifizierten Proteine ​​im Zellkern lokalisiert sind und an der Chromatin-Remodellierung und der RNA-Polymerase-Funktion beteiligt sind. Die molekularen Funktionen der Proteine ​​wurden durch Chromatinbindung oder Transkriptionskoaktivierung angereichert, was mit der Funktion von BRD4 übereinstimmt (Abb. 4d). Die durch die String-Datenbank ermöglichte Proteininteraktionsanalyse ergab die erste Schicht indirekter Interaktion zwischen interagierenden Komplexen der BRD4- und HDAC-Familie wie SIN3A, NCOR2, BCOR und SAP130 (Abb. 4e und ergänzende Abb. 9e), im Einklang mit BRD4 und HDACs Bindung acetylierter Histone. Darüber hinaus wurden durch LC-MS/MS identifizierte repräsentative Ziele, darunter Sin3A, NSUN2, Fus und SFPQ, durch Western Blot validiert (Abb. 4f). Kürzlich wurde berichtet, dass eine kurze Isoform von BRD4 Kernpunkte bildet, die über Flüssig-Flüssig-Phasentrennungseigenschaften (LLPS) verfügen40. Die RNA-bindenden Proteine ​​Fus und SFPQ, die LLPS für eine Vielzahl zellulärer Prozesse vermitteln41, wurden hier als nicht gemeldete BRD4-bindende Proteine ​​identifiziert. Co-Immunpräzipitationsexperimente (Co-IP) bestätigten die Wechselwirkung zwischen BRD4 und SFPQ (Abb. 4g), was auf einen anderen Mechanismus der BRD4-vermittelten Flüssig-Flüssig-Phasentrennung hinweist und weitere Untersuchungen rechtfertigt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass PDPL eine ideale Plattform zur Identifizierung bekannter BRD4-Interaktoren sowie nicht gemeldeter Bindungsproteine ​​ist.

a Schematische Darstellung der miniSOG-vermittelten BRD4-Proximity-Markierung mit Bestrahlungszeit: 2, 5, 10 und 20 Minuten. b Überlappung der identifizierten Proteine ​​für verschiedene Beleuchtungszeitpunkte. Die Anreicherung der identifizierten Proteine ​​ist bei HEK293T-miniSOG-BRD4 im Vergleich zum Wildtyp-HEK293T statistisch signifikant. c Die Ionenintensität bei der markierungsfreien Quantifizierung für repräsentative bekannte BRD4-Bindungsproteine ​​über die angegebenen Bestrahlungszeiten. n = 3 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. d Genontologie (GO)-Analyse der in der 2-Minuten-Gruppe identifizierten Proteine. Die zehn häufigsten GO-Begriffe werden aufgelistet. Blasen sind entsprechend der GO-Termklasse gefärbt und die Blasengröße ist proportional zur Anzahl der in jedem Term gefundenen Proteine. e String-Analyse von BRD4-interagierenden Proteinen. Gelbe Kreise sind direkte Bindemittel und graue Kreise befinden sich in der ersten Schicht indirekter Bindemittel. Die roten Linien zeigen experimentell bestimmte Wechselwirkungen und die cyanfarbenen Linien zeigen vorhergesagte Wechselwirkungen an. f Repräsentative BRD4-Bindungsziele, die in LC-MS/MS identifiziert wurden, wurden mittels Western Blot validiert. g Co-Immunpräzipitationsexperimente bestätigten die Wechselwirkung zwischen SFPQ und BRD4. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zusätzlich zur Identifizierung nicht gemeldeter Bindungsziele von POI stellten wir uns vor, dass PDPL zur Identifizierung von Substraten von Enzymen geeignet wäre, was die Charakterisierung indirekter Bindungsproteine ​​in einem großen Komplex erfordert, um nicht gemeldete Substrate zu annotieren. Parkin (kodiert durch PARK2) ist eine E3-Ligase, und Mutationen in Parkin verursachen bekanntermaßen die autosomal-rezessiv vererbte juvenile Parkinson-Krankheit (AR-JP)42. Darüber hinaus wird Parkin als entscheidend für die Mitophagie (Autophagie der Mitochondrien) und die Beseitigung reaktiver Sauerstoffspezies beschrieben43. Allerdings ist die Funktion von Parkin bei dieser Krankheit trotz der Identifizierung mehrerer seiner Substrate unklar. Um seine nicht charakterisierten Substrate zu kommentieren, wurde PDPL durch Einbau von miniSOG an den N- oder C-Termini von Parkin getestet. Die Zellen wurden mit Protonophor-Carbonylcyanid-m-chlorphenyl-hydrazon (CCCP) behandelt, um Parkin über den PINK1-Parkin-Weg zu aktivieren. Im Gegensatz zu unseren BRD4-PDPL-Ergebnissen identifizierte die Parkin-N-terminale Fusion einen viel größeren Satz von Proteinzielen, obwohl sie den größten Teil des C-Terminus abdeckt (177 von 210) (Abb. 5a, b und ergänzende Daten 4). . Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Bericht, dass die N-terminale Markierung Parkin44 fehlerhaft aktivieren kann. Überraschenderweise weisen unsere Daten nur 18 überlappende Proteine ​​mit veröffentlichten AP-MS-Ergebnissen für Parkin43 auf, was wahrscheinlich auf Unterschiede zwischen Zelllinien und Proteomik-Workflows zurückzuführen ist. PDPL konnte ausschließlich 11 bekannte Bindungspartner von Parkin (ATXN2, IKBKG, PSMD4, TP53, SUMO1, PSMD9, STUB1, PSMD4, DNAJB1, UBE2Z und EPS15) identifizieren, zusätzlich zu vier bekannten Proteinen, die durch beide Ansätze identifiziert wurden (ARDM1, HSPA8, PSMD14). und PSMC3) (Abb. 5c)43. Zur weiteren Validierung der LC-MS/MS-Ergebnisse wurden PDPL-Verarbeitung und anschließende Western-Blot-Analyse verwendet, um Pulldown-Ergebnisse für HEK293T-Elternzellen und die N-terminale Parkin-Stabillinie zu vergleichen. Die bisher unbekannten Ziele CDK2, DUT, CTBP1 und PSMC4 wurden zusammen mit dem bekannten Binder DNAJB1 validiert (Abb. 5d).

