Strukturelle und mechanistische Einblicke in Pilz-β

Nature Band 616, Seiten 190–198 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die membranintegrierte Synthase FKS ist an der Biosynthese von β-1,3-Glucan beteiligt, dem Kernbestandteil der Pilzzellwand1,2. FKS ist das Ziel weit verbreiteter Antimykotika, darunter Echinocandin und Ibrexafungerp3,4. Leider bleibt der Wirkungsmechanismus von FKS rätselhaft und dies hat die Entwicklung wirksamerer Medikamente, die auf das Enzym abzielen, behindert. Hier präsentieren wir die kryoelektronenmikroskopischen Strukturen von Saccharomyces cerevisiae FKS1 und der Echinocandin-resistenten Mutante FKS1 (S643P). Diese Strukturen zeigen das aktive Zentrum des Enzyms an der Membran-Zytoplasma-Grenzfläche und einen Glucan-Translokationspfad, der die Membrandoppelschicht durchquert. In den FKS1-Strukturen werden mehrere gebundene Lipide und bemerkenswerte Membranverzerrungen beobachtet, was auf aktive FKS1-Membran-Wechselwirkungen schließen lässt. Echinocandin-resistente Mutationen sind in einer Region in der Nähe von TM5–6 und TM8 von FKS1 gehäuft. Die Struktur von FKS1(S643P) zeigt veränderte Lipidanordnungen in dieser Region, was auf einen arzneimittelresistenten Mechanismus des mutierten Enzyms schließen lässt. Die in dieser Studie enthüllten Strukturen, der katalytische Mechanismus und die molekularen Einblicke in arzneimittelresistente Mutationen von FKS1 fördern das mechanistische Verständnis der pilzlichen β-1,3-Glucan-Biosynthese und bilden eine Grundlage für die Entwicklung neuer Antimykotika, die auf FKS abzielen.

Invasive Pilzinfektionen verursachen jährlich über 1,5 Millionen Todesfälle und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar5. Solche Infektionen sind für immungeschwächte Bevölkerungsgruppen sowie für Patienten mit COVID-19 (Ref. 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html) von erheblicher Bedeutung (und verursachen beispielsweise eine hohe Sterblichkeit). ). Begrenzte Klassen von Antimykotika und aufkommende arzneimittelresistente Stämme wie der jüngste Ausbruch des multiresistenten Candida auris haben zu ernsthaften Herausforderungen bei der Behandlung infizierter Patienten geführt7,8. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer Antimykotika8.

β-1,3-Glucan ist ein grundlegender Bestandteil der Pilzzellwand2, daher ist die gezielte Biosynthese von β-1,3-Glucan eine wichtige Strategie für die Entwicklung von Breitband-Antimykotika3,9. β-1,3-Glucan der Pilzzellwand wird durch die membranintegrierte Synthase FKS10,11 synthetisiert, die durch GTPase Rho1 reguliert wird (Ref. 12,13). FKS überträgt Glukose von Spender-UDP-Glukose über β-1,3-glykosidische Bindungen auf die wachsende Glukankette und transloziert das polymerisierte β-1,3-Glukan in den extrazellulären Raum (Abb. 1a). FKS-Orthologe wurden in allen analysierten Pilzen identifiziert und sind für die Lebensfähigkeit vieler prominenter Pilzpathogene von wesentlicher Bedeutung. Bei Candida glabrata und S. cerevisiae zeigte die gleichzeitige Störung von FKS1 und FKS2 einen letalen Phänotyp14,15; FKS1 von Candida albicans und Cryptococcus neoformans sind für die Lebensfähigkeit von wesentlicher Bedeutung16,17; Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus mit einer FKS1-Deletion leidet unter schweren Wachstumsstörungen und Zelllyse18. Derzeit gibt es zwei bekannte Antimykotika auf dem Markt, die gegen FKS wirken: Echinocandin, das in der klinischen Praxis weit verbreitete Antimykotikum der ersten Wahl19, und Ibrexafungerp, ein neu zugelassenes orales Fungizidmedikament4. Weitere neuartige Wirkstoffe, die auf die FKS-Funktion abzielen (z. B. Rezafungin), befinden sich in der Spätphase klinischer Studien4. Leider stehen FKS-Mutationen in engem Zusammenhang mit Echinocandin-Resistenz und Therapieversagen, einem aufkommenden Problem bei invasiven Pilzinfektionen20,21. Zahlreiche klinisch identifizierte Echinocandin-resistente Mutationen konzentrieren sich auf drei konservierte Regionen von FKS20,22. Mutationen in einem einzelnen FKS-Allel reichen aus, um Pilzstämme gegen Echinocandin resistent zu machen23.

a, Modell der Pilzzellwand. FKS1 verwendet UDP-Glc zur Synthese von β-1,3-Glucan. Die Grafik in Panel a wurde mit BioRender (https://biorender.com) erstellt. b: In-vivo-Assay von FKS1 durch Untersuchung des Wachstums des WT-Stamms und des FKS1-KO (KO)-Stamms mit oder ohne den FKS2-Inhibitor FK506. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 3 unabhängige Experimente. c, In-vitro-Aktivität von CHAPS-gereinigtem FKS1 mit verschiedenen Effektoren: UDP-Glc, Rho1, GTPγS und Antimykotika (Caspofungin (CFN) und Micafungin (MCF)). Die Aktivität wurde durch Überwachung des generierten UDP gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 3 unabhängige Experimente. d,e, Enzymatische Verdauung des wasserunlöslichen Polymers, synthetisiert durch GDN-gereinigtes FKS1 (S643P). Es wurden spezifische Endo-1,3-β-Glucanase und Endo-1,4-β-Glucanase verwendet. Diese Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Gezeigt wird ein repräsentatives Bild der Polymeraufschluss- (d) und Hydrolyseproben in d, die zu den angegebenen Zeiten entnommen und einer Dünnschichtchromatographie-Analyse (e) unterzogen wurden. Als Standards wurden Glucose (G1), Laminaribiose (G2), Laminaritriose (G3) und Laminarihexaose (G6) verwendet (Spur M). f, Glykosylbindungsanalyse (Methylierung) des durch GDN-gereinigtes FKS1 (S643P) synthetisierten Polymers. Dargestellt ist ein Gaschromatogrammprofil der teilweise methylierten Alditolacetate, die aus den synthetisierten Polymeren stammen. Der dominante Peak (umrandet durch ein grün gestricheltes Kästchen) stellt die 1,3-Glcp-Verknüpfung dar, bestätigt durch Massenspektrometrie (Extended Data Abb. 2d). g, Schematische Darstellung der Domänenorganisation von FKS1. h, Kryo-EM-Karte von FKS1, parallel zur Membran betrachtet. Die Karte ist in vier Teile unterteilt, die in g gefärbt sind, wobei die lipidähnlichen Dichten hellgelb sind. i, Zwei orthogonale Ansichten der FKS1-Struktur in Cartoon-Darstellung. Vier Teile von FKS1 sind wie in g gefärbt. j, Intrazelluläre Ansicht der zytoplasmatischen Region mit ausgeblendeter TM-Domäne. Das zentrale β-Faltblatt der FKS1-GT-Domäne besteht wie markiert aus β3–β11. Die gestrichelten Linien zeigen ungeordnete Regionen an.

Das Fehlen einer FKS-Struktur hat unser Verständnis des katalytischen Mechanismus von FKS behindert und die Entwicklung neuer Antimykotika behindert. FKS ist ein etwa 200 kDa großes, in die Membran eingebettetes Protein mit geringen Sequenzhomologien zu anderen charakterisierten Glykosyltransferasen (GTs). FKS gehört zur GT48-Familie, für keines seiner Mitglieder sind Strukturen verfügbar. Hier berichten wir über die kryoelektronenmikroskopischen (Kryo-EM)-Strukturen von S. cerevisiae FKS1 und seiner arzneimittelresistenten Mutante FKS1 (S643P). Weitere strukturgesteuerte funktionelle Charakterisierungen ermöglichen es uns, die molekularen Grundlagen der β-1,3-Glucan-Biosynthese durch FKS1 aufzuklären und arzneimittelresistente Mutationen des Enzyms zu erklären.

Für In-vivo-Funktionsstudien kombinierten wir die genetische Deletion von FKS1 mit der pharmakologischen Manipulation von FKS2, um den tödlichen Phänotyp zu umgehen, der durch die gleichzeitige Störung von FKS1 und FKS2 in S. cerevisiae15 verursacht wurde. Der Wildtyp-Stamm (WT) zeigte mit dem FKS2-spezifischen Inhibitor FK506 (Lit. 15, 24) ein leicht verlangsamtes Wachstum (Abb. 1b). Im Gegensatz dazu zeigte der FKS1-Knockout (KO)-Stamm ohne FK506 ein deutlich verringertes Wachstum und mit FK506 eine nahezu vollständige Wachstumshemmung.

Als nächstes haben wir das endogen exprimierte S. cerevisiae FKS1 im Detergens CHAPS immungereinigt, das häufig für den FKS1-Aktivitätstest13,25 verwendet wird (siehe Methoden). Traditionell wird die FKS-Aktivität durch eine radioaktive Methode an roher Membran oder im Produkt eingeschlossenem FKS13,25,26 gemessen, und hier haben wir herausgefunden, dass die Überwachung des erzeugten UDP ein praktisches radiomarkierungsfreies System für den FKS1-Aktivitätstest darstellen kann. FKS1 allein zeigte keine offensichtliche Aktivität. Die Zugabe von gereinigtem Rho1 in der GTPγS-beladenen Form steigerte die Aktivität von FKS1 dramatisch (Abb. 1c) und bestätigte die wesentliche regulatorische Rolle von Rho1 für FKS1 (Lit. 12, 13). Die spezifische Aktivität von WT FKS1 wurde mit etwa 824 nmol min−1 mg−1 bestimmt, was mit früheren Studien vergleichbar ist10,25,27. Noch wichtiger ist, dass die Zugabe von Caspofungin oder Micafungin, zwei weit verbreiteten Antimykotika, die die β-1,3-Glucan-Synthese19 hemmen können, die FKS1-Aktivität deutlich verringerte.