a Vulkandiagramme von Parkin-interagierenden Proteinen in HEK293T-Zellen mit stabil exprimiertem miniSOG, das entweder an den N-Terminus oder C-Terminus von Parkin fusioniert ist (n = 3 unabhängige biologische Experimente). Im Vulkandiagramm wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. Als Negativkontrolle wurde HEK293T verwendet. Signifikant veränderte Proteine ​​werden rot hervorgehoben (p < 0,05 und >2-facher Ionenintensitätsunterschied). Relevante Proteine, die in HEK293T-miniSOG, aber nicht in HEK293T von Bedeutung sind, sind grün markiert. b Venn-Diagramm, das überlappende Proteine ​​zwischen N-terminalen und C-terminalen Konstrukten zeigt. N-terminale Markierung kann Parkin fehlerhaft aktivieren und zu mehr identifizierten Proteinen führen. c Venn-Diagramm, das überlappende Proteine ​​zwischen PDPL und AP-MS zeigt. Bekannte Interaktoren werden aufgelistet, darunter vier Proteine ​​von 18 überlappenden Proteinen sowie 11 Proteine ​​von 159, die ausschließlich in PDPL identifiziert wurden. d Durch LC-MS/MS identifizierte repräsentative Ziele wurden mittels Western Blot validiert. e Ssu72 und SNW1 wurden als nicht gemeldete Substrate von Parkin identifiziert. Plasmide mit diesen mit FLAG markierten Proteinen wurden in HEK293T und HEK293T-Parkin-miniSOG transfiziert, gefolgt von einer CCCP-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten. Der Abbau ist in der Parkin-überexprimierenden Linie stärker ausgeprägt. f Es wurde bestätigt, dass der Ssu72- und SNW1-Abbauprozess durch den Ubiquitinierungs-Proteasom-Weg unter Verwendung des Proteasom-Inhibitors MG132 vermittelt wird. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Insbesondere sollten die durch PDPL identifizierten Proteine ​​sowohl Bindungsproteine ​​von Parkin als auch seine Substrate umfassen. Um nicht gemeldete Substrate von Parkin zu entdecken, wählten wir sieben identifizierte Proteine ​​(PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 und SNW1) und transfizierte Plasmide aus und entblößten diese Gene in normales HEK293T sowie HEK293T, das miniSOG-Parkin stabil exprimiert, gefolgt von CCCP-Behandlung. Die Ssu72- und SNW1-Proteinspiegel waren in stabilen MiniSOG-Parkin-Linien signifikant verringert (Abb. 5e). Eine 12-stündige CCCP-Behandlung führte zu dem deutlichsten Abbau beider Substrate. Um zu untersuchen, ob der Abbau von Ssu72 und SNW1 durch den Ubiquitinierungs-Proteasom-Weg reguliert wird, wurde der Proteasom-Inhibitor MG132 zugesetzt, um die Proteasom-Aktivität zu hemmen, und tatsächlich stellten wir fest, dass ihr Abbauprozess gehemmt wurde (Abb. 5f). Die anderen Nicht-Substrat-Ziele wurden mittels Western Blot als Interaktoren von Parkin validiert (ergänzende Abbildung 10), was konsistente Ergebnisse mit LC-MS/MS zeigte. Zusammengenommen ist die Integration des PDPL-Workflows mit der Validierung der Zielproteintransfektion in der Lage, nicht gemeldete Substrate für E3-Ligasen zu identifizieren.

Wir haben eine allgemeine Proximity-Labeling-Plattform entwickelt, die eine räumlich-zeitlich aufgelöste Identifizierung von POI-Interaktoren ermöglicht. Diese Plattform basiert auf dem Photosensibilisator-Protein miniSOG, das nur ~12 kD groß ist, weniger als halb so groß wie das gut entwickelte Enzym APEX2 (27 kD) und ein Drittel so groß wie TurboID (35 kD). Die geringere Größe dürfte den Anwendungsbereich für die Untersuchung des Interaktoms kleiner Proteine ​​erheblich erweitern. Die zukünftige Erforschung zusätzlicher Photosensibilisatoren, sowohl genetisch kodierter Proteine ​​als auch kleiner Moleküle45, ist gerechtfertigt, um die Singulett-Sauerstoffquantenausbeute zu erhöhen und die Empfindlichkeit dieses Ansatzes zu erweitern. Bei der aktuellen miniSOG-Version ermöglicht die Verwendung von Blaulichtbeleuchtung zur Initiierung der Proximity-Kennzeichnung eine hohe zeitliche Auflösung. Darüber hinaus setzen längere Bestrahlungsperioden eine größere „Wolke“ von Singulett-Sauerstoff frei, was zur Modifikation weiter distaler Histidinreste führt, den Markierungsradius erweitert und eine Feinabstimmung der räumlichen Auflösung von PDPL ermöglicht. Wir haben außerdem sieben chemische Sonden untersucht, um das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen, und den molekularen Mechanismus untersucht, der diesem Ansatz zugrunde liegt. Der TOP-ABPP-Workflow in Verbindung mit einer unvoreingenommenen offenen Suche bestätigte, dass die Modifikation nur an Histidin auftrat und keine konsistente Mikroumgebung für eine erhöhte Histidinmodifikation beobachtet wurde, abgesehen von einer mäßigen Präferenz für Histidin in Schleifenregionen.