Um die Rolle von FKS1 bei der β-1,3-Glucan-Synthese weiter zu bestätigen, analysierten wir das durch gereinigtes FKS1 gebildete Produkt. Zu diesem Zweck haben wir WT FKS1 und die Variante FKS1 (S643P) getestet, die eine der am häufigsten beobachteten Echinocandin-resistenten Mutationen ist28. Wir stellten die Hypothese auf, dass die letztere Variante das Synthase-Verhalten verändern könnte. Bei der Reinigung bis zur Homogenität im Detergens-GDN (Extended Data Abb. 1a – d und Supplementary Abb. 1) zeigten sowohl WT FKS1 als auch FKS1 (S643P) eine Aktivität, die durch Immundepletion verringert werden kann (Extended Data Abb. 1h – j). Wir fanden heraus, dass das GDN-gereinigte FKS1 durch Caspofungin aktiviert werden kann. Caspofungin kann die Aktivität von FKS1 (S643P) stimulieren (Extended Data Abb. 1h – j). Dies wird weiter durch die Scale-up-Produktsynthese bestätigt, bei der nur FKS1 (S643P) mit Caspofungin eine signifikante Menge an wasserunlöslichem Polymer produzierte (Extended Data Abb. 1k). Die Tatsache, dass sich das in GDN und in CHAPS gereinigte Enzym sehr unterschiedlich verhält (Extended Data Abb. 1i gegenüber Abb. 1c), legt nahe, dass die FKS1-Funktion möglicherweise empfindlich auf Membranumgebungen reagiert. Die Produktsynthese durch FKS1 (S643P) zeigt eine Donorspezifität gegenüber dem bevorzugten Liganden UDP-Glc gegenüber UDP-GlcNAc (Extended Data, Abb. 1l). Darüber hinaus kann EDTA die katalytische Aktivität des Enzyms unterstützen und Mg2+ hemmte die Aktivität deutlich (Extended Data Abb. 1m), was mit früheren Studien übereinstimmt25,29,30. Die Einführung einer K1261A-Mutation, einer Enzyminaktivierungsmutation, die aus unserer Strukturanalyse (siehe Abschnitt „Das aktive Zentrum und der katalytische Mechanismus“) entdeckt wurde, in FKS1 (S643P) inaktivierte die Produktsyntheseaktivität des hyperaktiven Enzyms vollständig (Extended Data Abb. 1h). –k). Die obigen Tests veranschaulichen die spezifische enzymatische Aktivität von FKS1.

Um die Bildung der β-1,3-glykosidischen Bindung zu bestätigen, führten wir einen Hydrolysetest des synthetisierten Polymers durch FKS1 (S643P) durch. Infolgedessen kann Endo-1,3-β-Glucanase das Polymer vollständig hydrolysieren, Endo-1,4-β-Glucanase hingegen nicht (Abb. 1d und Extended Data Abb. 2a). Eine Dünnschichtchromatographieanalyse zeigte, dass das Endo-1,3-β-Glucanase-katalysierte Hydrolysat unseres synthetisierten Polymers mit dem Hydrolysatmuster von Curdlan (dem β-1,3-Glucan-Standard) übereinstimmt (Abb. 1e und Extended Data Abb. 2b,c). Darüber hinaus zeigte die Analyse der Methylierungsglycosylbindung, dass 1,3-Glcp die dominierende Bindung im synthetisierten Polymer ist (Abb. 1f und erweiterte Daten Abb. 2d). Zusammenfassend belegen die oben genannten biochemischen und chemischen Studien eindeutig, dass es sich bei FKS1 um eine β-1,3-Glucan-Synthase handelt.

Um den Mechanismus von FKS1 besser zu verstehen, haben wir die Kryo-EM-Struktur von GDN-gereinigtem FKS1 mit einer Gesamtauflösung von 3,4 Å bestimmt (Abb. 1g, h, erweiterte Datentabelle 1 und erweiterte Daten, Abb. 3). Die Dichtekarte ermöglichte die De-novo-Erstellung eines Atommodells von FKS1, wobei die meisten Reste aufgelöst wurden (Extended Data Abb. 4). Unseres Wissens handelt es sich um die erste Struktur der membrangebundenen GTs der GT48-Familie.

Die Gesamtstruktur von FKS1 misst ungefähr 100 Å × 115 Å × 100 Å (Abb. 1i). Es enthält eine Transmembrandomäne (TM) mit 17 TM-Helices (TM1–17) und eine sperrige zytoplasmatische Einheit. Die TM-Domäne nimmt eine keilförmige Form an, wobei sich ihr schmaleres Ende (ungefähr 35 Å) auf der extrazellulären Seite befindet. FKS1 hat keine offensichtlichen extrazellulären strukturierten Domänen und mehrere verlängerte Schleifen verbinden die TM-Helices. Es gibt mehrere unstrukturierte Regionen, die im Abschnitt „Methoden“ „Modellerstellung und -verfeinerung“ ausführlich beschrieben werden.

Der zytoplasmatische Teil von FKS1 enthält eine N-terminale Domäne und eine mittlere Domäne, getrennt durch TM1–6 in der Primärsequenz (Abb. 1g). Die mittlere Domäne (Reste 712–1266) nimmt eine für GTs charakteristische GT-A-Faltung an: ein kontinuierliches zentrales β-Faltblatt aus neun Strängen (β3–β11), umgeben von mehreren α-Helices31 (Abb. 1j und erweiterte Daten Abb. 3h). . Sie wird daher als GT-Domäne bezeichnet. Die N-terminale Domäne (Reste 146–442) enthält 14 α-Helices (Helix 6–7 wird aufgrund fehlender Dichten nicht modelliert) (Extended Data Abb. 3i). Bei einer Suche mit dem Dali-Server konnten keine Strukturen gefunden werden, die dieser Domäne ähneln. Daher haben wir es als Zubehördomäne (AC) bezeichnet. Die AC-Domäne interagiert intensiv mit der GT-Domäne und verbirgt eine Gesamtschnittstellenoberfläche von 2.504 Å2. Drei Schleifen aus der GT-Domäne (Schleife, die β5 und β6 (Lβ5–β6), Lβ7–β8 und Lβ8–β9 verbindet) funktionieren wie Zangenbacken, um die AC-Domäne festzuklemmen (Abb. 1j). Das hochkonservierte R319 aus der AC-Domäne interagiert mit N1087 aus der GT-Domäne in der Domänenschnittstelle (Extended Data Abb. 3j). Es wurde zuvor gezeigt, dass die R319A-Substitution die FKS1-Funktion erheblich verringert24, was darauf hindeutet, dass die beiden zytoplasmatischen Domänen als kompakte Struktureinheit zusammenarbeiten.

Von den insgesamt 17 TM-Helices in FKS1 stellen TM1–8 den Großteil der interagierenden Schnittstelle mit der zytoplasmatischen Einheit dar (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 3i). TM1–4 bilden ein dicht gepacktes Helixbündel und berühren TM5–7 auf einer Seite (Abb. 2c). TM5–17 sind alle geneigt wie offene Blütenblätter, wenn man sie von der zytosolischen Seite aus betrachtet (Abb. 2a, c). Zwischen der geneigten TM5–17- und der GT-Domäne befindet sich eine große, dem Lösungsmittel ausgesetzte Kammer, die Teil des aktiven Zentrums des Enzyms ist (siehe unten). Die TM-Domäne weist zwei in die Membran eingebettete Taschen auf (Abb. 2a). Die Tasche auf der extrazellulären Seite entsteht, weil die membranexponierten TM9–10 und TM12 deutlich kürzer sind als typische TM-Helices. Die andere Tasche auf der zytosolischen Seite entsteht durch die Neigung der TM-Helices. Diese beiden Taschen bilden zusammen wahrscheinlich einen Weg für die Glucan-Translokation (siehe unten). Darüber hinaus sind fünf lange extrazelluläre Schleifen (EL1–5) ineinander verschlungen, um die nahe gelegenen extrazellulären Enden von TM5–17 zu stabilisieren. In diesen Schleifen befinden sich zwei konservierte Disulfidbindungen (C658–C669 auf EL1 und C1328–C1345 auf EL2) und ein potenzielles N-verknüpftes Glykan auf dem konservierten N1849 (Abb. 2a, b). Die Neigung von TM5–17 führt zu großen Abständen zwischen benachbarten Helices am zytosolischen Ende (Abb. 2c). Die dadurch entstehenden ausgedehnten Räume werden durch drei seitliche Helices (LH1–3) parallel zur Membrandoppelschicht ausgefüllt: LH1–2 füllen die große Lücke, die durch zwei Drei-Helix-Schichten (TM11, TM12 und TM16; und TM14, TM15 und TM17) entsteht ), während LH3 die Enden von LH1–2 auffüllt.

a, Vorderansicht von FKS1. Siebzehn TM-Helices (durch Zahlen gekennzeichnet) sind in Cartoon-Darstellung; Die zytoplasmatischen AC- und GT-Domänen liegen in gelben bzw. blauen Bändern vor. Die konservierten Disulfidbindungen bei EL1–2 und das N-verknüpfte Glykan am konservierten N1849 von EL5 sind markiert. Geordnete Lipide liegen in gelben Stäbchen vor. Die drei Ovale markieren die Positionen von drei Taschen, die an der Katalyse (eine grüne Tasche) und der Glucan-Translokation (zwei graue Taschen) beteiligt sind. b, Topologisches Diagramm der FKS1-TM-Domäne. Die gestrichelten Linien stellen die flexiblen Elemente dar, die in der Karte nicht sichtbar sind. c, Zytosolische Ansicht der FKS1 TM-Helices. Der Einschub zeigt die gleiche Ansicht wie in a, wobei die zytosolische Region ausgeblendet ist. Die beiden Kreise mit ungefähren Durchmessern verdeutlichen die Neigung von TM5–17, die sich zum Zytoplasma hin öffnet. d, Rückstände (dargestellt als Stäbchen), die mit dem internen Phospholipid (PL) interagieren, werden durch das ausgefüllte Kästchen in a dargestellt. e, Rückmembranansicht der mit Lipiden angereicherten Region, die durch das gestrichelte Kästchen in a umrissen ist. f–i, Vergleich der mutmaßlichen gemeinsamen Faltungen zwischen FKS1 (GT48-Familie) (f) und drei membrangebundenen Synthasen der GT2-Familie: der bakteriellen Cellulosesynthase BcsA (Protein Data Bank (PDB) ID: 4hg6) (g), die pflanzliche Cellulosesynthase CesA (PDB-ID: 6wlb) (h) und die Hyaluronan-Synthase HAS (PDB-ID: 7sp7) (i). Die überlagerten Strukturen werden separat in Cartoon-Darstellung dargestellt. Ihre entsprechenden Elemente haben das gleiche Farbschema, während Elemente aus der gemeinsamen Falte entsprechend der Beschriftung in grauer Oberfläche oder Cartoon-Darstellung vorliegen. In f zeigen die gestrichelten Linien ungeordnete Regionen an. j–m, Vergleich der TM-Anordnungen in FKS1 (j), BcsA (k), CesA (l) und HAS (m). TM-Segmente im grauen Schatten gehören zur gemeinsamen Falte. Die TM-Helices werden durch Zahlen bezeichnet. Das Sternchen markiert den vorgeschlagenen Glucan-Translokationspfad in FKS1, BcsA, CesA und HAS.

Die Auflösung der FKS1-Karte ermöglichte es uns, mehrere geordnet gebundene Lipide zu identifizieren (Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 4g, h). Ein Phospholipid am zytosolischen Membranblatt wird von TM11, TM15–16 und LH2 kontaktiert (Abb. 2d). Seine Kopfgruppe ist bereit, mit den geladenen Resten R1455 (TM11) und R1684 (TM16) in Kontakt zu treten. Seine beiden Lipid-Alkylschwänze sind mit umgebenden hydrophoben Resten bepackt: H1654, I1655 und F1658 (TM15); I1680 (TM16); und V1745 und L1746 (LH2). Neben LH1–2 scheint dieses Phospholipid auch zur Stabilisierung der geneigten Anordnung der TM-Helices beizutragen (Abb. 2a). Andere lipidähnliche Dichten wurden als 24 Lipid-Alkylketten modelliert, die überwiegend um einen Kern aus TM5–13 angeordnet sind (Abb. 2c). Von diesen wickeln sich sieben Lipide um TM5–6 (Abb. 2c) und 12 bilden zwei Schichten, die die konkave Oberfläche ausfüllen, die durch die geneigten TM-Helices entsteht (Abb. 2e). Diese wohldefinierten Lipidmoleküle sind wahrscheinlich Teil der integralen Struktur von FKS1.

Obwohl sich die Architektur von FKS1 radikal von der der membrangebundenen GTs mit bekannten Strukturen unterscheidet, stellten wir fest, dass ein Teil der FKS1-Struktur (Reste 615–1510) den Gesamttopologien von zwei Cellulosesynthasen der GT2-Familie ähnelt: Bakterien BcsA und ihren Pflanzenhomologes CesA32,33 (Abb. 2f – h). Trotz ihrer geringen Sequenzidentität (weniger als 10 %) können FKS1 und BcsA mit einem quadratischen Mittelwert der Abweichung von 4,3 Å über 308 ausgerichtete Reste überlagert werden (Extended Data Abb. 5a). Eine DALI-Suche nach homologen Strukturen identifizierte zwei weitere Strukturen, die dieser Topologie ähneln: Hyaluronan-Synthase (HAS) und Dolichylphosphat-Mannose-Transferase (PcManGT). Übereinstimmend wurde berichtet, dass HAS insgesamt eine strukturelle Ähnlichkeit mit BcsA34 aufweist (Abb. 2i, m); Es wurde vorgeschlagen, dass PcManGT eine minimale Cellulose-Synthase-ähnliche Faltung mit BcsA35 enthält. Dies impliziert weiterhin, dass diese membrangebundenen Polysaccharidsynthasen (FKS1, BcsA, CesA und HAS) möglicherweise eine Kernfalte teilen, die wir als Cellulose-Synthase-ähnliche Falte bezeichnen. Diese Faltung hat mehrere Merkmale gemeinsam: Sie besteht aus sechs TM-Helices, wobei die GT-Domäne die beiden N-terminalen Helices von den vier C-terminalen Helices trennt (Abb. 2j – m); Die Membran-Zytosol-Grenze enthält mehrere amphipathische Grenzflächenhelices (IFs) (Abb. 2f – i); In der Nähe dieser Grenze ist die TM-Helix, die der GT-Domäne folgt (FKS1 TM7, BcsA TM5, CesA TM3 und HAS TM3), verlängert und soll den Glucan-Translokationspfad 32,33,34 säumen.

Trotz der allgemeinen Ähnlichkeit dieser modularen Faltung wurden erhebliche FKS1-spezifische Merkmale entdeckt (Erweiterte Daten, Abb. 5). Die GT-Domäne gewinnt im Vergleich zu BcsA beträchtliche Erweiterungen (Extended Data Abb. 5a, b), und die topologisch entsprechenden TM-Helices zwischen FKS1 und BcsA variieren in Orientierung und Länge (Extended Data Abb. 5c). Bemerkenswertere Variationen gibt es an der Membran-Zytoplasma-Grenzfläche. BcsA, CesA und HAS weisen drei ähnliche amphipathische IFs (IF1–3)33,34,36 auf (Abb. 2g–i). In FKS1 wird das topologische Gegenstück von IF3 stattdessen zu TM-Helices (TM9–10) (Extended Data Abb. 5d, e). Obwohl IF1–2 in FKS1 erhalten bleiben, zeigen sie unterschiedliche Zustände. IF1 (d. h. Helix α33 der GT-Domäne) von FKS1 dreht sich um fast 90° und liegt zwischen TM6 und TM8 (Extended Data Abb. 5d). IF2 von BcsA entspricht den Resten 1247–1266 von FKS1, die in der Karte ungeordnet sind, obwohl sie als Helix vorhergesagt werden (Extended Data Abb. 5c). Diesem mutmaßlichen FKS1-IF2 fehlt das bei BcsA, CesA und HAS konservierte „QxxRW“-Motiv33,34,36, es könnte aber dennoch zur Katalyse beitragen, wie wir später diskutieren.

Innerhalb der Cellulose-Synthase-ähnlichen Falte enthält FKS1 eine große, dem Lösungsmittel ausgesetzte Kammer an der Grenzfläche zwischen Membran und Zytoplasma (Abb. 3a). Die Ausrichtung dieser Falte mit der von BcsA zeigt, dass die Kammer in FKS1 gut mit dem aktiven Zentrum von UDP-gebundenem BcsA überlappt, was stark darauf hinweist, dass die Kammer das aktive Zentrum von FKS1 ist (Abb. 3b). Eine DALI-Suche ergab homologe Strukturen der FKS1-GT-Domäne (Reste 718–1239): PcManGT, BcsA, GalNAc-T7, TarP, CesA und HAS. Wir haben auch das AlphaFold-Modell der Curdlan-Synthase analysiert, da es das gleiche Polymer wie FKS1 synthetisiert und eine hohe Homologie (26 % Identitäten) mit BcsA37 aufweist. Detaillierte Strukturvergleiche dieser Ziele ergaben, dass das aktive Zentrum von FKS1 besser mit membrangebundenen Enzymen wie BcsA, CesA, Curdlan-Synthase, HAS und PcManGT überlappt (Extended Data Abb. 6). Trotz der unterschiedlichen Stereochemie ihrer Produkte weist die hohe strukturelle Ähnlichkeit ihrer aktiven Zentren auf ähnliche Mechanismen bei der Substratbindung und Katalyse dieser Synthasen hin, was mit früheren Studien zu BcsA, CesA und HAS übereinstimmt33,34,36. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse überlagerten wir die Strukturen von FKS1 und BcsA, um die gemeinsamen wichtigen funktionell wichtigen Reste in ihren aktiven Zentren aufzudecken (Abb. 3c, d). Zum Beispiel zwei Paare von Resten (Y849 und E851 und K1082 und N1085 in FKS1; Y149 und E151 und K226 und N229 in BcsA) und das „ED-Motiv“ (E1221 und D1222 in FKS1; und E342 und D343 in BcsA) Dabei können die beiden Enzyme gut aufeinander abgestimmt werden. Diese Reste in BcsA sind für die Donorbindung (Y149 und E151 sowie K226 und N229 in BcsA) und für die Positionierung der allgemeinen katalytischen Base Aspartat (ED-Motiv)36 bekannt.

a: Eine abgeschnittene Oberflächendarstellung von FKS1, die das aktive Zentrum an der Membran-Zytoplasma-Grenzfläche zeigt. Es verbindet eine Membrantasche, die die Möglichkeit einer Glucan-Translokation bietet. Spezifische Strukturelemente werden in Cartoon-Darstellung dargestellt, farbig wie in Abb. 2a. Die TM-Helices werden durch Zahlen bezeichnet. Das hochkonservierte ED-Motiv (E1221 und D1222), das sich auf der Helix α35 befindet, ist wie markiert dem aktiven Zentrum zugewandt. b: Überlagerte GT-Domänen der Cellulose-Synthase-ähnlichen Falten, die UDP-gebundenes BcsA (PDB-ID: 4P00; in Grau mit UDP im magentafarbenen Stift) und FKS1 (in Orange) gemeinsam haben. c,d, Nahaufnahme der aktiven Zentren zwischen BcsA (c) und FKS1 (d), markiert durch das gestrichelte Kästchen in b. Rückstände, die an der Substratbindung oder Katalyse beteiligt sind, werden als Stäbchen bezeichnet. In c wird UDP als Magenta-Stick dargestellt. In d sind mit BcsA konservierte FKS1-Reste als gelbe Stäbchen hervorgehoben. e, In-vivo-Funktionstest von Mutationen im aktiven Zentrum in FKS1. Das Wachstum der angegebenen Stämme über 72 Stunden wurde ohne (linke Rangfolge) und mit (rechte Rangfolge) dem FKS2-spezifischen Inhibitor FK506 untersucht. Der Test wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. f, Zellwand-Glucanspiegel in Stämmen, die die angegebenen FKS1-Mutationen tragen. g, In-vitro-FKS1-Aktivitäten von WT und Mutanten des aktiven Zentrums, gereinigt mit CHAPS, mit oder ohne den FKS1-Inhibitor CFN. Die Aktivitäten wurden auf die Proteinmenge normalisiert. Für f,g sind die Daten Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 3 unabhängige Experimente.

Als nächstes validierten wir die funktionellen Rollen dieser Reste mithilfe von drei verschiedenen Tests. Zuerst führten wir ihre Mutationen in den FKS1-Chromosomenort ein und untersuchten den Wachstumsphänotyp jedes Mutantenstamms in Gegenwart von FK506 (Abb. 3e). Die Doppelmutationen von Y849A; E851A und K1082A; N1085A sowie die Einzelmutationen von E851A, K1082A und D1222A verhinderten alle das Stammwachstum im Ausmaß des FKS1-KO-Stamms (Abb. 3e). Die N1085A-Mutation verlangsamte das Wachstum und die Y849A-Mutation hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf das Wachstum. Zweitens haben wir den Gehalt an Zellwand-Glucan in diesen Stämmen gemessen, als sie ohne FK506 wuchsen. Wir fanden heraus, dass alle Mutationen, einschließlich des FKS1-KO-Stamms, mit Ausnahme der Y849A-Substitution, den Gesamtglucanspiegel im Vergleich zum WT-Stamm verringerten (Abb. 3f) und gut mit ihren Wachstumsphänotypen übereinstimmten (Abb. 3e). Zuletzt haben wir jede einzelne FKS1-Mutante (mit Ausnahme von FKS1 (D1222A)) gereinigt und ihre katalytische Aktivität in vitro verglichen (Abb. 3g und Extended Data Abb. 1g). In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen zellbasierten Phänotypen reduzierten die Mutationen E851A, K1082A und N1085A die Enzymaktivität signifikant, wohingegen die Mutation Y849A die Aktivität nur geringfügig beeinflusste. Zusammengenommen belegen die oben genannten In-vivo- und In-vitro-Analysen eindeutig die Position des aktiven Zentrums von FKS1 sowie seiner wichtigsten zusammengesetzten Reste.