PDPL wurde auch zur Charakterisierung subzellulärer Proteome verwendet, wobei die Spezifität und Proteomabdeckung zumindest mit anderen Proximity-Labeling-Methoden und organellenspezifischen, auf chemischen Sonden basierenden Methoden vergleichbar waren. Die Proximity-Markierung wurde auch erfolgreich bei der Charakterisierung von Oberflächen-, Lysosomen-Proteomen und sekretorischen Signalweg-assoziierten Proteomen eingesetzt46,47. Wir glauben, dass PDPL mit diesen subzellulären Organellen kompatibel wäre. Darüber hinaus haben wir PDPL mit der Identifizierung von zytosolischen Proteinbindungszielen herausgefordert, was aufgrund ihrer dynamischen Natur und Beteiligung an vorübergehenderen Wechselwirkungen schwieriger ist als membrangebundene Proteine. PDPL wurde auf zwei Proteine ​​angewendet, den Transkriptionskoaktivator BRD4 und die krankheitsbedingte E3-Ligase Parkin. Diese beiden Proteine ​​wurden nicht nur aufgrund ihrer grundlegenden biologischen Funktionen, sondern auch aufgrund ihrer klinischen Relevanz und ihres therapeutischen Potenzials ausgewählt. Für beide POIs wurden sowohl bekannte Bindungspartner als auch unbekannte Ziele identifiziert. Insbesondere wurde ein mit der Phasentrennung in Zusammenhang stehendes Protein SFPQ durch ein Co-IP validiert, was auf einen neuen Mechanismus hinweisen könnte, bei dem BRD4 (kurze Isoform) LLPS reguliert. Unterdessen ist die Identifizierung von Parkin-Substraten unseres Erachtens ein Szenario, in dem die Identifizierung indirekter Bindemittel erforderlich ist. Wir haben zwei nicht gemeldete Parkin-Substrate identifiziert und ihren Abbau durch den Ubiquitinierungs-Proteosomen-Weg validiert. Vor kurzem wurde eine mechanismusbasierte Fallenstrategie entwickelt, um Hydrolasesubstrate durch Einfangen der Substrate mit dem Enzym zu entdecken48. Obwohl es sich um einen äußerst leistungsstarken Ansatz handelt, eignet er sich nicht zur Profilierung von Substraten, die an der Bildung großer Komplexe beteiligt sind, und erfordert die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Enzymen und Substraten. Wir gehen davon aus, dass PDPL auf die Untersuchung anderer Proteinkomplexe und Enzymfamilien ausgeweitet werden könnte, beispielsweise der Deubiquitinase- und Metalloprotease-Familien.

Eine neue Form von miniSOG, genannt SOPP3, wurde mit verbesserter Singulett-Sauerstoffausbeute entwickelt49. Wir haben miniSOG mit SOPP3 verglichen und festgestellt, dass die Markierungseffizienz erhöht war, obwohl das Signal-Rausch-Verhältnis unverändert blieb (ergänzende Abbildung 11). Wir gehen davon aus, dass die SOPP3-Optimierung (z. B. durch gerichtete Evolution) zu einem effizienteren Photosensibilisatorprotein führen würde, das eine viel kürzere Beleuchtungszeit erfordert, was die Erfassung dynamischerer zellulärer Prozesse ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass die aktuelle Version von PDPL auf die zelluläre Umgebung beschränkt ist, da sie eine blaue Lichtbeleuchtung erfordert, die nicht tief in das Gewebe eindringen kann. Dieses Merkmal verhindert seinen Nutzen in Tiermodellstudien. Optogenetische Technologien in Verbindung mit PDPL könnten jedoch eine Möglichkeit für Tierstudien50 bieten, insbesondere im Gehirn. Darüber hinaus würden auch andere technische Infrarot-Photosensibilisatoren diese Einschränkung mildern. Derzeit wird in dieser Richtung geforscht.

Die HEK293T-Zelllinie wurde von ATCC (CRL-3216) erhalten. Die Zelllinie wurde negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet und in DMEM (Thermo, Nr. C11995500BT), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Vistech, Nr. SE100-B) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Hyclone, Nr. SV30010), kultiviert. .

3-Aminophenylen (Sonde 3) und (4-Ethinylphenyl)methanamin (Sonde 4) wurden von Bidepharm bezogen. Propylamin (Sonde 2) wurde von Energy-chemicals bezogen. N-(2-Aminophenyl)pent-4-inamid (Sonde 1) wurde gemäß einem veröffentlichten Verfahren51 synthetisiert.

In der Ergänzungstabelle 1 sind die in dieser Studie verwendeten genetischen Konstrukte aufgeführt. Die miniSOG- und KillerRed-Sequenzen wurden aus Geschenkplasmiden von P. Zou (Universität Peking) kloniert. Die mitochondriale Matrix-Targeting-Sequenz wurde von den N-terminalen 23 Aminosäuren von COX4 abgeleitet und dann durch Gibson-Assemblierung (Beyotime, #D7010S) in bestimmte Vektoren kloniert. Für das Targeting auf die Membran und den Kern des endoplasmatischen Retikulums wurden menschliche SEC61B-DNA (NM_006808.3), die über PCR amplifiziert wurde (NEB, #M0491L), aus der HEK293T-Zell-cDNA-Bibliothek und H2B-DNA (ein Geschenk von D. Lin im Shenzhen Bay Laboratory) verwendet geklont wie oben. Andere Proteingene, die bei der Transfektion und dem Aufbau stabiler Zelllinien verwendet werden, wurden über PCR aus der HEK293T-Zell-cDNA-Bibliothek amplifiziert, sofern nicht anders angegeben. G3S (GGGS) und G4S (GGGGS) wurden als Linker zwischen dem Köderprotein und miniSOG verwendet. Diesen Fusionskonstrukten wurde ein V5-Epitop-Tag (GKPIPNPLLGLDST) hinzugefügt. Zur Expression bei Säugetieren und zur Schaffung stabiler Zelllinien wurden miniSOG-Fusionskonstrukte in einen lentiviralen Vektor pLX304 subkloniert. Für die bakterielle Expression wurde miniSOG in einen pET21a-Vektor mit 6xHis-Tag am C-Terminus kloniert.