Durch weitere Strukturanalysen konnten wir zusätzliche Reste identifizieren, die für die FKS1-Katalyse entscheidend sind. Es ist bekannt, dass R382 und W383 im „QxxRW“-Motiv in IF2 von BcsA wichtig für die Substratbindung und Katalyse sind36. Obwohl dieses Motiv in FKS1 fehlt, befinden sich K1261 und F1258 an den entsprechenden Positionen in FKS1, ebenso wie R382 und W383 in BcsA (Abb. 3c, d und Extended Data Abb. 5e). In mehreren membrangebundenen Synthasen, die die Cellulose-Synthase-ähnliche Faltung enthalten (BcsA, CesA und HAS), ist der positiv geladene Rest, der BcsA R382 entspricht, an der Donorbindung beteiligt, während der aromatische Rest, der BcsA W383 entspricht, die Funktion hat, den Akzeptor zu stabilisieren33, 34,36 (Erweiterte Daten Abb. 6). Tatsächlich sind sowohl F1258 als auch K1261 für die FKS1-Funktion essentiell, wie die In-vivo- und In-vitro-Analysen ihrer einzelnen Alaninmutationen zeigen (Abb. 3e – g). Die obigen Analysen legen ferner nahe, dass die zentralen katalytischen Mechanismen zwischen FKS1 und BcsA erhalten bleiben.

FKS1 und BcsA sind beide prozessive Polysaccharidsynthasen und ihr polymerisiertes Produkt, Glucane, muss durch Membranen transloziert werden1,38. Dementsprechend hat FKS1 direkt unterhalb des aktiven Zentrums eine Tasche innerhalb der Membran gebildet (Abb. 3a). Es wird von TM5–8, TM11–12 und IF1 gesäumt (Abb. 4a). TM5–8 und TM11–12 von FKS1 sind Teil des Cellulose-Synthase-ähnlichen Faltkerns und entsprechen TM3–8, das den Cellulose-Translokationspfad in BcsA36 bildet (Abb. 2j, k). Auf der dieser Tasche gegenüberliegenden extrazellulären Seite befindet sich eine weitere, dem Lösungsmittel ausgesetzte Tasche mit einer viel geringeren Detergensdichte, die direkt auf der EM-Karte sichtbar ist (Abb. 4b). Die zweite Tasche entsteht, weil die membranexponierten TM9–10 und TM12 kurz sind. Die beiden neben der Membranebene angeordneten hydrophilen Taschen führen zu einer deutlichen Membranverdünnung (Abb. 4a, b), was die Energiebarriere für die Glucan-Translokation durch die Membranen erheblich verringern könnte, wie dies für mehrere Membrantranslokasen vorgeschlagen wurde . Tatsächlich veränderten Mutationen von Resten entlang dieses Pfades in FKS1 die FKS1-Funktion (Abb. 4c, d). Beispielsweise befinden sich zwei konservierte Reste (F1297 und H1298) zwischen dem aktiven Zentrum und dem zytosolischen Eingang. Ihre Alaninsubstitutionen beeinträchtigten die FKS1-Funktion, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise an der Glucansteuerung beteiligt sind. Im Gegensatz dazu wuchsen die Mutantenstämme schneller als der WT-Stamm, wenn zwei konservierte sperrige aromatische Reste, die den extrazellulären Ausgang verschließen (F1311 und F1475), durch Alanin ersetzt wurden. Wir konnten FKS1 (F1475A) reinigen und es zeigte eine erhöhte katalytische In-vitro-Aktivität und eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber dem FKS1-Inhibitor Caspofungin (Abb. 4d), was auf eine Vergrößerung von F1475A im Glucan-Austritt schließen lässt.

a: Mutmaßlicher Glucan-Translokationsweg durch zwei Membrantaschen, wie durch die Sechseckanordnung dargestellt. Die erste Tasche (in der schattierten Innenoberflächenansicht), gesäumt von TM5–12, befindet sich unter dem aktiven Zentrum (grün gestricheltes Oval). Konservierte Rückstände, die an der Führung des Eingangs (H1298 und F1297) und der Abdichtung des Ausgangs (F1311 und F1475) beteiligt sind, sind gekennzeichnet. Auf der extrazellulären Seite bildet sich eine zweite Tasche, da die membranexponierten TM9–10 und TM12 zu kurz sind (weniger als 28 Å), um die gesamte Membran zu überspannen. b: Die ungeschärfte EM-Dichtekarte zeigt die Detergensdepression nahe dem Glucan-Translokationspfad. Dieser Weg ist durch das weiß gestrichelte Kästchen markiert, wobei die Pfeile den mutmaßlichen Ein- und Ausgang anzeigen. Die Waschmitteldichte ist in Grau dargestellt. Die geschätzte Membrandicke ist angegeben. Der Einschub zeigt die extrazelluläre Ansicht der mit der orangefarbenen Linie umrahmten Region. c, In-vivo-Funktionstest von FKS1 mit ausgewählten Mutationen rund um den Glucan-Translokationspfad. Das Wachstum der angegebenen Stämme über 48 Stunden wurde ohne (links) und mit (rechts) dem FKS2-spezifischen Inhibitor FK506 untersucht. d, In-vitro-FKS1-Aktivitäten des WT und der mit CHAPS gereinigten F1475A-Mutante, mit oder ohne den FKS1-Inhibitor CFN. Die Aktivitäten wurden auf die Proteinmenge normalisiert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 3 unabhängige Experimente. e, Struktur von FKS1(S643P) zeigt eine längliche Dichte (blaues Netz) in der ersten Membrantasche (wie in a gezeigt) für die Produkttranslokation. Diese Struktur wurde in Gegenwart von UDP-Glc bestimmt, um ein Produkt zu synthetisieren, das durch CFN verstärkt wurde. Die TM-Helices werden durch Zahlen bezeichnet. Der Einschub zeigt die vergrößerte Ansicht einer modellierten Glucankette von 4-Glucose (gelber Stab), überlagert mit der entsprechenden Dichte (blaues Netz). f, Mögliche Reste, die an der Glucan-Wechselwirkung beteiligt sind.

Als nächstes bestimmten wir die Struktur des GDN-gereinigten hyperaktiven Mutanten FKS1 (S643P) bei Inkubation mit UDP-Glc und Caspofungin mit einer Auflösung von 3,5 Å (Extended Data Abb. 7), in der Hoffnung, das Substrat- oder Produktgebundene einzufangen Zustand des Enzyms. Obwohl die Struktur von FKS1(S643P) keine großen Konformationsunterschiede zu der von WT FKS1 aufweist (quadratische Abweichung von etwa 0,7 Å), bemerkten wir darin eine verlängerte Dichte entlang des vorgeschlagenen Produkttranslokationskanals, die vermutlich einer Bindung entspricht Produkt (Abb. 4e). Wir haben eine Glucankette aus 4-Glucose in diese Dichte modelliert (Abb. 4e, Einschub). Entlang der modellierten Glucankette sind eine Reihe hydrophiler und hydrophober Reste von FKS1 angeordnet, um günstige Enzym-Produkt-Wechselwirkungen zu gewährleisten (Abb. 4f). Der Translokationskanal bleibt auf der extrazellulären Seite geschlossen, was auf die Existenz eines regulierten Kanalöffnungsmechanismus schließen lässt, wie er kürzlich für HAS34 vorgeschlagen wurde.

Wir haben zunächst unser auf S. cerevisiae basierendes Testsystem für die Analyse der Echinocandin-Resistenz evaluiert. Wir wählten zwei der am häufigsten beobachteten Mutationen in arzneimittelresistenten C. albicans (CaFKS1 F641S und S645P)28 aus und führten sie in die entsprechenden Stellen von S. cerevisiae FKS1 (ScFKS1 F639S und S643P) ein. Beide Mutantenstämme zeigten eine stark erhöhte Resistenz gegen Caspofungin (Extended Data Abb. 8a). Wir haben diese beiden mutierten ScFKS1 in CHAPS weiter gereinigt und ihre Hemmung durch Caspofungin bewertet (Abb. 5a). Das WT-ScFKS1 als Kontrolle zeigte ein typisches Hemmprofil mit einem IC50-Wert von 0,55 µM, der mit dem zuvor mit anderen Methoden ermittelten Wert vergleichbar ist23,25. Im Gegensatz dazu sind sowohl ScFKS1(F639S) als auch ScFKS1(S643P) unempfindlich gegenüber einer Hemmung durch Caspofungin.

a, CFN-Inhibitionsprofile von mit CHAPS gereinigten FKS1-Varianten, einschließlich WT-FKS1 und zwei am häufigsten beobachteten Echinocandin-resistenten Mutationen: F639S und S643P. Der Prozentsatz der Restaktivität wird angezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 3 unabhängige Experimente. b: Drei Hotspot-Regionen (rot; als HS1–3 bezeichnet) mit Echinocandin-resistenten Mutationen werden auf die FKS1-Struktur abgebildet. Die Hotspot-Regionen sind auf einem Cluster aus drei benachbarten TM-Helices lokalisiert: TM5, TM8 bzw. TM6. Die konservierte Cellulose-Synthase-ähnliche Faltung innerhalb von FKS1 ist in der Cartoon-Darstellung hervorgehoben, während der verbleibende Teil in der Band-Darstellung dargestellt ist. Diese konservierte Falte ist von geordneten Lipiden umgeben, die als gelbe Stäbchen dargestellt sind. Die gestrichelte Linie zeigt eine ungeordnete Region an. c, Nahaufnahme der Echinocandin-resistenten Mutationen, wie in b dargestellt. Eine Ibrexafungerp-resistente Mutationsstelle (A1369) außerhalb dieser Hotspot-Regionen ist ebenfalls dargestellt. Die Cα-Atome der Mutationen werden als rote Kugeln dargestellt. Die Hotspot-Regionen sind mit geordneten Lipiden angereichert, wobei ausgewählte Lipiddichten in einem grauen Netz dargestellt sind. d: Konformationsänderungen und Lipidanordnungen (angezeigt durch rote Pfeile) um die HS1-Region aufgrund der Einführung von FKS1 (S643P), der arzneimittelresistenten Mutation. Dies wird durch die Überlagerung der FKS1-Struktur (grau) und der FKS1(S643P)-Struktur (blau) veranschaulicht. Die schwarze gestrichelte Linie deutet auf eine mögliche polare Wechselwirkung hin.

Als nächstes untersuchten wir die mögliche mechanistische Grundlage der Echinocandin-Resistenz anhand der FKS1-Struktur. Entsprechend ihrer Lage wurden Echinocandin-resistente Mutationen in drei konservierte Regionen eingeteilt, die die Reste 639–647 in TM5 (Hotspot 1), 1354–1357 in TM8 (Hotspot 2) und 690–700 in TM6 (Hotspot 3) umfassen (Reste sind). nummeriert wie in ScFKS1)20,22,40 (Ergänzende Abbildung 2). Obwohl in der Primärsequenz getrennt, liegen drei Mutations-Hotspots räumlich nahe beieinander (Abb. 5b, c). In C. glabrata-Isolaten, die gegen Ibrexafungerp resistent sind, wurden neue Mutationsstellen außerhalb der FKS2-Hotspots 1 und 2 gemeldet (z. B. CgFKS2 W715L und A1390D)41; Diese Mutationsstellen entsprechen W695 im Hotspot 3 von ScFKS1 bzw. A1369 auf TM8 neben Hotspot 3 (Abb. 5c). Diese Analyse legt überlappende FKS-Bindungsstellen zwischen Echinocandin und Ibrexafungerp41 nahe. Diese arzneimittelresistenten Hotspot-Regionen scheinen eng mit der Membranumgebung verbunden zu sein. Alle Echinocandin-resistenten Mutationen von FKS1 werden in der Nähe der von TM5–6 und TM8 gebildeten konvexen hydrophoben Oberfläche kartiert und sind spezifisch von mehreren geordneten Lipidmolekülen umgeben (Abb. 2c und 5c). F639 und S643 der Hotspot-1-Region sind an der Lipidbindung beteiligt; Die Seitenkette von F639 interagiert direkt mit drei Lipidmolekülen und die S643-Seitenkette scheint die Hauptkette des mit dem Lipid interagierenden Rests Y638 zu fixieren (Abb. 5d). Darüber hinaus analysierten wir die Struktur von FKS1 (S643P) (Extended Data Abb. 7) und konzentrierten uns dabei auf Veränderungen der Lipidbindung, die durch die Mutation hervorgerufen wurden (Abb. 5d). Mehrere Hotspot-1-Reste in der Nähe der angereicherten Lipide zeigen eine veränderte Konformation; Bei Y638 ist die Seitenkette um etwa 90° gedreht, während sich die Seitenkette von F639 in die gleiche Richtung dreht. Bemerkenswerterweise führen diese Veränderungen zu Verschiebungen benachbarter gebundener Lipide, was darauf hindeutet, dass eine veränderte Lipidumgebung auf die S643P-Mutation zurückzuführen ist.

Auf der Grundlage unserer Ergebnisse schlagen wir zwei mögliche arzneimittelresistente Mechanismen für FKS1 vor. Erstens: Da es sich bei den Arzneimitteln vom Echinocandin-Typ um Lipopeptide mit unterschiedlich konfigurierten Lipidschwänzen handelt19 (Extended Data Abb. 8b, c), deutet das Häufungsmuster der Echinocandin-resistenten Mutationen auf eine mögliche Bindungsstelle für diese Arzneimittel hin, und die Bindungen können ihre Lipide betreffen Schwänze (Abb. 5b, c). Die Arzneimittelresistenz kann daher auf Veränderungen der Arzneimittelbindungsstelle zurückgeführt werden, die aus den Mutationen resultieren. Zweitens ist es angesichts der angereicherten geordneten Lipide in der Nähe arzneimittelresistenter Hotspot-Regionen und der Lipidbewegungen, die sich aus der Struktur von FKS1 (S643P) (Abb. 5c, d) ergeben, denkbar, dass die arzneimittelresistenten Mutationen die Reaktion von FKS1 auf verändern könnten Membranveränderungen durch Echinocandin. Ein solcher Mechanismus wurde für die Antibiotika Daptomycin und Polymyxine vorgeschlagen, die ebenfalls Lipopeptid-Wirkstoffe sind und membranwirksam sind42,43. Übereinstimmend wurde berichtet, dass spezifische Membranmikrodomänen mit der Synthese von β-1,3-Glucan44,45 verbunden sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Veränderungen in der Lipid-Mikroumgebung mit der Wirkung von Echinocandin auf FKS korrelieren46,47.

Unsere Arbeit enthüllt die molekulare Architektur der Pilz-Glucan-Synthase FKS1. Die Strukturen von FKS1 erweitern zusammen mit umfangreichen funktionellen Charakterisierungen unser mechanistisches Verständnis der β-1,3-Glucan-Synthese in Pilzzellwänden. Strukturbasierte Analysen von Echinocandin-resistenten Mutationen und der Struktur der S643P-Mutante legen einen plausiblen arzneimittelresistenten Mechanismus der FKS1-Mutationen nahe. Diese Erkenntnisse können auch von verschiedenen Pilzpathogenen geteilt werden, da ihre FKS-Orthologen hoch konserviert sind (Erweiterte Daten, Abb. 9 und Ergänzende Abb. 2). Die in dieser Arbeit aufgeklärten FKS1-Strukturen und der katalytische Mechanismus könnten als Rahmen für zukünftige Studien dieses wichtigen antimykotischen Wirkstoffziels sowie für das Screening und die Entwicklung neuer antimykotischer Wirkstoffe dienen.

Am C-Terminus des chromosomalen FKS1 am S. cerevisiae-Stamm BY4742 wurde mithilfe einer PCR-basierten Markierungsmethode ein 3×-Flag-Tag angebracht48. Ein Hefestamm mit der chromosomalen Mutation FKS1(S643P) wurde mithilfe der homologen Rekombinationsmethode49 erzeugt. Für die Kryo-EM-Analyse und Produktsynthese wurden FKS1 und die FKS1(S643P)-Mutante wie unten beschrieben mit dem Detergens GDN gereinigt. Die Stämme wurden 20 Stunden lang in YPD-Medium bei 30 °C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und durch French Press in Lysepuffer lysiert, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl2, ergänzt mit 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), enthielt. Das Lysat wurde 30 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 Stunde lang einer Ultrazentrifugation bei 100.000 g unterzogen. Das gesammelte Membranpellet wurde in Puffer 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin, 1,5 % (w/v) n-Dodecyl-β-d-maltopyranosid ( DDM; Anatrace), 0,15 % Cholesterylhemisuccinat-Tris-Salz (CHS; Anatrace) und Proteaseinhibitor (cOmplete Proteaseinhibitor-Cocktail; Roche) durch leichtes Rühren für 2 Stunden. Der Überstand wurde durch 0,5-stündige Zentrifugation bei 15.000 g gesammelt und auf Anti-Flag M2-Affinitätsgel (Sigma) aufgetragen. Das Gel wurde dann mit Waschpuffer gewaschen, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 0,04 % GDN (Anatrace) enthielt. Die Zielproteine ​​wurden mit Waschpuffer, ergänzt mit 150 μg ml−1 3× Flag-Peptid, eluiert. Das Eluat wurde konzentriert und mittels Größenausschlusschromatographie (Superose 6 10/300 GL-Säule, GE Healthcare) mit Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 0,04 % GDN (Anatrace) enthielt, weiter gereinigt. Die zentralen Fraktionen des monodispersen Peaks wurden gesammelt und zur Kryo-EM-Gittervorbereitung und Produktsynthese konzentriert.

Die Vektorkonstruktion von N-terminalem 6× His-SUMO-markiertem S. cerevisiae Rho1 wurde in Escherichia coli BL21(DE3) transformiert. Die Stämme wurden in LB-Medium, ergänzt mit 100 µg ml-1 Ampicillin, bei 37 °C kultiviert, bis die OD600 etwa 0,6 erreichte. Die Proteinexpression wurde mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid bei 18 °C für 20 Stunden induziert. Die gesammelten Bakterien wurden resuspendiert und durch French Press in Puffer A, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 300 mM NaCl und 2 mM MgCl2 enthielt, lysiert. Nach der Zentrifugation wurde das Protein mittels Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätschromatographie aus dem Überstand gereinigt. Bei der Dialyse in Puffer A wurde 6× His-markierte Protease Ulp1 im Verhältnis 1:200 Ulp1:Rho1 (w/w) hinzugefügt, um den 6× His-SUMO-Tag zu entfernen. Der abgespaltene 6× His-SUMO-Tag und die Protease wurden durch einen weiteren Lauf der Ni-NTA-Affinitätschromatographie entfernt, und der Durchfluss wurde gesammelt, konzentriert und einer Gelfiltrationschromatographie (Superdex 200, GE Healthcare) in Puffer unterzogen 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl2. Die zentralen Fraktionen des monodispersen Peaks bei 15,6 ml wurden gesammelt und auf 10 mg ml−1 konzentriert.

Für die Einzelpartikel-Kryo-EM-Analyse wurde ein 3-µl-Aliquot des gereinigten FKS1 in einer Konzentration von 5 mg ml-1 auf glimmentladene Quantifoil-Kohlenstoffgitter (R1,2/1,3 Au, 300 Mesh) aufgetragen. Die Gitter wurden 4 s lang bei 100 % Luftfeuchtigkeit geblottet und mit FEI Vitrobot IV in flüssigem Ethan schockgefroren. Für die UDP-Glc-inkubierte FKS1(S643P)-Probe wurde in GDN (7 mg ml−1) gereinigtes FKS1(S643P) mit UDP-Glc (0,5 mM) gemischt, ergänzt mit 0,7 mg ml−1 Rho1, 10 μM GTPγS , 200 μM Caspofungin, 0,1 % CHAPS und 0,02 % CHS. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 16 °C inkubiert, bevor die Kryo-EM-Gitter eingefroren wurden. Kryo-EM-Daten wurden mit einem FEI Titan Krios-Elektronenmikroskop gesammelt, das bei 300 kV betrieben wurde und mit einer Gatan K3 Summit-Kamera ausgestattet war, die hinter einem GIF-Quantenenergiefilter positioniert war. Die automatisierte Datenerfassung wurde mit SerialEM oder FEI EPU durchgeführt. Mikroaufnahmen wurden im hochauflösenden Zählmodus bei einer Nennvergrößerung von 130.000 × und einer physikalischen Pixelgröße von 0,92 Å pro Pixel aufgenommen. Die Defokussierungswerte lagen zwischen –1,2 μm und –3 μm. Eine Gesamtbelichtung von 1,3 s wurde in 32 Bilder dosisfraktioniert, was zu einer akkumulierten Gesamtdosis von 50 e− pro Å2 führte.

Die aufgezeichneten dosisfraktionierten Filme wurden zunächst mit MotionCor2 abgeglichen und dosisgewichtet (Ref. 50). CTFFIND4 wurde dann verwendet, um die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion für einzelne mikroskopische Aufnahmen zu bestimmen51. Mikroaufnahmen von geringer Qualität, die bei der manuellen Inspektion aufgedeckt wurden, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Nachfolgende Bildverarbeitungsschritte wurden mit RELION-3 (Lit. 52) durchgeführt.

Für den FKS1-Datensatz wurde ein Satz von 2.000 Partikeln manuell ausgewählt, um 2D-Klassenvorlagen für die referenzbasierte automatische Partikelauswahl zu generieren. Die automatische Kommissionierung ergab 2.321.905 Partikel aus 11.606 Mikroaufnahmen. Es wurden zwei Runden referenzfreier 2D-Klassifizierung durchgeführt, um Partikel mit schlechter Qualität zu entfernen, was zu einem bereinigten Satz von 1.335.014 Partikeln führte. Mit RELION wurde eine Ab-initio-Karte erstellt, die als erstes Referenzmodell für die weitere 3D-Klassifizierung diente. Nach drei Runden der 3D-Klassifizierung wurde eine 3D-Klasse mit hochauflösenden Merkmalen (267.574 Partikel) ausgewählt. Durch anschließendes Partikelpolieren, 3D-Verfeinerung und Nachbearbeitung wurde eine Karte mit einer Gesamtauflösung von 3,4 Å erstellt.