HEK293T-Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit 2,0 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät und nach 24 Stunden mit einem rekombinanten lentiviralen Plasmid (2,4 μg pLX304) und Virusverpackungsplasmiden (1,5 μg psPAX2 und 1,2 μg pMD2.G) unter Verwendung von Lipo8000 transfiziert ( Beyotime, #C0533) bei ~80 % Konfluenz. Nach der Transfektion über Nacht wurden die Medien ausgetauscht und weitere 24 Stunden lang inkubiert. Die Virussammlung wurde nach 24, 48 und 72 Stunden durchgeführt. Virale Medien wurden mit einem 0,8-μm-Filter (Merck, #millex-GP) gefiltert und Polybrene (Solarbio, #H8761) wurde in einer Konzentration von 8 μg/ml vor der Infektion der Zielzelllinien zugegeben. Nach 24 Stunden konnten sich die Zellen durch Medienaustausch erholen. Die Zellen wurden mit Blasticidin (Solarbio, Nr. 3513-03-9) bei 5 μg/ml für die ersten drei Passagen als Selektion mit geringerer Stringenz selektiert. Dann wurden 20 μg/ml als höhere Stringenz für die folgenden drei Passagen verwendet.

Die Zellen wurden in einer Kammer mit 12 Vertiefungen (Ibidi, #81201) mit einer Dichte von ~20.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Um die Haftung von HEK293T-Zellen zu verbessern, wurden die Kammern 1 Stunde lang bei 37 °C mit 50 μg/ml Fibronektin (Corning, Nr. 356008), verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sangon, Nr. B640435), vorbehandelt und durch PBS entfernt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 1 mM Sonde 3 in frischer Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco, Nr. 14025092) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann 10 Stunden lang mit einer blauen LED (460 nm) beleuchtet min bei Zimmertemperatur. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Formaldehyd (Sangon, Nr. E672002) in PBS bei Raumtemperatur 15 Minuten lang fixiert. Überschüssiger Formaldehyd wurde aus den fixierten Zellen durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die Zellen wurden dann mit 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) in PBS permeabilisiert und dann noch dreimal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurde die Kammer entfernt und jeder Probe wurde eine 25-μL-Mischung aus Click-Reaktionsreagenzien zugesetzt, die 50 μM Cy3-Azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008) und 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ) enthielt -4) und 0,5 mg/ml Natriumascorbat (Aladdin, #S105024) und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Klick-Reaktion wurden die Zellen sechsmal mit PBS mit 0,05 % Tween-20 (Sangon, Nr. A600560) (PBST) gewaschen und dann mit 5 % BSA (Abcone, Nr. B24726) in PBST 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert.

Zur Immunfärbung, um die Kolokalisationsanalyse zu ermöglichen, wurden die Zellen mit Primärantikörpern gemäß den angegebenen Bedingungen inkubiert: monoklonaler Anti-V5-Tag-Maus-Antikörper (1:500, CST, Nr. 80076), monoklonaler Anti-Hsp60-Kaninchen-Antikörper (1:1000, ABclonal, #A0564), polyklonaler Anti-Calnexin-Kaninchen-Antikörper (1:500, Abcam, #ab22595) oder monoklonaler Anti-Lamin A/C-Kaninchen-Antikörper (1:500; CST, #2032) über Nacht bei 4 °C. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die Zellen mit sekundärem Antikörper inkubiert: Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (Thermo, Nr. A11034) in einer Verdünnung von 1:1000, Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 594 (CST, Nr. 8889) in einer Verdünnung von 1:1000 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnen. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBST gewaschen und 10 Minuten bei Raumtemperatur mit DAPI (Thermo, Nr. D1306) in PBS gegengefärbt. Die Zellen wurden zur Bildgebung nach dreimaligem Waschen mit PBS in 50 % Glycerin (Sangon, Nr. A600232) in PBS versiegelt. Immunfluoreszenzbilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop ZEISS LSM 900 Airyscan2 mit der Software ZNE 3.5 aufgenommen.

Zur Fluoreszenzbildgebung von Singulett-Sauerstoff wurden die Zellen zweimal mit Hanks' HEPES-Puffer gewaschen, dann wurden 100 nM Si-DMA (DOJINDO, #MT05) in Hanks' HEPES-Puffer hinzugefügt. Nach der Beleuchtung wurden die Zellen 45 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert. Danach wurden die Zellen zweimal mit Hanks' HEPES-Puffer gewaschen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Hoechst in Hanks' HEPES-Puffer gegengefärbt und mit dem konfokalen ZEISS LSM 900-Mikroskop abgebildet. Für die Fluoreszenzbildgebung von Superoxid wurden den Zellen 5 μM MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Invitrogen, #M36008) in HBSS-Puffer mit Calcium und Magnesium zugesetzt. Nach der Beleuchtung oder Behandlung mit Doxorubicin (MCE, #HY-15142A) wurden die Zellen 10 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert, zweimal mit HBSS-Puffer gewaschen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Hoechst in HBSS-Puffer gegengefärbt. Doxorubicin wurde als Positivkontrolle für die Sonde verwendet, wobei die Zellen 30 Minuten lang mit 20 μM Doxorubicin in HBSS mit 1 % BSA behandelt wurden. Immunfluoreszenzbilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop ZEISS LSM 900 aufgenommen.

HEK293T-Zellen, die Mito-miniSOG stabil exprimieren, wurden in 15-cm-Schalen mit einer Dichte von ~30 % ausgesät. Nach 48 Stunden, als eine Konfluenz von ~80 % erreicht war, wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 1 mM Sonde 3 in frischem HBSS-Puffer 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer blauen LED beleuchtet. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, abgekratzt und in einem eiskalten PBS-Puffer, der EDTA-freien Proteaseinhibitor (MCE, # HY-K0011) enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden durch 1-minütige Ultraschallbehandlung mit der Spitze lysiert (1 s an und 1 s aus, 35 % Amplitude). Die resultierende Mischung wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.871 × g zentrifugiert, um die Trümmer zu entfernen, und die Konzentration des Überstands wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits (Beyotime, Nr. P0009) auf 4 mg/ml eingestellt. 1 ml des obigen Lysats wurde mit 0,1 mM photospaltbarem Biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-Ligand (Aladdin, #T162437) und 1 mM inkubiert CuSO4 für 1 Stunde mit Rotation von unten nach oben bei Raumtemperatur. Nach der Klick-Reaktion wurde die Mischung zu einer vorgemischten Lösung (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) in einer 10-ml-Glasflasche gegeben. Die Proben wurden gemischt und 10 Minuten lang bei 4500 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Lösung der unteren und oberen Schicht wurde nacheinander verworfen, und das Pellet wurde anschließend zweimal mit 1 ml Methanol gewaschen, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 15.871 × g und 4 °C. 1 ml 8 M Harnstoff (Aladdin, #U111902) in 25 mM Ammoniumbicarbonat (ABC, Aladdin, #A110539) wurde hinzugefügt, um das Pellet aufzulösen. Die Proben wurden mit 10 mM Dithiothreitol (Sangon, #A100281, in 25 mM ABC) bei 55 °C für 40 Minuten reduziert und dann durch Zugabe von 15 mM frischem Iodacetamid (Sangon, #A600539) im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten alkyliert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden weitere 5 mM Dithiothreitol zugegeben. Etwa 100 μl NeutrAvidin-Agaroseharzkügelchen (Thermo, Nr. 29202) für jede Probe wurden durch dreimaliges Waschen mit 1 ml PBS hergestellt. Die obige Proteomlösung wurde mit 5 ml PBS verdünnt und mit vorgewaschenen NeutrAvidin-Agarose-Harzkügelchen 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden die Perlen dreimal mit 5 ml PBS mit 0,2 % SDS (Sangon, Nr. A600485), dreimal mit 5 ml PBS mit 1 M Harnstoff und dreimal mit 5 ml ddH2O gewaschen. Die Perlen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 200 μl 25 mM ABC resuspendiert, das 1 M Harnstoff, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) und 20 ng/μl Trypsin (Promega, #V5280) enthielt. Der Trypsinverdau wurde bei 37 °C unter Rotation über Nacht durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure (Thermo, Nr. A117-50) gestoppt, bis der pH-Wert 2–3 erreichte. Die Perlen wurden dreimal mit 1 ml PBS mit 0,2 % SDS, dreimal mit 1 ml PBS mit 1 M Harnstoff und dann dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen. Freisetzung modifizierter Peptide durch 90-minütige Photospaltung (365 nm) mit 200 μL 70 % MeOH. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt. Anschließend wurden die Perlen einmal mit 100 μl 70 %igem MeOH gewaschen und der Überstand vereinigt. Die Proben wurden in einem Speedvac-Vakuumkonzentrator getrocknet und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Zur Identifizierung und Quantifizierung von Singulett-Sauerstoff-modifizierten Peptiden wurden die Proben erneut in 0,1 % Ameisensäure gelöst und 1 μg Peptide wurden mit einem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer analysiert, das mit einer Nano-ESI-Quelle mit dem vom Hersteller bereitgestellten Tune und Xcalibur ausgestattet war 4.3 Software. Die Proben wurden auf einer hauseigenen gepackten 75 μm × 15 cm Kapillarsäule mit 3 μm C18-Material (ReproSil-pur, #r13.b9.) aufgetrennt und an ein EASY-nLC 1200 UHPLC-System (Thermo) angeschlossen. Die Peptide wurden chromatographisch durch einen linearen 95-minütigen Gradienten von 8 bis 50 % Lösungsmittel B (A = 0,1 % Ameisensäure in Wasser, B = 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril) getrennt, gefolgt von einem linearen Anstieg auf 98 % B in 6 min bei einer Flussrate von 300 nL/min. Der Orbitrap Fusion Lumos erfasste Daten datenabhängig und wechselte zwischen Vollscan-MS- und MS2-Scans. Die Sprühspannung wurde auf 2,1 kV eingestellt und die Temperatur der Ionentransferkapillare betrug 320 °C. Die MS-Spektren (350–2000 m/z) wurden mit einer Auflösung von 120.000, einer AGC von 4 × 105 und einer maximalen Injektionszeit von 150 ms aufgenommen. Die zehn am häufigsten vorkommenden mehrfach geladenen Vorläufer aus jedem vollständigen Scan wurden durch HCD mit 30 % normalisierter Kollisionsenergie, Quadrupol-Isolationsfenstern von 1,6 m/z und einer Auflösungseinstellung von 30.000 fragmentiert. Es wurden AGC-Ziele für ein Tandem-Massenspektrum von 5 × 104 und einer maximalen Injektionszeit von 150 ms verwendet. Der dynamische Ausschluss wurde auf 30 s festgelegt. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS abgelehnt.