Für den FKS1(S643P)-Datensatz wurde ein Satz von etwa 2.000 Partikeln manuell ausgewählt, um 2D-Klassenvorlagen für die referenzbasierte automatische Partikelauswahl zu generieren. Die automatische Kommissionierung ergab 2.222.315 Partikel aus 9.623 Mikroaufnahmen. Es wurden zwei Runden referenzfreier 2D-Klassifizierung durchgeführt, um Partikel mit schlechter Qualität zu entfernen, was zu einem bereinigten Satz von 1.620.308 Partikeln führte. Als erstes Referenzmodell für die weitere 3D-Klassifizierung wurde das FKS1-Modell verwendet. Es wurde eine 3D-Klasse mit hochauflösenden Merkmalen (690.251 Partikel) ausgewählt. Durch anschließendes Partikelpolieren, 3D-Verfeinerung und Nachbearbeitung wurde eine Karte mit einer Gesamtauflösung von 3,6 Å erstellt. Diese Rekonstruktion ergab eine Fragmentdichte innerhalb des Produkttranslokationskanals, was auf einen gemischten Zustand mit oder ohne gebundenes Produkt hinweist. Daher führten wir eine zusätzliche Runde der fokussierten 3D-Klassifizierung ohne Neuausrichtung der Partikel durch, wobei wir eine fokussierte Maske um TM7–12 und das aktive Zentrum, das den Translokationskanal umgibt, verwendeten. Es wurde eine 3D-Klasse mit Merkmalen mit der höchsten Auflösung (176.682 Partikel) ausgewählt. Die ausgewählten Partikel wurden zur 3D-Verfeinerung mit Vollmaske und anschließender Nachbearbeitung erneut extrahiert. Dadurch wurde eine Karte mit einer Gesamtauflösung von 3,5 Å erstellt, die zum Aufbau des FKS1(S643P)-Modells verwendet wurde.

Die Gesamtauflösungen wurden auf der Grundlage des Goldstandard-Kriteriums Fourier-Shell-Korrelation 0,14353 geschätzt. Die lokale Auflösungsverteilung wurde mit ResMap54 geschätzt.

Ein grobes Ausgangsmodell von FKS1 wurde de novo mit dem Modul „map_to_model“ in PHENIX55 generiert. Es wurde durch manuelle Anpassungen und Neuaufbau mit Coot56 weiter verbessert, was durch die guten Dichten um die TM-Helices und die sperrigen Dichten um Reste wie Trp, Tyr, Phe und Arg erleichtert wurde. Die Verfeinerung des FKS1-Modells gegenüber der Kryo-EM-Karte im realen Raum wurde in PHENIX mit Sekundärstruktur- und Geometriebeschränkungen durchgeführt55. Im endgültigen FKS1-Modell gibt es mehrere unstrukturierte Regionen, darunter 145 N-terminale Reste, 16 C-terminale Reste und sechs flexible Segmente der zytoplasmatischen Domäne (Reste 244–278, 475–487, 798–805, 897–931, 1159). –1167 und 1247–1266) und vier Schleifensegmente zur Verbindung von TM-Helices (Reste 1419–1435, 1516–1554, 1627–1637 und 1698–1723). Das Modell FKS1 (S643P) wurde auf Basis des Modells FKS1 gebaut. MOLPROBITY wurde zur Bewertung des endgültigen Modells57 verwendet. Die Fourier-Shell-Korrelation zwischen dem Modell und der Karte wurde von PHENIX.mtriage58 berechnet. Die Suche nach homologen Strukturen wurde mit dem DALI-Server59 durchgeführt. Für den Strukturvergleich mit FKS1 wurde die AlphaFold-modellierte Struktur der Curdlan-Synthase verwendet60,61. Die abgebildeten Figuren wurden mit PyMOL (Schrödinger, LLC), Chimera und ChimeraX62,63 erstellt. Statistiken der 3D-Rekonstruktionen und Modellverfeinerungen sind in der erweiterten Datentabelle 1 aufgeführt.

Hefestämme mit FKS1-Chromosomenmutationen und der FKS1-KO-Stamm wurden mithilfe der homologen Rekombinationsmethode erzeugt49. Die Mutanten wurden auf SD-His (Yeast Synthetic Drop-out Medium without Histidin, Kat.-Nr. S0020, Solarbio) selektiert und durch genomische PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt. Für die Analyse des Wachstumsphänotyps wurde der Spot-Wachstumstest mutierter Stämme von einer zuvor beschriebenen Methode übernommen24. Die Stämme wurden in YPD-Medium bei 30 °C und 200 U/min bis zur Exponentialphase kultiviert, bis die OD600 0,8 betrug. Die Zellen wurden auf eine OD600 von 0,1 verdünnt. Dann wurden 5-μl-Portionen zehnfacher Verdünnungen der angegebenen Stämme auf SD-His mit oder ohne FK506 (1 μg ml−1) getupft. Nach der Inkubation bei 30 °C für die angegebene Zeit wurden die Platten mit dem 5200CE Image System (TANON) fotografiert. Jeder Test wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um das Zellwachstum zu profilieren, wurden der WT-Stamm und der FKS1-KO-Stamm in YPD-Medium bei 30 °C über Nacht bis zur exponentiellen Phase gezüchtet. Anschließend wurden kultivierte Zellen in das frische YPD-Medium mit einer anfänglichen OD600 von 0,01 geimpft, das mit oder ohne 1 μg ml−1 FK506 ergänzt wurde. Die neuen Kulturen wurden dann bei 30 °C bis zur stationären Phase gezüchtet. Während der Kultivierung wurden die optischen Dichten (OD600) 48 Stunden lang im Abstand von 8 Stunden gemessen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um die Zellwachstumskurven zu erstellen.

Die Hefestämme, die verschiedene FKS1-Varianten mit dem C-terminalen 3×-Flag-Tag tragen, wurden wie oben beschrieben erzeugt, kultiviert und lysiert. Die gesammelte Membran wurde in Puffer gelöst, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 33 % Glycerin, 0,5 % CHAPS (Anatrace), 0,1 % CHS (Anatrace), 4 µM GTPγS und Proteaseinhibitor (cOmplete Protease Inhibitor Cocktail, Roche). FKS1 und seine Varianten wurden unter Verwendung eines Anti-Flag-M2-Affinitätsgels (Sigma) gereinigt und in Puffer eluiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 33 % Glycerin, 0,2 % CHAPS und 0,04 % CHS, ergänzt mit 150 μg, enthielt ml−1 3× Flag-Peptid. Die in Detergens-CHAPs oder GDN gereinigten Proteine ​​wurden mithilfe des UDP-Glo-Glycosyltransferase-Assay-Kits (Promega) untersucht, um das freigesetzte UDP zu überwachen. Von den FKS-Varianten wurden 2,5 µl zu insgesamt 30 µl Reaktionsgemisch hinzugefügt, das 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 33 % Glycerin, 1 mM EDTA, 6 µg ml-1 Rho1, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 4 µM GTPγS enthielt und 20 mM Kaliumfluorid (KF). Die Reaktion wurde durch Zugabe von UDP-Glc bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM gestartet. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 30 °C durchgeführt. Die Lumineszenz wurde mit einem Pherastar FS-System (BMG Labtech) aufgezeichnet. Die endgültige Aktivität wurde auf die FKS1-Menge normalisiert, die durch Immunblotting gegen das 3× Flag-Tag unter Verwendung des monoklonalen DYKDDDDK-Tag-Antikörpers (1:1.000-Verdünnung; Kat.-Nr. 66008-3-Ig, Klon-Nr. 2B3C4, Proteintech) gemessen wurde. Im Fall der Inhibitorprofilierung wurden Reihenverdünnungen von Echinocandin-Arzneimitteln zunächst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit FKS1-Varianten inkubiert, bevor andere Komponenten zur Reaktion hinzugefügt wurden.

Für die In-vitro-β-1,3-Glucan-Synthese wurden das in Detergens-GDN (FKS1 oder die FKS1(S643P)-Mutante; 0,02 mg ml−1) gereinigte Enzym und Donor-UDP-Glc (2,5 mM) in Reaktionspuffer (50) gemischt mM Tris-HCl pH 7,4, 33 % Glycerin, 1 mM EDTA, 6 μg ml−1 Rho1, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 4 μM GTPγS und 20 mM KF), in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 μM Caspofungin. Das Reaktionsvolumen wurde auf 100 μl (für Anilinblau-Färbung) oder 10 ml (für Produktanreicherung und anschließenden enzymatischen Abbau und Glykosylbindungsanalyse) eingestellt. Die Reaktion wurde für den angegebenen Zeitraum bei 30 °C durchgeführt.

Für die Anfärbung der synthetisierten Produkte mit Anilinblau wurde ein 100-μl-Aliquot der Reaktanten oder 0,1 % (Gew./Vol.) S. cerevisiae-β-Glucan (Sigma) entnommen und dem gleichen Volumen Anilinblau (0,03 %; Sigma) zugesetzt ). Zur vollständigen Farbstoffbindung wurde die Mischung 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde jede Probe in eine Kapillare geladen und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 433 nm beobachtet. Jeder Test wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Das in vitro synthetisierte Polymer ist wasserunlöslich und wurde durch Zentrifugation gesammelt. Es wurde zweimal mit Puffer gewaschen: 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 33 % Glycerin, 1 mM EDTA, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 20 mM KF und zweimal mit entionisiertem Wasser. Für die Abbauanalyse des synthetisierten Polymers wurden zwei Enzyme verwendet: Endo-β-1,3-Glucanase (Trichoderma sp.; Produktcode: E-LAMSE, Megazyme) oder Endo-β-1,4-Glucanase (Aspergillus niger; Produktcode: E-CELAN, Megazyme). Diese beiden Enzyme wurden zunächst in den Puffer (100 mM NaAc pH 4,5) dialysiert. Dann wurden 0,5 U jedes Enzyms zu 50 µl 1 % (w/v) des synthetisierten Polymers in 200 mM NaAc (pH 4,5) gegeben. Der Abbau von Standardkontrollzellulose (C6288, Sigma) oder Curdlan (C7821, Sigma) wurde ebenfalls unter den gleichen Bedingungen durchgeführt64,65. Die Gemische wurden bei 40 °C inkubiert, und in verschiedenen Zeitabständen wurden Proben entnommen und zur Beendigung der Reaktion 5 Minuten lang gekocht. Die enzymatischen Abbauprodukte wurden anschließend dünnschichtchromatographisch analysiert. Kurz gesagt, ein 2-µl-Aliquot der entnommenen Proben wurde auf eine Kieselgelplatte (Merck Kieselgel 60 F254) getüpfelt und in einem Lösungsmittelsystem entwickelt, das n-Butanol:Essigsäure:Wasser (2:1:1 v/v/ v). Die Platten wurden durch Eintauchen in Methanol:Schwefelsäure (95:5 v/v) und anschließendes Erhitzen auf 95 °C sichtbar gemacht. Als Dünnschichtchromatographiestandards wurde eine Mischung aus Glucose (G5767, Sigma), Laminaribiose (O-LAM2, Megazyme), Laminaritriose (O-LAM3, Megazyme) und Laminarihexaose (O-LAM6, Megazyme) verwendet.