Die Rohdaten wurden mit der MSFragger-basierten FragPipe-Rechenplattform32 verarbeitet. Zur Bestimmung der Massenverschiebung und der entsprechenden Aminosäuren wurde ein offener Suchalgorithmus mit einer Vorläufer-Massentoleranz von –150 bis 500 Da verwendet. Anschließend wurden Modifikationen an Histidin mit der Delta-Masse +229,0964 und +247,1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) verwendet, um die modifizierten Peptide zu identifizieren.

Zellen, die stabil miniSOG-Fusionsgene exprimieren, wurden in eine 6-cm-Schale ausgesät. Bei Erreichen einer Konfluenz von ~80 % wurden die Zellen einmal mit HBSS (Gibco, Nr. 14025092) gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit chemischen Sonden in HBSS bei 37 °C und einer 20-minütigen Beleuchtung mit einer blauen 10-W-LED bei Raumtemperatur. Um zu bestimmen, welche Art reaktiver Sauerstoffspezies an PDPL beteiligt ist, werden 0,5 mM Vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) verwendet. Als Zusätze wurden den Zellen 100 mM Mannitol (Energy Chemical, Nr. 69-65-8), 100 μM H2O2 und 10 mM NaN3 zugesetzt. Nach dem Spülen mit kaltem PBS wurden die Zellen abgekratzt, in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und in 200 μl PBS mit 1x EDTA-freiem Proteaseinhibitor unter Verwendung von Spitzenbeschallung für 1 Minute (1 s an und 1 s aus, 35 % Amplitude) lysiert. . Die resultierende Mischung wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.871 × g zentrifugiert und die Konzentration des Überstands wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits auf 1 mg/ml eingestellt. Etwa 50 μl des obigen Lysats wurden mit 0,1 mM Rhodaminazid (Aladdin, Nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-Ligand und 1 mM CuSO4 1 Stunde lang unter Rotation von unten nach oben bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Click-Reaktion wurde eine Acetonfällung durch Zugabe von 250 μl vorgekühltem Aceton zur Probe, Inkubation bei –20 °C für 20 Minuten und Zentrifugation bei 6010 × g für 10 Minuten bei 4 °C durchgeführt. Das Pellet wurde gesammelt und in 50 μl 1x Laemmli-Puffer 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Die Proben wurden dann in SDS-PAGE-Langgel laufen gelassen und mit dem Bio-rad ChemiDoc MP Touch-Bildgebungssystem mit Image Lab Touch-Software visualisiert.

Die Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins miniSOG-6xHis wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt18. Kurz gesagt, Escherichia coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02)-Zellen wurden mit pET21a-miniSOG-6xHis transformiert und induzierten die Proteinexpression durch 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168). Nach der Zelllyse wurde das Protein über Ni-NTA-Agarosekügelchen (MCE, #70666) gereinigt, gegen PBS dialysiert und bei –80 °C gelagert.

Für den Antikörper-basierten Proximity-Labeling-Assay in vitro wurden 100 μM gereinigtes miniSOG, 1 mM Sonde 3 und 1 μg monoklonaler Anti-His-Tag-Maus-Antikörper (TransGen, #HT501-01) in PBS mit 50 μL Gesamtreaktionsvolumen gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 0, 2, 5, 10 und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit blauem LED-Licht bestrahlt. Die Mischung wurde mit 0,1 mM Biotin-PEG3-Azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-Ligand und 1 mM CuSO4 auf einem Bottom-Up-Schüttler bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Nach der Klickreaktion wurde der Mischung direkt 4x Laemmli-Puffer zugesetzt und 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Die Proben wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mittels Streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) Western Blot analysiert.

Für den peptidbasierten Proximity-Labeling-Assay in vitro wurde ein histidinhaltiges synthetisches Peptid (LHDALDAK-CONH2) mit C-terminaler Amidierung verwendet. In diesem Assay wurden 100 μM gereinigtes miniSOG, 10 mM Sonde 3 und 2 μg/ml synthetisches Peptid in PBS mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit blauem LED-Licht bestrahlt. Eine Mikroliterprobe wurde mit einem LC-MS-System (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Mass Spectrometer mit MassLynx Spectrum-Analysesoftware) analysiert.

HEK293T-Zellen, die stabil miniSOG-Fusionsgene exprimieren, wurden in 10-cm-Schalen für verschiedene Organellenlokalisierungslinien (Mito, ER, Nucleus) und in 15-cm-Schalen für Parkin-miniSOG- und BRD4-miniSOG-Linien ausgesät. Bei Erreichen einer Konfluenz von ~90 % wurden die Zellen einmal mit HBSS gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Sonde 3 in HBSS bei 37 °C und Beleuchtung mit einer blauen 10-W-LED, wie bei Raumtemperatur angezeigt. Für die Parkin-Proximity-Markierung wurden 10 μM Protonophor-Carbonylcyanid-m-Chlorphenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) zusammen mit Sonde 3 in HBSS bei 37 °C für 1 Stunde zugegeben. Zelllyse, Click-Chemie, Reduktion und Alkylierungsschritte waren die gleichen wie oben, außer dass 2 mg Lysat eingegeben wurden und Biotin-PEG3-Azid anstelle von fotospaltbarem Biotin-Azid in der Click-Reaktion verwendet wurde. Nach der Perlenanreicherung wurden die Perlen dreimal mit 5 ml PBS mit 0,2 % SDS, dreimal mit 5 ml PBS mit 1 M Harnstoff und dreimal mit 5 ml PBS gewaschen. Danach wurden 2 µg Trypsin in 300 µL 25 mM ABC mit 1 M Harnstoff zur Proteinverdauung über Nacht bei 37 °C hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure gestoppt, bis der pH-Wert 2–3 erreichte. Nach der On-Bead-Trypsin-Verdauung wurde die Peptidlösung mit der SOLAµ HRP-Säule (Thermo, Nr. 60209-001) entsalzt und im Speedvac-Vakuumkonzentrator getrocknet. Die Peptide wurden in 0,1 % Ameisensäure erneut aufgelöst und 500 ng Peptide wurden mit einem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer analysiert, das wie oben beschrieben mit einer Nano-ESI-Quelle ausgestattet war. Die Peptide wurden auf einer kommerziellen RP-HPLC-Vorsäule (75 μm × 2 cm) (Thermo, Nr. 164946) und einer RP-HPLC-Analysesäule (75 μm × 25 cm) (Thermo, Nr. 164941) getrennt, beide gepackt mit 2 μm C18-Perlen unter Verwendung eines linearen Gradienten im Bereich von 8 bis 35 % ACN in 60 Minuten und gefolgt von einem linearen Anstieg auf 98 % B in 6 Minuten bei einer Flussrate von 300 nL/min. Die MS-Spektren (350 – 1500 m/z) wurden mit einer Auflösung von 60.000, einer AGC von 4 × 105 und einer maximalen Injektionszeit von 50 ms aufgenommen. Ausgewählte Ionen wurden nacheinander in einem 3-s-Zyklus durch HCD mit 30 % normalisierter Kollisionsenergie, Quadrupol-Isolationsfenstern von 1,6 m/z und einer Auflösung von 15.000 fragmentiert. Es wurden AGC-Ziele für ein Tandem-Massenspektrum von 5 × 104 und eine maximale Injektionszeit von 22 ms verwendet. Der dynamische Ausschluss wurde auf 45 s festgelegt. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS abgelehnt.

Die Probenvorbereitungsschritte bis zur Anreicherung mit NeutrAvidin-Kügelchen waren die gleichen wie bei der oben erwähnten LC-MS/MS-Analyse. Etwa 50 µg Lysat wurden als Ladekontrolleingabe und 2 mg Lysat für die Klickreaktion verwendet. Nach der NeutrAvidin-Anreicherung und dem Waschen wurden die Bindungsproteine ​​durch Zugabe von 50 µL Laemmli-Puffer zu den Agaroseharzkügelchen und 5-minütiges Kochen bei 95 °C eluiert. Beladungskontrolleingaben und mit Perlen angereicherte Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Standard-Western-Blot-Methoden auf PVDF-Membranen (Millipore, #ISEQ00010) übertragen. Die Membranen wurden in 5 % fettfreier Milch (Sangon, Nr. A600669) in TBS mit 0,1 % Tween-20 (TBST) blockiert und nacheinander mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Der Primärantikörper wurde in einer 1:1000-Verdünnung in 5 % fettfreier Milch in TBST verwendet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Sekundärantikörper wurden im Verhältnis 1:5000 verwendet und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden mittels Chemilumineszenz mit dem Chemidoc MP-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Als Quelldaten werden unbeschnittene Scans aller Blots und Gele in den Abbildungen bereitgestellt.

Zu den in dieser Studie verwendeten Primärantikörpern gehören der monoklonale Anti-SFPQ-Kaninchen-Antikörper (CST, Nr. 71992), der monoklonale Anti-FUS-Kaninchen-Antikörper (CST, Nr. 67840), der polyklonale Anti-NSUN2-Kaninchen-Antikörper (Proteintech, Nr. 20854-1-AP), Polyklonaler Anti-mSin3A-Kaninchen-Antikörper (Abcam, #ab3479), monoklonaler Anti-Flag-Tag-Maus-Antikörper (TransGen, #HT201-02), monoklonaler Anti-β-Actin-Maus-Antikörper (TransGen, #HC201-01), Anti-CDK2-Kaninchen monoklonaler Antikörper (ABclonal, #A0094), monoklonaler Anti-CTBP1-Kaninchen-Antikörper (ABclonal, #A11600), polyklonaler Anti-DUT-Kaninchen-Antikörper (ABclonal, #A2901), polyklonaler Anti-PSMC4-Kaninchen-Antikörper (ABclonal, #A2505), Anti- DNAJB1 polyklonaler Kaninchen-Antikörper (ABclonal, #A5504). Diese Antikörper wurden in einer 1:1000-Verdünnung in 5 % fettfreier Milch bei TBST verwendet. Zu den in dieser Studie verwendeten Sekundärantikörpern gehören Anti-Kaninchen-IgG (TransGen, #HS101-01) und Anti-Maus-IgG (TransGen, #HS201-01) in einer Verdünnung von 1:5000.

Um weiter zu untersuchen, ob BRD4 mit SFPQ interagiert, wurden stabile HEK293T- und BRD4-miniSOG-überexprimierende HEK293T-Zellen in 10-cm-Schalen ausgesät. Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml Pierce IP Lysis Buffer (Thermo Fisher, #87787) mit 1x EDTA-freiem Proteaseinhibitor 30 Minuten bei 4 °C lysiert. Danach wurden die Lysate in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.871 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und mit 5 µg monoklonalem Anti-V5-Tag-Maus-Antikörper (CST, Nr. 80076) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Etwa 50 µL Protein A/G-Magnetkügelchen (MCE, #HY-K0202) wurden zweimal mit PBS gewaschen, das 0,5 % Tween-20 enthielt. Das Zelllysat wurde anschließend mit den Magnetkügelchen unter Rotation von unten nach oben für 4 Stunden bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen viermal mit 1 ml PBST-Puffer gewaschen und 5 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Die Proben wurden in SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Standard-Western-Blot-Methoden auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden in 5 % fettfreier Milch in TBST blockiert und nacheinander mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Der primäre monoklonale Anti-SFPQ-Kaninchenantikörper (CST, Nr. 71992) wurde in einer Verdünnung von 1:1000 in 5 % fettfreier Milch in TBST verwendet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anti-Kaninchen-IgG wurde im Verhältnis 1:5000 verwendet und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden mittels Chemilumineszenz mit dem Chemidoc MP-Bildgebungssystem sichtbar gemacht.