Während des enzymatischen Aufschlusses des synthetisierten Polymers wurden die freigesetzten reduzierenden Zucker mithilfe der DNS-Reagenzien (Micro Reducing Sugar Assay Kit, Abbkine) gemessen. Kurz gesagt, 175 μl der verdünnten Hydrolyseprobe wurden mit 125 μl DNS-Reagenz gemischt. Für die Erstellung der Standardkurve wurde Standard aus dem Kit im Konzentrationsbereich von 0,2–0,6 mg ml−1 verwendet. Die Reaktionsmischungen wurden 5 Minuten lang in einem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur in einem Wasser-Eis-Bad wurde die Absorption einer 0,2 ml Probe bei 540 nm gemessen.

Das durch FKS1 in vitro synthetisierte Polymer wurde zweimal mit Puffer gewaschen: 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 33 % Glycerin, 1 mM EDTA, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 20 mM KF und zweimal mit entionisiertem Wasser. Die gewaschene Probe wurde dann in entionisiertem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Die Methylierungsanalyse wurde im Anschluss an eine frühere Studie66 durchgeführt. Die getrocknete Probe (ungefähr 1 mg) wurde in DMSO (500 μl) gelöst. Die Methylierung wurde in DMSO/NaOH mit Iodmethan für 1 Stunde durchgeführt. Die methylierten Produkte wurden mit 2 M Trifluoressigsäure 90 Minuten lang bei 121 °C hydrolysiert, mit NaBD4 reduziert und mit Essigsäureanhydrid 2,5 Stunden lang bei 100 °C acetyliert. Die resultierenden teilweise methylierten Alditolacetate wurden mit dem GC-MS-System (6890A-5975C, Agilent Technology) analysiert, das mit einer Agilent BPX70-Chromatographiesäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm; SGE) ausgestattet war. Das Temperaturprogramm wurde wie folgt eingestellt: 140 °C für 2 Minuten, 140–230 °C mit 3 °C pro Minute und 230 °C für 3 Minuten.

Die Konzentrationen von β-1,3-Glucan wurden mit dem Anilinblau-Assay bestimmt, wie zuvor beschrieben23,26,67,68,69,70,71,72. Die Teststämme wurden in YPD-Medien bis zur exponentiellen Phase gezüchtet, bis die OD600 0,5 betrug. Für jeden Stamm wurde die gleiche Menge an Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden zweimal mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA) gewaschen. Die pelletierten Zellen wurden mit 0,5 ml TE-Puffer suspendiert und mit 0,1 ml 6 M NaOH gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang in einem 80 °C warmen Wasserbad inkubiert, um das Glucan zu solubilisieren. Anschließend wurden jeder Probe 2,1 ml Anilinblau (0,03 % Anilinblau, 0,18 M HCl und 0,49 M Glycin-NaOH, pH 9,5) zugesetzt. Die Proben wurden kurz gevortext und 30 Minuten bei 50 °C und weitere 30 Minuten bei 24 °C inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (CLARIOstar Plus, BMG Labtech) bei einer Anregungswellenlänge von 400 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm mit einem Cut-off von 455 nm quantifiziert. Alle Proben wurden dreifach gemessen.

Die Proteinproben wurden durch SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit Coomassie angefärbt. Das Gelband wurde manuell herausgeschnitten und entfärbt. Die Proteine ​​wurden mit DTT reduziert, mit IAA alkyliert und mit Trypsin in Proteomikqualität in 20 mM Ammoniumbicarbonat verdaut73. Der Aufschluss wurde über Nacht bei 37 °C durchgeführt und durch Zugabe von 2 % Ameisensäure gestoppt. Die Peptide im Gel wurden mit einer Lösung extrahiert, die 2 % Ameisensäure und 67 % Acetonitril enthielt. Die Peptide wurden vakuumgetrocknet, in 0,1 % Ameisensäure resuspendiert, auf die Trap-Säule nanoViper C18 (3 μm, 100 Å) geladen und auf einer analytischen Säule (Acclaim PepMap RSLC, 75 μm × 25 cm; C18 2 μm, 100) aufgetrennt Å) unter Verwendung des EASY nLC 1200 HPLC-Systems (Thermo Fisher). Der Elutionsgradient betrug 5–38 % Puffer A (0,1 % Ameisensäure und 80 % Acetonitril) über 30 Minuten. Die massenspektrometrische Analyse wurde mit einem Q Exactive-Massenspektrometer (Thermo Fisher) durchgeführt. Die resultierenden Daten wurden mit ProteoWizard in eine mgf-Datei konvertiert und mithilfe der Mascot-Suchmaschine zur Proteinidentifizierung anhand einer UniProt-Saccharomyces-cerevisiae-Datenbank mit einer Falscherkennungsrate von weniger als 1 % analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

EM-Dichtekarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangscodes EMD-33154 (FKS1) und EMD-34115 (FKS1(S643P)) hinterlegt. Die Koordinaten sind im PDB unter den Zugangscodes 7XE4 (FKS1) und 7YUY (FKS1(S643P)) hinterlegt. Diese Studie analysierte mehrere Proteinstrukturen, die im PDB unter den Zugangscodes 4HG6, 6WLB, 7SP7, 6YV8, 6iwr, 6h4m und 1qgq öffentlich verfügbar sind.

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Wir danken allen Mitarbeitern des Cryo-EM Center der Southern University of Science and Technology für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung; und J. Zhao für Ratschläge zur Dünnschichtchromatographie. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (92053112 und 31971148 an HY, 32100575 an Min Zhang und 82188101 an Mingjie Zhang), dem ShenZhen Talent Program KQTD20210811090115021 (an Mingjie Zhang und XL) und den Fundamental Research Funds für die Zentraluniversitäten unterstützt (5003510056 an HY und 5003510112 an Min Zhang) und Programm des HUST Academic Frontier Youth Team (2018QYTD02 bis HY).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xinlin Hu, Ping Yang

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China

Xinlin Hu, Ping Yang, Changdong Chai, Jia Liu, Huanhuan Sun, Yanan Wu, Min Zhang und Hongjun Yu

Abteilung für Pathogenbiologie, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China

Xinlin Hu, Jia Liu und Min Zhang

School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, China

Mingjie Zhang & Xiaotian Liu

Greater Bay Biomedical Innocenter, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, China

Mingjie Zhang

Forschungszentrum für Zellarchitektur, Huazhong Universität für Wissenschaft und Technologie, Wuhan, China

Hongjun Yu

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XH, PY, Min Zhang, XL und HY bereiteten die Probe vor, sammelten die Daten und lösten die Strukturen. XH, PY und Min Zhang führten die funktionalen Experimente durch, unterstützt von CC, JL, HS und YW. Mingjie Zhang, Min Zhang, XL und HY entwarfen die Experimente, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Min Zhang, Xiaotian Liu oder Hongjun Yu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Vincent Bulone und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Elutionsprofil der Gelfiltrationschromatographie (Superose 6-Erhöhung 10/300 GL) von FKS1, gereinigt in Detergens-GDN. Das grün gestrichelte Kästchen markiert die für die KryoEM-Analyse gepoolten Fraktionen. b, SDS-PAGE- (links) und Western-Blot-Analyse (rechts) der Fraktionen des monodispersen Elutionspeaks in (a). Dargestellt sind repräsentative Gel- und Western-Blot-Bilder von 3 Replikaten. c, Elutionsprofil der Gelfiltrationschromatographie (Superose 6-Erhöhung 10/300 GL) von FKS1 S643, gereinigt in Detergens-GDN. Das grüne gestrichelte Kästchen markiert die Fraktionen, die für die KryoEM-Analyse und Produktsynthese gepoolt wurden. d, SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen des monodispersen Elutionspeaks in (c). Dargestellt ist ein repräsentatives Gel aus drei Replikaten. e, Elutionsprofil der Gelfiltrationschromatographie (Superdex 200, Erhöhung 10/300 GL) von Rho1. Das grüne gestrichelte Kästchen markiert die Fraktionen, die für den Aktivitätstest und die Produktsynthese gepoolt wurden. f, SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen des monodispersen Elutionspeaks in (e). Zwei Peaks in (e) zeigen ein ähnliches Dreibandenmuster (f), und alle drei Banden wurden durch Massenspektrometeranalyse als Rho1 identifiziert. Dargestellt ist ein repräsentatives Gel aus drei Replikaten. g, Western-Blot-Analysen von Wildtyp-FKS1 und verschiedenen FKS1-Varianten, gereinigt in Detergens-CHAPs. Es wird ein repräsentatives Bild von drei Replikaten angezeigt. h, SDS-PAGE-Analyse von GDN-gereinigten, mit Flaggen markierten FKS1-Varianten, die für die Tests auf Aktivität (ij) und Produktsynthese (k) verwendet wurden. Erste Spur, FKS1 WT; zweite Spur, FKS1 S643P (der Echinocandin-resistente Mutant); dritte Spur, gereinigtes FKS1 S643P ist durch Anti-Flag-Kügelchen immungeschwächt; vierte Spur, FKS1 S643P/K1261A. Dargestellt ist ein repräsentatives Gel aus drei Replikaten. Für (b, d, f, g, h) sind ihre vollständigen Scans in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. i, In-vitro-Aktivität von in GDN gereinigten FKS1-Varianten. Die Aktivität wurde durch Überwachung des erzeugten UDP getestet (1-stündige Reaktion). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 3 unabhängige Experimente. j–k, In-vitro-Produktsynthesetest durch in GDN gereinigte FKS1-Varianten. Der Assay wurde entweder durch Anfärben der synthetisierten Produkte mit dem Farbstoff Anilinblau (j; 12-stündige Reaktion) oder durch Visualisierung der synthetisierten Produkte (k; 48-stündige Reaktion) durchgeführt. Diese Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. l, Donorspezifität der Produktsynthese durch GDN-gereinigtes FKS1 S643P. Wasserunlösliche Polymere (durch weißen Pfeil gekennzeichnet) treten nur in Gegenwart von UDP-Glc anstelle von UDP-GlcNAc auf. Dieses Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. m, Die Auswirkungen von Mg2+ auf die katalytische Aktivität von GDN-gereinigtem FKS1 S643P. Die Aktivität wurde in Gegenwart von 1 mM EDTA oder 200 μM Mg2+ getestet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 3 unabhängige Experimente. Einschub: Produktsynthese in Gegenwart von 1 mM EDTA oder 200 μM Mg2+. Dieses Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

a, Quantifizierung der freigesetzten reduzierenden Zucker während der enzymatischen Verdauung des wasserunlöslichen Polymers, das durch GDN-gereinigtes FKS1 S643P synthetisiert wurde. Es wurden zwei spezifische Glucanasen verwendet: spezifische Endo-1,3-β-Glucanase und Endo-1,4-β-Glucanase. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 3 unabhängige Experimente. b–c, Die Hydrolysespezifität von Endo-1,3-β-Glucanase und Endo-1,4-β-Glucanase wurde gegen Standardpolysaccharid β-1,3-Glucan Curdlan (b) und Cellulose (c) getestet. Als Standards wurde eine Mischung aus Glucose (G1), Laminaribiose (G2), Laminaritriose (G3) und Laminarihexaose (G6) verwendet (Spur M). d: Das Massenspektrum des GC-Peaks (11,64 min) in (Abb. 1f) zeigt die Identität dieses PMAA als 1,3,5-Tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methylglucitol und bestätigt dies 1,3-Glcp-Verknüpfung.

a, Eine repräsentative Kryo-EM-Aufnahme von FKS1 aus 11606 gesammelten Aufnahmen. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c, Flussdiagramm der Kryo-EM-Datenerfassung und Datenverarbeitung von FKS1. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Methoden. d, Die Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) der rekonstruierten Karte. e, Die FSC-Kurve zwischen Modell und Karte, die von PHENIX.mtriage58 berechnet wird. f, Schnittansichten der Winkelverteilung aller in der endgültigen 3D-Rekonstruktion verwendeten Partikel. g: Lokale Auflösungsverteilung der endgültigen Kryo-EM-Karte von FKS1, berechnet mit ResMap54. h, Topologisches Diagramm der FKS1-GT-Domäne. Flexible Segmente, die in der 3D-Rekonstruktion nicht sichtbar sind, werden durch gestrichelte Linien dargestellt. i, Interaktionen zwischen AC- und GT-Domäne. Markiert sind zentrale β-Stränge und die Strukturelemente, die an der ausgedehnten Kontaktschnittstelle beteiligt sind: α2-5, α8-11, Schleifen Lα9-α10 und Lα11-α12 der AC-Domäne; α31, α34-35, Schleifen Lβ5-β6, Lβ7-β8; Lβ8-β9 der GT-Domäne). Der FKS1 R319, ein zuvor identifizierter essentieller Rest für FKS124, ist durch sein Cα-Atom als Kugel markiert und in diese Schnittstelle eingebettet. j, vergrößert im Blick auf den umrahmten Bereich in (i), zeigt die Interaktion zwischen R319 und N1087 zur Aufrechterhaltung der Schnittstelle zwischen AC- und GT-Domäne.

a, Kryo-EM-Dichten von TM1-8, 11–17. bc, Kryo-EM-Dichten des kontinuierlichen zentralen β-Faltblatts von 9 Strängen in der FKS1-GT-Domäne. d, Kryo-EM-Dichte des N-Glykans auf N1849. e, Kryo-EM-Dichten des aktiven Zentrums. f, Schnittansicht der Kryo-EM-Dichten in der Nähe von TM9 und TM10. Die Karte ist segmentiert und eingefärbt wie in Abb. 2a. Die den TM-Helices TM7-12, TM14-16 entsprechenden Dichten werden durch Zahlen bezeichnet. Auf dieser Karte kann nur die Hauptkette TM9-10 verfolgt werden, obwohl sie schwächere Dichten als andere TM-Helices aufweisen. g–h, Zwei Ansichten des FKS1-Modells mit gebundenen Lipiden. Das FKS1-Modell ist wie in Abb. 1h gefärbt und geordnete Lipide werden als gelbe Kugeln dargestellt. Die Kryo-EM-Dichten der Lipide sind in den gestrichelten Kästen dargestellt. Die Position und die Dichte des in der Transmembrandomäne eingebetteten Phospholipids sind im durchgezogenen Kasten dargestellt.

a: Die konservierte Faltung von FKS1 (Reste 615–1510) wurde mit der von BcsA (PDB-ID: 4P00; Reste 63–584) überlagert, mit einem RMSD-Wert von 4,3 Å über 308 ausgerichtete Reste. BcsA ist grau gefärbt. Der FKS1-Kern ist orange gefärbt, während FKS1-exklusive Elemente in seiner GT-Domäne farbcodiert angezeigt werden, wie in (a) und (b) gekennzeichnet. Entsprechende TM-Helices werden als Markierungen bezeichnet, während TM9 und TM10 ausschließlich für FKS1 gelten. b, Nahaufnahme der überlagerten GT-Domänen in (a). Das zentrale β-Faltblatt der GT-Domäne wird in FKS1 erweitert. Die verlängerten Stände β6 und β7 in FKS1 und die verlängerte Schleife Lβ8-β9 tragen zu einem wesentlichen Teil der interagierenden Schnittstelle mit der AC-Domäne in FKS1 bei (Abb. 1j). Darüber hinaus werden zwei FKS1-spezifische Unterregionen an zwei Seiten von β3, dem ersten Strang des zentralen β-Faltblatts, eingefügt. Die Unterregion vor β3 (Reste 719–840) enthält sechs Helices und ein Paar antiparalleler β-Stränge (β1, β2); Die auf β3 folgende Unterregion (Reste 848–998) ist α-helikal und besteht aus 9 Helices. Diese beiden Unterregionen interagieren, um das zentrale β-Faltblatt von einer Seite zu packen. c, Rückansicht der übereinanderliegenden Transmembrandomänen. d, Nahaufnahme der übereinanderliegenden Membran-Zytosol-Grenzflächen. Die Grenzflächenhelix IF1 bleibt in FKS1 erhalten, was im Vergleich zu BcsA eine dramatische Neuordnung zeigt. Die Grenzflächenhelix IF2, die ein Beta-Faltblatt und eine Transmembrandomäne verbindet, bleibt in FKS1 erhalten, weist jedoch eine ungeordnete Struktur auf, was auch in (c) angegeben ist. Die Schnittstellenhelix IF3 fehlt in FKS1 und wird in FKS1 durch die Transmembranhelices TM9 und TM10 ersetzt. e, Strukturbasiertes Sequenz-Alignment der konservierten Cellulose-Synthase-ähnlichen Falten zwischen FKS1 und BcsA. Die Ausrichtung wurde zunächst mit PROMALS3D generiert und dann mit dem ESPript3-Server veranschaulicht. Rückstände und Motive mit wichtigen Funktionen werden beschriftet. Über und unter der Ausrichtung sind sekundäre Strukturelemente dargestellt, die von der FKS1-Struktur (blaues Symbol) bzw. der BcsA-Struktur (PDB-ID: 4P00) (oranges Symbol) abgeleitet sind. Die Symbole sind TM-Helices (gefüllter Balken), Helices (leerer Balken) und β-Stränge (Pfeil).

Die analysierten katalytischen GT-Domänen werden überlagert und separat als Cartoon dargestellt. Rückstände, die an der Substratbindung oder Katalyse beteiligt sind, werden als Stäbchen bezeichnet. Das gebundene Nukleotid wird als dünne magentafarbene Stäbchen dargestellt. Die konservierten Reste werden gelb hervorgehoben, wenn das aktive Zentrum der bakteriellen Cellulosesynthase BcsA (a) als Referenz verwendet wird. a–f, Überlagerung katalytischer GT-Domänen membrangebundener Glykosyltransferasen: bakterielle Cellulosesynthase BcsA (a; PDB-ID: 4hg6), β-1,3-Glucan-Synthase FKS1 (b), pflanzliche Cellulosesynthase CesA (c; PDB-ID : 6wlb), Virus-Hyaluronansynthase (d; PDB-ID: 7sp7), Agrobacterium-Curdlan-Synthase (e; Modell aus der AlphaFold-Datenbank; Uniprot-ID: Q9X2V0), archaeale Mannosyltransferase PcManGT (f; PDB-ID: 6YV8). Bei den durch das blaue Kästchen (a–e) umrandeten Feldern handelt es sich um membrangebundene Polysaccharidsynthasen, die eine Cellulose-Synthase-ähnliche Faltung enthalten, wie in Abb. 2f–m dargestellt. PcManGT (Panel f) enthält einen halben Membrantunnel von BcsA, und es wurde vorgeschlagen, dass es eine minimale Cellulose-Synthase-ähnliche Falte aufweist35. g–i, Überlagerung katalytischer GT-Domänen löslicher Glykosyltransferasen: menschliches GalNAc-T7 (g; PDB-ID: 6iwr), S. aureus TarP (h; PDB-ID: 6h4m), B. subtilis SpsA (i; PDB-ID: 1qgq ).

a, Eine repräsentative Kryo-EM-Aufnahme von FKS1 S643P aus 9623 gesammelten Aufnahmen. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c, Flussdiagramm der Kryo-EM-Datenerfassung und Datenverarbeitung von FKS1 S643P. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Methoden. d, Die Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) der rekonstruierten Karte. e, Die FSC-Kurve zwischen Modell und Karte, die von PHENIX.mtriage58 berechnet wird. f, Schnittansichten der Winkelverteilung aller in der endgültigen 3D-Rekonstruktion verwendeten Partikel. g: Lokale Auflösungsverteilung der endgültigen Kryo-EM-Karte von FKS1 S643P, berechnet mit ResMap. h, Anpassung der Kryo-EM-Karte mit dem FKS1 S643P-Modell in Beispielregionen.

a, Analyse des Caspofungin-resistenten Phänotyps des S. cerevisiae-Stammes mit den angegebenen FKS1-Mutationen. Die getesteten Caspofungin-Konzentrationen sind oben angegeben. b, Chemische Struktur von vier Arten von Echinocandin-Arzneimitteln. Sie alle weisen einen Lipidschwanz auf, wie in der Box hervorgehoben. c, Chemische Struktur der Lipid-Alkylketten (linkes Feld) und Phospholipid (rechtes Feld), identifiziert aus der FKS1-Struktur.

a–c, die FKS1-Struktur ist entsprechend dem Grad der Sequenzkonservierung gefärbt (rot, hoch; blau, niedrig). a–b, Rück- und Vorderansicht parallel zur Membran, in Cartoon-Darstellung. c, Die gleiche Ansicht wie (b) mit Oberflächendarstellung.

Diese Datei enthält die nicht zugeschnittenen Blots (ergänzende Abbildung 1) und das Mehrfachsequenz-Alignment von FKS-Orthologen verschiedener pathogener Pilze und Saccharomyces cerevisiae (ergänzende Abbildung 2).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hu, X., Yang, P., Chai, C. et al. Strukturelle und mechanistische Einblicke in die pilzliche β-1,3-Glucan-Synthase FKS1. Natur 616, 190–198 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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Eingegangen: 29. März 2022

Angenommen: 16. Februar 2023

Veröffentlicht: 22. März 2023

Ausgabedatum: 06. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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