Alle für die Analyse der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche (SASA) verwendeten Strukturen wurden aus der Protein Data Bank (PDB)52 oder der AlphaFold Protein Structure Database53 bezogen. Die absolute SASA jedes Rückstands wurde mit dem FreeSASA-Programm54 berechnet. Zur Ermittlung der durchschnittlichen SASA für jede Struktur wurden nur vollständige und eindeutige SASA-Daten sowohl der markierten Histidine als auch ihrer Nachbarn verwendet. Die relative Lösungsmittelzugänglichkeit (RSA) für jedes Histidin wurde berechnet, indem die absoluten SASA-Werte durch die empirisch maximal mögliche, für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche des Rückstands dividiert wurden55. Dann wurden alle Histidine als vergraben eingestuft, wenn der durchschnittliche RSA unter 20 % lag, andernfalls als exponiert56.

Im DDA-Modus erfasste Rohdateien wurden mit Proteome Discoverer (v2.5) oder MSfragger (Fragpipe v15.0) mit entsprechenden, von SwissProt geprüften Proteindatenbanken abgeglichen, die häufige Kontaminanten enthielten. Die Peptide mussten vollständig tryptisch sein und maximal zwei fehlende Spaltstellen aufweisen, Carbamidomethylierung als feste Modifikation und Methioninoxidation als dynamische Modifikation. Die Vorläufer- und Fragmentmassentoleranz wurde auf 10 ppm bzw. 0,02 Da (MS2-Orbitrap) eingestellt. Kontaminationstreffer wurden entfernt und Proteine ​​​​gefiltert, um eine Falscherkennungsrate von <1 % zu erhalten. Für die markierungsfreie Quantifizierungsanalyse wurden normalisierte Proteinhäufigkeiten aus drei biologischen Replikaten verwendet. Die Analyse der subzellulären Proteinlokalisierung wurde durch die Gene Ontology (GO)-Analyse von DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 und einer von der Alice Ting-Gruppe8 gesammelten und veröffentlichten Datenbank ermöglicht. Vulkangrundstücke wurden von Perseus (v1.6.15.0) erworben. Änderungen der Proteinhäufigkeitsfalte wurden mithilfe eines zweiseitigen t-Tests auf statistische Signifikanz getestet, und Proteintreffer wurden mit einer Häufigkeitsänderung >2 (sofern nicht anders angegeben) und einem p-Wert <0,05 identifiziert. Die Proteininteraktionsanalyse wurde mithilfe der GO-Analyse sowie der String-Datenbank durchgeführt.

Es wurden drei biologische Replikate mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad-Software) durchgeführt und Vulkandiagramme wurden von Perseus (v1.6.15.0) erfasst. Zum Vergleich zwischen zwei Gruppen wurden p-Werte mithilfe eines zweiseitigen Student-t-Tests ermittelt. Singleton-Proteine, die in Versuchsgruppen nur mindestens zweimal identifiziert wurden, wurden in die Vulkandiagramme einbezogen, und die entsprechenden fehlenden Werte in Kontrollgruppen wurden durch Perseus aus der Normalverteilung ersetzt, um die Berechnung des p-Werts zu ermöglichen. Fehlerbalken stellen Mittelwerte ± SD dar. Bei der Proteomikanalyse wurden die Proteinhäufigkeiten, die in mindestens zwei biologischen Replikaten vorkommen, beibehalten, um die statistische Analyse zu ermöglichen. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuteilung.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Massenspektrometriedaten wurden über das iProX57-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD034811 (PDPL-MS-Datensatz) beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken der Massenspektrometrie-Kerneinrichtung, der Bildgebungs-Kerneinrichtung und der Sequenzierungs-Kerneinrichtung im Shenzhen Bay Laboratory für ihre Unterstützung bei der Durchführung von Proben. Wir danken Dr. Yu-Hsan Tsai, Dr. Xiaoyu Li und Dr. Jeff Montgomery für hilfreiche Diskussionen und Unterstützung beim Korrekturlesen. Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit durch: Zuschuss der National Natural Science Foundation (32101200 an GL), Zuschuss des Guangdong-Shenzhen Regional Joint Fund (2020A1515110903 an GL) und Zuschuss des Shenzhen Bay Laboratory Open Fund ( SZBL2020090501008 an GL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang.

Institut für System- und Physikalische Biologie, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, 518132, China

Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang, Keren Zhang, Yuchen Huang, Jingwei Cui, Zhe Zhang, Weiye Zhong und Gang Li

Abteilung für Chemie, UF Scripps Biomedical Research, 130 Scripps Way, Jupiter, FL, 33458, USA

Yanlong Jiang

School of Life Sciences, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Hefei, Anhui, 230026, China

Zhe Zhang

Multi-Omics-Massenspektrometrie-Kern, Büro der Kerneinrichtung, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, 518132, China

Cookson KC Chiu

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Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. GL konzipierte die Studie und betreute die Forschung. YZ, XH, KZ, YH und GL haben Experimente entworfen und analysiert. YZ, XH, KZ, YH, JC, WZ und CKCC führten Experimente durch. YJ schlug den chemischen Mechanismus vor. ZZ führte die SASA-Analyse durch. YZ und GL haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Gang Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhai, Y., Huang, X., Zhang, K. et al. Raumzeitlich aufgelöstes Proteinnetzwerk-Profiling mit photoaktivierungsabhängiger Proximity-Markierung. Nat Commun 13, 4906 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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Eingegangen: 23. März 2022

Angenommen: 11. August 2022

Veröffentlicht: 20. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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